檸檬桉果實(shí)中皂苷的提純及抗氧化活性

暴瑋，屈戀，馬麗，賴芳，李偉光，劉雄民*

(1.桂林理工大學(xué) 南寧分校，廣西 南寧 530001； 2.廣西大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，廣西 南寧 530004)

0 引言

檸檬桉(Eucalyptuscitriodira)被引進(jìn)中國(guó)已有70多年的歷史，是桉樹(shù)大家族中的佼佼者。喜溫暖氣候，有較強(qiáng)的耐旱力，現(xiàn)多種植于廣東、福建、廣西、四川等地。檸檬桉可謂全身是寶：檸檬桉的樹(shù)干主要應(yīng)用于工礦、建筑、交通、造紙等方面；檸檬桉邊材富含淀粉，其枝丫可用于培養(yǎng)白木耳；檸檬桉葉可用來(lái)提煉香油、香料及用作藥材。檸檬桉一年兩次開(kāi)花，花期甚長(zhǎng)，是重要的蜜源樹(shù)種。目前，檸檬桉的果實(shí)也成為研究的熱點(diǎn)之一，其果實(shí)提取得到的單寧、黃桐在醫(yī)藥方面具有較好的消炎解毒、抑菌殺菌作用[1-2]。

皂苷(saponin)又名皂素，一般分為三萜類皂苷和甾體皂苷，廣泛存在于植物莖、葉和根中，植物中皂苷的提取方法有醇浸提法、回流法等，其純化方法主要分為萃取法、沉淀法和大孔吸附樹(shù)脂吸附法等[3-4]。皂苷是一種具有較好的抗炎、抗癌、抗血栓、抗氧化、抗腫瘤和抑制細(xì)胞凋亡等生物活性的天然化合物[5-7]。在抗氧化活性方面，植物皂苷主要是通過(guò)對(duì)自由基的清除作用來(lái)達(dá)到保護(hù)肝臟的作用。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于檸檬桉的果實(shí)研究較少，對(duì)果實(shí)中皂苷的提取及生物活性研究更是鮮見(jiàn)報(bào)道，為提高檸檬桉的綜合利用率，筆者選擇檸檬桉的果實(shí)進(jìn)行皂苷的提取純化并進(jìn)行抗氧化活性的研究。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 實(shí)驗(yàn)原材料

檸檬桉果實(shí)：采自廣西南寧市廣西大學(xué)校園內(nèi)。

新鮮果實(shí)采集后，經(jīng)60 ℃烘干，人工粉碎后經(jīng)40目尼龍篩后密封保存。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器

紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(UV-2550型，生產(chǎn)于日本Shimadzu公司)；恒溫水浴振蕩器(SHA-BA型，生產(chǎn)于金壇市易晨?jī)x器制造有限公司)；離心機(jī)(TDZ5-WS型，生產(chǎn)于長(zhǎng)沙高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)區(qū)湘儀離心機(jī)有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-52AA型，生產(chǎn)于上海利聞科學(xué)儀器有限公司)；電子天平(JJ1000Y型，生產(chǎn)于常熟雙杰測(cè)試儀器廠)；恒溫干燥箱(DHG-9011A型，生產(chǎn)于上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

齊墩果酸(分析純，購(gòu)于西安欣祿生物科技有限公司)；抗壞血酸(分析純，購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司)；高氯酸、丙酮、正丁醇、冰醋酸、香草醛、乙醚等(分析純，購(gòu)于廣東光華化學(xué)廠有限公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 皂苷的提取

稱取5.0 g處理過(guò)的檸檬桉果實(shí)樣品，加入40 %的乙醇水溶液使得液料比為20∶1，設(shè)置輔助超聲條件為功率800 W，溫度40.0 ℃，時(shí)間45 min，提取完成后用離心機(jī)離心后進(jìn)行過(guò)濾，得到粗提液。

1.4.2 皂苷的純化

① 大孔樹(shù)脂吸附法[8]：選擇D101型大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行皂苷粗提物的純化，稱取10 g已預(yù)處理的大孔樹(shù)脂，裝柱完成后，多次量取150 mL的粗提液上柱，收集柱下液，分別考察吸附流速、吸附質(zhì)量濃度對(duì)吸附效果的影響。吸附完成后，再考察洗脫流速對(duì)解吸率和回收量的影響。

② 正丁醇萃取法[9]：將提取得到的皂苷粗提液減壓濃縮，再用等體積乙醚對(duì)濃縮液萃取3次，接著用水飽和的正丁醇對(duì)水層萃取6次，減壓濃縮上層液相，得到皂苷純化物。

