基于抗氧化和抗炎生物效應(yīng)的生脈注射液質(zhì)量評(píng)價(jià)

俞 月，路 娟，柴瑞平，呂欣鍇，鄧明慧，陳 曦 （.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所，北京 0093；.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 50355）

生脈注射液臨床上常用于輔助治療心肌梗塞、心源性休克、膿毒癥和感染性休克。心肌梗塞引起組織產(chǎn)生大量氧自由基，直接損傷心肌細(xì)胞并觸發(fā)細(xì)胞凋亡，免疫介導(dǎo)的炎癥損傷會(huì)加大心梗范圍和心梗損傷[1]。心源性休克激活的炎癥反應(yīng)可誘導(dǎo)產(chǎn)生大量NO，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[2]。膿毒血癥是由細(xì)菌引起的全身性炎癥，大量致炎因子破壞機(jī)體的免疫平衡，從而導(dǎo)致機(jī)體代謝紊亂[3]，嚴(yán)重者可能引起感染性休克。本研究特選擇抗氧化及抗炎能力作為生物效應(yīng)指標(biāo)，考察生脈注射液質(zhì)量與生物效應(yīng)之間的相關(guān)性。

課題組前期對(duì)生脈注射液中11 種成分[4]進(jìn)行了指認(rèn)并進(jìn)行了定量，均符合藥典標(biāo)準(zhǔn)。藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，生脈注射液中人參皂苷、木質(zhì)素和麥冬皂苷等多種化學(xué)成分均在細(xì)胞及動(dòng)物模型上表現(xiàn)出良好的抗炎效果[5-8]，且臨床研究表明其可以通過(guò)抗炎通路發(fā)揮對(duì)器官損傷的保護(hù)作用[9-10]?，F(xiàn)今生物效應(yīng)評(píng)價(jià)在中藥材和中成藥質(zhì)量控制研究中有所應(yīng)用[11-12]，2015 版《中國(guó)藥典》收錄了生物活性測(cè)定法作為質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，如洋地黃生物測(cè)定法和黃體生成素生物測(cè)定法，說(shuō)明通過(guò)生物效應(yīng)控制藥品質(zhì)量是可行的。

抗炎和抗氧化損傷是生脈注射液產(chǎn)生藥理作用的重要機(jī)制，但現(xiàn)今的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅對(duì)化學(xué)成分進(jìn)行定性定量分析，不能全面體現(xiàn)其整體的藥效活性，為此，本研究嘗試通過(guò)評(píng)價(jià)其抗氧化能力以及抗炎活性，建立有效的生脈注射液生物學(xué)質(zhì)量控制方法。

1 材料

1.1 試劑與藥品

二苯基苦基苯肼（DPPH，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥97%，含10%～20%苯，批號(hào)：PRPDE-JO，梯希愛(ài)（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司）；水溶性維生素E (Trolox)、DMEM 培養(yǎng)基和磷酸鹽緩沖液(PBS)均購(gòu)自北京Solarbio 公司；胎牛血清（FBS，德國(guó)PAN Seratech公司）；N-硝基-L-精氨酸甲酯（L-NAME）、NO 檢測(cè)試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；無(wú)水乙醇（北京化工廠(chǎng)）；水（屈臣氏）。

9 批次生脈注射液分別由5 個(gè)不同廠(chǎng)家生產(chǎn)，樣品詳細(xì)情況見(jiàn)表1。

1.2 主要儀器及設(shè)備

電子分析天平（AB265-S，梅托勒-托利多有限公司）；超聲波清洗儀（B25-12DT，寧波新芝生物科技股份有限公司）；TS-2000A 脫色搖床（海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司）；96 孔板、多功能連續(xù)波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（InfiniteM1000，TECAN 公司）；低速離心機(jī)（SC-3610，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；二氧化碳培養(yǎng)箱（MCO-15AC，三洋電機(jī)株式會(huì)社）。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

RAW264.7 細(xì)胞為小鼠單核巨噬細(xì)胞，購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心。培養(yǎng)條件：完全培養(yǎng)基為含10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基，在37℃含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天換液，細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，傳代（傳代比例為1：6）并開(kāi)展實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞控制在10 代以?xún)?nèi)。

