楊梅素通過PI3K/AKT/NF-κB信號通路對骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)展的影響

楊鑫，李源力，蔣萍，王冶

(川北醫(yī)學院 附屬醫(yī)院 骨外科,四川 南充 637000)

骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)是一種多因素疾病，是導致全世界個體殘疾的主要關(guān)節(jié)退行性疾病之一，特別是老年人[1].然而，目前可用于治療OA的有效方法較少[2].因此，尋找新的治療方法和藥物對防治OA的發(fā)生發(fā)展至關(guān)重要.PI3K/AKT/NF-κB信號通路被證明在調(diào)節(jié)OA發(fā)病機制中的炎癥介質(zhì)具有重要作用[3].PI3K存在于各種細胞中，能夠被細胞因子和理化因素激活[4].AKT處于PI3K的下游，在正常情況下，活化的PI3K能和磷酸肌醇依賴的激酶-1協(xié)同激活AKT[5].PI3K/AKT信號通路的下調(diào)會使NF-κB抑制性蛋白IKBα的表達下調(diào)，促進NF-κB磷酸化[6].NF-κB是一種多靶向細胞因子，參與細胞內(nèi)的多種信號傳遞，調(diào)控多種基因的表達.然而，NF-κB信號通路的激活，會引起多種炎癥因子的釋放，如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)等[7].楊梅素是一種天然存在的黃烷醇，具有抗炎、抗癌和抗糖尿病等多種功能[8]，也能可以減少炎癥酶和細胞因子脂多糖刺激的RAW264.7巨噬細胞的產(chǎn)生[9].最近的報道表明，楊梅素的抗癌作用與PI3K/AKT通路有關(guān)[10].然而，楊梅素在OA進展中的治療作用仍然未知.本文通過對骨性關(guān)節(jié)炎與 PI3K/AKT/NF-κB信號通路相關(guān)性初步研究，探討楊梅素在骨性關(guān)節(jié)炎進展中的治療作用及其中潛在的分子機制.

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

IL-1β(批號：10734)購自北京凱瑞基生物科技有限公司.楊梅素(質(zhì)量分數(shù)≥99.8%)(批號：B21458)購自上海源葉生物有限公司.10只1周齡SD大鼠和45只體質(zhì)量180～220 g SD大鼠由川北醫(yī)學院實驗動物中心提供，許可證號：SCYK(川)2017-0005.Ⅱ型膠原蛋白酶(批號：BI-E2749)，購自北京全式金公司.PBS(批號：PYG0021)、DMEM培養(yǎng)基(含青霉素和鏈霉素)(批號：DXT-12100046)購自武漢博士德公司.胎牛血清(批號：10099)、質(zhì)量分數(shù)為0.25%的胰蛋白酶(批號：25300054)均購自美國Gibco公司.CCK-8試劑盒購自日本同仁研究所.ELISA試劑盒購于美國BOSTER公司.RIPA裂解液購自北京索萊寶公司.p-PI3K(批號：173665)、PI3K(批號：4249)、p-AKT(批號：4060)、AKT(批號：2920)、p-NF-κB P65(批號：8214)、NF-κB P65(批號：8242)、p-IKKαβ(批號：4927)、IKKβ(批號：4782)、IKBα(批號：4814)、p-IKBα(批號：2859)、GAPDH(批號：5174)抗體和山羊抗兔(鼠)IgG二抗(批號：3900；批號：7076)購自美國Cell Signaling Technology公司.PVDF膜(批號：IPVH00010)購自Millipore公司.

全自動酶標儀(型號：51119000)和石蠟切片機(HM 325)購自美國賽默飛世爾公司.電泳儀(批號：DYY-1C)購自北京六一儀器廠.流式細胞儀(型號：AMG0002051)購自美國BD公司.奧林巴斯IX83全自動熒光倒置顯微鏡(型號：IX83)購自日本奧林巴斯公司.

1.2 研究方法

1.2.1 軟骨細胞分離與培養(yǎng)

為了軟骨細胞的分離與原代培養(yǎng)，將10只1周齡SD大鼠膝關(guān)節(jié)上的軟骨組織從股骨髁和脛骨剝離，用PBS和青霉素、鏈霉素分別沖洗3次，在培養(yǎng)皿(直徑=60 mm)中用手術(shù)刀切成1 mm3的小塊，接著用胰蛋白酶在37 ℃培養(yǎng)箱中先消化30 min，再用Ⅱ型膠原蛋白酶消化3 h.經(jīng)過3 h消化后，用尼龍細胞過濾網(wǎng)(濾孔直徑為100 μm)過濾組織以除去未消化的軟骨組織，過濾后軟骨細胞經(jīng)離心(1 000 r/min，5 min)后棄去上清液，再次重懸于完全培養(yǎng)基(含質(zhì)量分數(shù)為0.1 mg/mL青霉素、質(zhì)量分數(shù)為0.1 mg/mL鏈霉素和體積分數(shù)為10%胎牛血清的DMEM)中，并接種于培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng).所有細胞培養(yǎng)瓶置于37 ℃、體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱，每2～3 d更換一次完全培養(yǎng)基.