③ 乙醚沉淀法[10-11]：在粗提液中加入乙醚溶液，混合均勻后靜置，離心分離所生成的沉淀物，將分離后的沉淀物用甲醇溶液溶解，再加入乙醚溶液使之產(chǎn)生沉淀、分離，如此反復(fù)進(jìn)行至沉淀后的上清液澄清無(wú)色后，將最終分離得到的沉淀用水溶解，即為皂苷純化物。

1.4.3 皂苷的分析

分別移取濃度為0.07 mg/mL的齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL于10 mL容量瓶中，加入5 %香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL和0.8 mL的高氯酸，在(70±1)℃條件下水浴加熱15min，取出后快速置于冰水中5 min，然后加入5 mL冰醋酸，搖勻后靜置22 min，用紫外-分光光度儀測(cè)定各樣品的吸光度，繪制線性方程，同樣的方法測(cè)定提取液中皂苷的濃度。

1.4.4 皂苷的抗氧化活性

配制一系列不同濃度的粗提液、正丁醇萃取純化液、乙醚沉淀純化液、大孔樹(shù)脂純化液，參照文獻(xiàn)[4]和文獻(xiàn)[12]的方法分別測(cè)定皂苷對(duì)DPPH·及·OH自由基的清除作用、總抗氧化性。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 檸檬桉果實(shí)中皂苷的提取

將提取得到的皂苷樣品煮沸，振蕩后可觀察到明顯的蜂窩狀泡沫，且在15 min內(nèi)不消失，同步空白無(wú)此現(xiàn)象，證明提取樣中存在皂苷。

按照1.4.3節(jié)分析方法，以齊墩果酸的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，縱坐標(biāo)為最大吸光度，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性方程為y=45.968x-0.046 5，R2=0.999 1。準(zhǔn)確量取0.05 mL皂苷粗提液，顯色后測(cè)定其中皂苷的含量，平行測(cè)定3次，結(jié)果如表1所示。

表1 粗提液中皂苷含量的測(cè)定Tab.1 Determination of saponin in crude extract

2.2 粗提液中皂苷的純化

2.2.1 大孔樹(shù)脂吸附法工藝優(yōu)化

① 上樣流速的選擇

上樣流速與皂苷的吸附率的關(guān)系見(jiàn)圖1。由圖1可知，保持上樣濃度一致，設(shè)置的上樣吸附流速越大，皂苷的吸附率越低。當(dāng)上樣流速分別為0.5、1.0 mL/min時(shí)，皂苷的吸附率相差不大，綜合考慮工作效率和實(shí)驗(yàn)時(shí)間成本，選擇1.0 mL/min為最佳上樣流速。

② 樣品質(zhì)量濃度的選擇

樣品質(zhì)量濃度與皂苷吸附效果的關(guān)系見(jiàn)圖2。由圖2可知，隨著樣品質(zhì)量濃度的增大，皂苷的吸附率先增大后降低，在樣品質(zhì)量濃度為0.38 mg/mL時(shí)樹(shù)脂吸附飽和，此時(shí)的樹(shù)脂吸附率為91.18 %，吸附量為0.35 mg/mL；當(dāng)樣品質(zhì)量濃度設(shè)置為0.50 mg/mL時(shí)，吸附率為90.13 %，但是吸附量可以達(dá)到0.45 mg/mL。綜合考慮吸附工作效率，以0.50 mg/mL為最佳上樣濃度。

③ 洗脫流速的選擇

設(shè)置上樣流速為1.0 mL/min，上樣濃度為0.50 mg/mL時(shí)，考察洗脫流速對(duì)皂苷解吸率的影響(圖3)。由圖3可知，隨著洗脫流速的增大，皂苷的解吸率先增加后降低，當(dāng)洗脫流速為1.5 mL/min時(shí)，解吸率最大。因此選擇1.5 mL/min為皂苷的最佳解吸流速。

圖1 上樣流速與皂苷的吸附率的關(guān)系Fig.1 Relationship between flow rate and adsorption rate of saponin

圖2 樣品濃度與皂苷吸附效果的關(guān)系Fig.2 Relationship between the concentration and the adsorptive effect of saponin

圖3 洗脫流速與皂苷解吸率的關(guān)系Fig.3 Relationship between elution flow rate and desorption rate of saponin

2.2.2 純化方法對(duì)皂苷純度的影響

在大孔樹(shù)脂最佳純化工藝條件基礎(chǔ)上，分別采用大孔樹(shù)脂吸附法、乙醚沉淀法和正丁醇萃取法對(duì)粗提物進(jìn)行純化，得到的純化物純度如表2所示。3種方法純化后，其純度分別提高為粗提物的1.87倍、3.08倍和2.37倍。