2 方法與結(jié)果

2.1 DPPH 法評(píng)價(jià)生脈注射液質(zhì)量

2.1.1 實(shí)驗(yàn)過(guò)程

取96 孔板，每孔依次加入100 μl 初濃度2.0%的受試液、100 μl 0.5 mmol/L DPPH 溶液，震蕩均勻后避光反應(yīng)20 min。

測(cè)定方法：每孔依次加入100 μl 受試液和DPPH 溶液，在搖床上振蕩均勻，避光反應(yīng)20 min后，用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)在517 nm 處的吸光度。

2.1.2 方法學(xué)考察

考察內(nèi)容：①線(xiàn)性關(guān)系：分別吸取樣品編號(hào)為S9 的藥液，用純水定容得到濃度為8%的生脈注射液受試液。逐級(jí)稀釋?zhuān)瑴y(cè)定其吸光度并計(jì)算該濃度下的平均吸光度。以終濃度為橫坐標(biāo)（X），平均吸光度為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到的線(xiàn)性關(guān)系方程為Y=-0.2081X+1.2209（r=0.9996）（圖1-A），表明生脈注射液具有較強(qiáng)的DPPH 自由基清除能力且具有濃度依賴(lài)性，體積濃度和平均吸光度具有良好的線(xiàn)性關(guān)系，在0%～2.0%范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。②精密度：取樣品S9，配制得到濃度2.0%的受試液，設(shè)置平行復(fù)孔，按照“2.1.1”項(xiàng)下操作測(cè)定吸光度，計(jì)算其吸光度的RSD 值為2.25%（見(jiàn)表2），表明該方法滿(mǎn)足方法學(xué)精密度要求。③重復(fù)性：取樣品S9，配制得到濃度2.0%的受試液，設(shè)置平行復(fù)孔，按照"2.1.1“項(xiàng)下操作測(cè)定吸光度，計(jì)算其平均吸光度的RSD 值為2.21%（見(jiàn)表2），表明該方法滿(mǎn)足方法學(xué)重復(fù)性要求。④穩(wěn)定性：取樣品S9，分別 于0、4、8、24、48 和72 h，配制 得到 濃度2.0%的受試液，設(shè)置平行復(fù)孔，按照“2.1.1”項(xiàng)下操作測(cè)定吸光度，計(jì)算其平均吸光度的RSD 值為2.47%（見(jiàn)表3），表明該方法在72 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表 1 生脈注射液樣品來(lái)源、批號(hào)及有效成分含量(μg/ml)[4]

圖 1 生脈注射液抗氧化生物活性評(píng)價(jià)

表 2 1.0%生脈注射液對(duì)DPPH 清除作用的精密度和重復(fù)性考察

2.1.3 生脈注射液抗氧化生物活性的質(zhì)量評(píng)價(jià)

精密稱(chēng)定Trolox，加入100 μl 無(wú)水乙醇溶解，純水定容，得到初濃度為15.46 mmol/L 的Trolox溶液。將其逐級(jí)稀釋?zhuān)凑铡?.1.1“項(xiàng)下操作測(cè)定并計(jì)算平均吸光度，以終濃度為橫坐標(biāo)（X），平均吸光度為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。得到的線(xiàn)性關(guān)系方程為Y=-0.0789X+1.1674（r=0.9951）（見(jiàn)圖1-B），表明Trolox 清除DPPH 能力在作用濃度0.43～5.56 mmol/L 范圍內(nèi)具有良好線(xiàn)性關(guān)系。

表 3 1.0%生脈注射液對(duì)DPPH 的清除作用的穩(wěn)定性

將9 批次生脈注射液清除DPPH 自由基的結(jié)果與Trolox 比較，折算得到各批次生脈注射液相當(dāng)于水溶性Trolox 的作用濃度（見(jiàn)圖1-C）。結(jié)果表明，終濃度1.0%的各批次生脈注射液清除自由基能力相對(duì)于Trolox 作用濃度范圍為1.2～1.9 mmol/L，在清除自由基即抗氧化能力方各批次不存在較大差異。