1.2.2 甲苯胺藍染色法鑒定軟骨細胞

(1)潔凈的蓋玻片在體積分數(shù)為70%的乙醇中浸泡5 min，滅菌的PBS清洗3 次，風干；(2)取處于對數(shù)期的細胞，按照細胞密度為1×106/mL接種至6孔細胞培養(yǎng)板中，將蓋玻片均勻放入培養(yǎng)板中，加入完全培養(yǎng)基，置于37 ℃、體積分數(shù)為5% 的CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng) 48 h；(3)傾去培養(yǎng)液，PBS洗3次，每次10 min，加體積分數(shù)為4%多聚甲醛，室溫下固定30 min；傾去多聚甲醛，PBS洗3次，每次10 min再加入體積分數(shù)為70%乙醇，室溫下固定 30 min；(4)棄去上述乙醇固定液，PBS洗3次，每次10 min，晾干，加入含體積分數(shù)為30%乙醇的甲苯胺藍溶液染色30 min；PBS洗3次，每次10 min，然后再用無水乙醇洗10 min；(5)取出細胞玻片，干燥后用中性樹脂封片，顯微鏡下觀察并攝片.軟骨細胞經(jīng)甲苯胺藍染色會呈紫藍色.

1.2.3 CCK-8篩選誘導損傷最適質(zhì)量濃度的IL-1β

將軟骨細胞按2×105/mL分別接種到96孔板上，每孔200 μL.置于37 ℃，體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h，至細胞貼壁.棄去上清液，空白組加入PBS溶液，對照組加入完全培養(yǎng)基，其余各組分別加入含有不同質(zhì)量濃度(1，5，10，50，100 ng/mL)IL-1β的完全培養(yǎng)基，每孔200 μL，每組設(shè)置6個復孔.置于37 ℃，體積分數(shù)為5% 的CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h后加入CCK8，輕輕震蕩均勻后放入37 ℃、體積分數(shù)為5% 的CO2培養(yǎng)箱中孵育30 min，于酶標儀450 nm處測定各孔光密度值D(450 nm).按照公式計算細胞存活率.取半數(shù)致死量的質(zhì)量濃度為誘導損傷最適質(zhì)量濃度.

細胞存活率=

1.2.4 CCK-8篩選最適作用濃度的楊梅素檢測

將軟骨細胞按2×105/mL分別接種到96孔板上，每孔200 μL.置于37 ℃，體積分數(shù)為5%的 CO2的培養(yǎng)箱中孵育24 h，至細胞貼壁.棄去上清液，空白組加入PBS溶液，對照組加入完全培養(yǎng)基，IL-1β模型組與用藥組均加入含有誘導炎癥最適質(zhì)量濃度的IL-1β完全培養(yǎng)基，每孔200 μL，每組設(shè)置6個復孔.置于37 ℃，體積分數(shù)為5% 的CO2的培養(yǎng)箱中孵育24 h之后，棄去上清液，空白組加入PBS溶液，對照組和IL-1β模型組加入完全培養(yǎng)基，其余組各加入含有不同濃度(5，10，15，20 μmol/L) 楊梅素的完全培養(yǎng)基，每孔200 μL.置于37℃，體積分數(shù)為5% 的CO2的培養(yǎng)箱中孵育24 h或48 h后，加入20 μL CCK-8，輕輕震蕩均勻后放入37℃、體積分數(shù)為5%的 CO2培養(yǎng)箱中孵育30 min，于酶標儀450 nm處測定各孔光密度值D(450 nm).按照公式計算細胞存活率.取存活率最高的楊梅素濃度為最適作用濃度.

1.2.5 克隆形成實驗檢測細胞的增殖能力

軟骨細胞分為3組：對照組，IL-1β模型組和楊梅素組.對照組細胞一直用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，IL-1β模型組細胞為經(jīng)誘導損傷最適質(zhì)量濃度的IL-1β完全培養(yǎng)基溶液干預培養(yǎng)48 h，楊梅素組細胞為經(jīng)IL-1β誘導24 h后，再經(jīng)最適作用濃度的楊梅素完全培養(yǎng)基溶液培養(yǎng)24 h.培養(yǎng)結(jié)束后的各組細胞以1×103/孔接種于60 mm細胞培養(yǎng)皿中.10 d后，用結(jié)晶紫染色溶液染色細胞，并計數(shù)含有≥30個細胞的集落，用奧林巴斯熒光倒置顯微鏡拍攝代表性集落并統(tǒng)計.實驗獨立重復3次.

1.2.6 細胞分組

細胞實驗分為3組：對照組，IL-1β模型組和楊梅素組.對照組細胞一直用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，IL-1β模型組細胞為經(jīng)誘導損傷最適質(zhì)量濃度的IL-1β完全培養(yǎng)基溶液干預培養(yǎng)48 h，楊梅素組細胞為經(jīng)IL-1β誘導24 h后，再經(jīng)最適作用濃度的楊梅素完全培養(yǎng)基溶液培養(yǎng)24 h.