表2 純化方法對(duì)皂苷純度的影響Tab.2 Effect of purification methods on the purity of saponins

2.3 皂苷的抗氧化活性

2.3.1 總抗氧化性的測(cè)定

在皂苷濃度為0.01～0.1 mg/mL的范圍內(nèi)，以抗壞血酸作為參照物，考察不同純度的皂苷濃度對(duì)總抗氧化性的影響(圖4)。由圖4可知，皂苷濃度增加時(shí)，總抗氧化能力也逐漸增強(qiáng)。各樣品的總抗氧化性大體上是與純化物的純度成正比，其性能從小到大依次為抗壞血酸、大孔樹(shù)脂純化物、正丁醇萃取物、粗提物、乙醚沉淀物。其中，粗提物中由于含雜質(zhì)較多，包括一些抗氧化性能更好的成分，因而表現(xiàn)出較好的抗氧化性能。

圖4 皂苷不同質(zhì)量濃度試樣的總抗氧化性Fig.4 Total oxidation resistance of samplesin different concentration

2.3.2 DPPH·清除率的測(cè)定

在皂苷濃度為0.001～0.01 mg/mL的范圍內(nèi)，以抗壞血酸作為參照物，考察各樣品對(duì)DPPH·自由基清除率的影響(圖5)。由圖5可知，隨著皂苷濃度的增加，各樣品對(duì)DPPH·的清除率均呈上升趨勢(shì)，在樣品濃度為0.01 mg/mL時(shí)清除率達(dá)到最大，其中抗壞血酸的清除率最高，其他樣品對(duì)DPPH·自由基的清除能力從小到大依次為大孔樹(shù)脂純化物、乙醚沉淀物、正丁醇萃取物、粗提物。

圖5 不同質(zhì)量濃度試樣的DPPH·清除率Fig.5 DPPH· scavenging rate of differnent samples

從IC50值來(lái)看，對(duì)DPPH·自由基的清除能力從小到大依次為抗壞血酸、正丁醇萃取物、大孔樹(shù)脂純化物、粗提物、乙醚沉淀物，在三種皂苷純化物中，大孔樹(shù)脂純化物對(duì)DPPH·的清除效果較差，其可能的原因?yàn)榇罂讟?shù)脂純化后得到的雜質(zhì)較多，導(dǎo)致對(duì)DPPH·的清除率較低。

表3 不同樣品的抗氧化活性Tab.3 Antioxidant activity of different samples

2.3.3 ·OH清除率的測(cè)定

在皂苷質(zhì)量濃度為0.1～1.0 mg/mL的范圍內(nèi)，以抗壞血酸作為參照物，考察各樣品對(duì)·OH清除率的影響(圖6)。由圖6可知，隨著皂苷濃度的增加，各樣品對(duì)·OH的清除率呈明顯上升趨勢(shì)，在樣品濃度為1.0 mg/mL時(shí)清除率相對(duì)較大，對(duì)·OH的清除能力從小到大依次為大孔樹(shù)脂純化物、抗壞血酸、粗提物、正丁醇萃取物、乙醚沉淀物，基本與樣品純度成正比。

圖6 不同質(zhì)量濃度試樣對(duì)·OH的清除率Fig.6 ·OH free radical scavenging rate of different samples

3 結(jié)論

① 采用超聲波輔助溶劑法對(duì)檸檬桉果實(shí)中的皂苷進(jìn)行了提取，提取得率為18.41 %。分別采用大孔樹(shù)脂吸附法、乙醚沉淀法和正丁醇萃取法對(duì)粗提物進(jìn)行純化，經(jīng)3種方法純化后，其純度分別提高為粗提物的1.87倍、3.08倍和2.37倍。

② 進(jìn)行了D101型大孔樹(shù)脂吸附法的純化工藝優(yōu)化，得到最佳純化工藝為：上樣流速為1.0 mL/min為，上樣的樣品濃度為0.50 mg/mL，洗脫流速為1.5 mL/min，在此條件下，皂苷的純度可以提高到34.37 %。

③ 分別對(duì)皂苷提取物及純化物進(jìn)行抗氧化活性研究：各試樣的總抗氧化性與試樣的純度成正比，總抗氧化性從小到大依次為抗壞血酸、大孔樹(shù)脂純化物、正丁醇萃取物、粗提物、乙醚沉淀物；對(duì)DPPH·自由基的清除能力從小到大依次為大孔樹(shù)脂純化物、乙醚沉淀物、正丁醇萃取物、粗提物；對(duì)·OH的清除能力基本與其純度成正比，清除能力從小到大依次為大孔樹(shù)脂純化物、抗壞血酸、粗提物、正丁醇萃取物、乙醚沉淀物。