2.2 Griess 試劑盒評(píng)價(jià)生脈注射液的抗炎活性

2.2.1 Griess 試劑盒測(cè)定生脈注射液抑制NO 釋放能力

使用完全培養(yǎng)基配制為1.2%的生脈注射液樣品溶液，及初濃度100μg/ml 的LPS 樣品溶液。

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7 細(xì)胞，制備成2×106個(gè)/ml 的細(xì)胞懸液，以每孔100 μl 注入96 孔板。培養(yǎng)24 h 后，棄去培養(yǎng)基，每孔加入100 μl 樣品溶液和100 μl 的LPS 溶液，孵育24 h 后吸取50 μl上清液，按照Griess 試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)540 nm 處的吸光度。

2.2.2 方法學(xué)考察

考察內(nèi)容：①線(xiàn)性關(guān)系：精密吸取樣品編號(hào)為S6 的藥液，用完全培養(yǎng)基制成濃度為4.0%的溶液。逐級(jí)稀釋?zhuān)瑴y(cè)定吸光度并計(jì)算該濃度下的平均吸光度。以終濃度為橫坐標(biāo)（X），平均吸光度為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。得到線(xiàn)性方程為Y=-0.033ln(X)+0.243（r=0.9961）（見(jiàn)圖2-A），表明生脈注射液具有良好的NO 分泌抑制能力并具有濃度依賴(lài)性，終濃度和平均吸光度之間具有良好的線(xiàn)性關(guān)系，在0.2%～2.0%范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。②精密度：取樣品S6，配制得到濃度為1.2%的受試液，設(shè)置平行復(fù)孔，按照“2.1.1“項(xiàng)下操作測(cè)定吸光度，計(jì)算其吸光度的RSD 值為1.71%（見(jiàn)表4），表明該法滿(mǎn)足方法學(xué)精密度要求。③重復(fù)性：取樣品S6，配制得到濃度為1.2%的受試液，設(shè)置平行復(fù)孔，按照“2.1.1“項(xiàng)下操作測(cè)定吸光度，計(jì)算其平均吸光度的RSD 值為2.79%（見(jiàn)表4），表明該法滿(mǎn)足方法學(xué)重復(fù)性要求。④穩(wěn)定性：取樣品S6，分別于0、4、8、24 和48 h 時(shí)，配制得到濃度1.2%的溶液，設(shè)置平行復(fù)孔，按照“2.1.1”項(xiàng)下操作測(cè)定吸光度，計(jì)算其平均吸光度的RSD 值為2.66%（見(jiàn)表5），表明該方法在48 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

圖 2 生脈注射液抗炎活性評(píng)價(jià)

2.2.3 生脈注射液抗炎生物活性的質(zhì)量評(píng)價(jià)

精密稱(chēng)定eNOS 抑制劑L-NAME，逐級(jí)稀釋?zhuān)凑铡?.1.1“項(xiàng)下操作，測(cè)定并計(jì)算平均吸光度，以終濃度為橫坐標(biāo)（X），平均吸光度為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。得到線(xiàn)性關(guān)系方程為Y=-0.052ln(X)+0.152（r=0.9957）（見(jiàn)圖2-B），表明L-NAME 抑制NO 分泌能力在0.05～0.55 mmol/L 范圍內(nèi)具有良好線(xiàn)性關(guān)系。

將9 批次生脈注射液抑制NO 分泌能力的結(jié)果與L-NAME 比較，折算得到各批次生脈注射液相對(duì)于L-NAME 的作用濃度（見(jiàn)圖2-C）。

表 4 1.2%生脈注射液對(duì)LPS 刺激264.7 細(xì)胞分泌NO 的精密度和重復(fù)性考察

表 5 1.2%生脈注射液對(duì)LPS 刺激264.7 細(xì)胞分泌NO 的穩(wěn)定性考察

結(jié)果顯示，除S2 和S8 樣品外，終濃度0.6%的各批次生脈注射液對(duì)應(yīng)的L-NAME 濃度范圍均在0.06～0.16 mmol/L 范圍內(nèi)，表明在抑制NO 分泌能力即抗炎能力方面S2 和S8 與其他樣品存在較大差異。其中S2 對(duì)應(yīng)的L-NAME 濃度遠(yuǎn)高于其他樣品，其抗炎活性遠(yuǎn)高于其他樣品組，推測(cè)這可能與化學(xué)成分含量差異有關(guān)，需要后續(xù)的實(shí)驗(yàn)加以證實(shí)。

3 討論

3.1 實(shí)驗(yàn)方法及陽(yáng)性對(duì)照藥的選擇

測(cè)定抗氧化活性常用的方法有氧化自由基吸收能力（ORAC）、二苯基苦基苯肼（DPPH）法和總抗氧化能力檢測(cè)（ABTS）法等，本實(shí)驗(yàn)首先采用DPPH 法測(cè)定抗氧化能力，該方法操作簡(jiǎn)便，常用于體外評(píng)價(jià)化合物的抗氧化活性，其中Trolox 和維生素C 是常用的抗氧化劑對(duì)照藥[13-14]，但相較之下，Trolox 可通過(guò)清除自由基產(chǎn)生抗氧化機(jī)制，且具有劑量依賴(lài)性[15]，而維生素C 穩(wěn)定性較Trolox差，所以該方法選擇了該藥作為陽(yáng)性對(duì)照。內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）誘導(dǎo)產(chǎn)生NO 是NO 產(chǎn)生的重要途徑[16]，L-NAME 作為eNOS 抑制劑，選擇其作為對(duì)照藥可以更加直觀地評(píng)價(jià)藥物對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生NO 的抑制能力。

3.2 結(jié)果分析

參考2015 版藥典生物測(cè)定方法，該試驗(yàn)通過(guò)測(cè)定生脈注射液的抗炎和抗氧化能力，初步建立了生脈注射液的生物效應(yīng)質(zhì)量控制方法，該方法不僅能滿(mǎn)足方法學(xué)要求，而且可以克服現(xiàn)行質(zhì)量控制方法的局限性，還可以有效的評(píng)價(jià)中藥復(fù)方制劑在治療過(guò)程中產(chǎn)生的效應(yīng)強(qiáng)度，實(shí)現(xiàn)“質(zhì)-量-效”的有效結(jié)合[17]。

4 展望

中藥復(fù)方是一個(gè)組分復(fù)雜，不僅化學(xué)成分復(fù)雜，未知組分眾多，而且其可能通過(guò)不同成分的配伍產(chǎn)生作用機(jī)制，即其藥理機(jī)制不是單一化學(xué)成分能夠闡明的，因此，僅對(duì)中藥復(fù)方的化學(xué)成分進(jìn)行評(píng)價(jià)難以對(duì)其成分及作用進(jìn)行全面闡述。生物效應(yīng)質(zhì)量控制方法能對(duì)中藥復(fù)方的整體組分藥效進(jìn)行把控，從藥理活性方面評(píng)價(jià)中藥復(fù)方質(zhì)量，彌補(bǔ)現(xiàn)有質(zhì)控方法的不足。在生物效應(yīng)質(zhì)控方法建立過(guò)程中，應(yīng)注意以下問(wèn)題：①質(zhì)控方法應(yīng)根據(jù)藥效及藥理機(jī)制研究選擇合適的生物效應(yīng)指標(biāo)，充分反映該藥的藥理活性特征；②選擇的對(duì)照藥應(yīng)具有足夠的專(zhuān)屬性、關(guān)聯(lián)性和可測(cè)性，能夠充分準(zhǔn)確地反映藥物的生物效應(yīng)[18-20]。參考已有的生物質(zhì)量控制研究[11，21]并對(duì)生脈注射液可能的藥理活性進(jìn)行篩選，對(duì)此進(jìn)行考察。重點(diǎn)考察其方法學(xué)驗(yàn)證，結(jié)果顯示該方法可行性高，方法學(xué)符合生物效應(yīng)評(píng)價(jià)要求，可以反映生脈注射液的整體生物效應(yīng)。但抗炎活性的測(cè)定實(shí)驗(yàn)要求較高的實(shí)驗(yàn)操作，且該方法對(duì)中藥復(fù)方的整體生物活性進(jìn)行測(cè)定，并未對(duì)可能產(chǎn)生藥理活性的化學(xué)組分和含量進(jìn)行探究和測(cè)定，可能產(chǎn)生藥理活性的化學(xué)成分及作用機(jī)制尚不明確，值得后續(xù)的探討。