1.2.7 細胞流式術(shù)檢測細胞凋亡率

培養(yǎng)結(jié)束后的各組細胞用冷PBS清洗兩次，然后在結(jié)合緩沖液中重懸并稀釋為1×105/mL.嚴格按照Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒說明書進行操作，用流式細胞儀進行細胞凋亡率的檢測.實驗獨立重復3次.

1.2.8 酶聯(lián)免疫法檢測細胞上清液中TNF-α、IL-6和IL-10的質(zhì)量濃度

1.2.9 Western blot檢測PI3K/AKT/NF-κB信號通路相關(guān)蛋白的表達情況

培養(yǎng)結(jié)束后的各組細胞用蛋白酶抑制劑裂解液裂解細胞后提取蛋白，用BCA法測定總蛋白含量.取等量蛋白質(zhì)樣品上樣，SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白質(zhì)后轉(zhuǎn)膜，用質(zhì)量分數(shù)為5%脫脂奶粉封閉1 h，之后加入稀釋后的p-PI3K(Vp-PI3K∶V抗體稀釋液=1∶2 000)、PI3K(VPI3K∶V抗體稀釋液=1∶2 000)、p-AKT(Vp-AKT∶V抗體稀釋液=1∶2 000)、AKT(VAKT∶V抗體稀釋液=1∶1 000)、p-NF-κB P65(Vp-NF-κB P65∶V抗體稀釋液=1∶2 000)、NF-κB P65(VNF-κB P65∶V抗體稀釋液=1∶1 000)、p-IKKαβ(Vp-IKKαβ∶V抗體稀釋液=1∶1 000)、IKKβ(VIKKβ∶V抗體稀釋液=1∶2 000)、IKBα(VIKBα∶V抗體稀釋液=1∶1 000)、p-IKBα(Vp-IKBα∶V抗體稀釋液=1∶2 000)和GAPDH(VGAPDH∶V抗體稀釋液=1∶2 000)一抗，4 ℃搖床上孵育過夜.用TBST洗膜3次，每次10 min，加入對應(yīng)于一抗種屬來源的HRP標記的二抗，在室溫搖床上孵育1 h，用TBST洗膜3次，每次10 min.使用ECL化學發(fā)光液顯色發(fā)光，凝膠成像系統(tǒng)拍照，Image Pro Plus圖像分析系統(tǒng)對蛋白條帶進行分析.

1.2.10 骨性關(guān)節(jié)炎動物模型構(gòu)建與分組給藥

分組：將45只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機分為3組，每組15只，分別為假手術(shù)組、OA模型組和楊梅素組.

造模：SD大鼠經(jīng)腹腔注射水合氯醛(0.3 mL/100 g)進行麻醉.麻醉成功后，在超靜工作臺中切開大鼠右膝關(guān)節(jié)沿髕韌帶內(nèi)側(cè)緣皮膚約0.5～1 cm，并分別切斷內(nèi)側(cè)副韌帶和前交叉韌帶，同時摘除內(nèi)側(cè)半月板，逐層縫合.術(shù)后連續(xù)肌肉注射抗生素治療3 d；SD大鼠隨機分組回籠后正常飼養(yǎng)，同時觀察各組大鼠的傷口愈合情況、患肢活動量、飲食等并記錄.假手術(shù)組只分離不做切斷與摘除.剔除實驗過程中死亡的大鼠.

給藥：造模后第2天，楊梅素組按每千克大鼠體質(zhì)量每天給予含質(zhì)量20 mg的楊梅素水溶液[11]連續(xù)灌胃給藥8周，假手術(shù)組和OA模型組則同步給予等體積生理鹽水.

1.2.11 Masson染色觀察各組大鼠軟骨組織的組織結(jié)構(gòu)變化

同樣，類似的手段也被上海陶藝家李游宇先生所應(yīng)用。他將陶瓷作為一種材質(zhì)處理后，用手、腳做出粗陶壁畫，整體搬到室內(nèi)裝飾墻上。這種裝飾方式帶著明顯的人工痕跡，又因未施釉，而顯示出一種原始的古樸與粗獷，具有不事雕琢的質(zhì)感，使得環(huán)境氛圍沒有絲毫壓抑感，具有一種打動心靈的親和力。他還將數(shù)量眾多的陶瓷造型花瓶捏扁，噴上彩釉燒成后，鑲嵌在墻面上，具有強烈的視覺沖擊力。還有諸如歐洲古典風格的瓷雕，古羅馬故事里的陶瓷等等。這些別具匠心的陶瓷設(shè)計與所處空間達到和諧統(tǒng)一，魅力十足。

末次灌胃2 h后，各組大鼠經(jīng)腹腔注射水合氯醛(0.3 mL/100 g)進行麻醉，迅速采取膝關(guān)節(jié)組織.關(guān)節(jié)組織標本按常規(guī)方法進行石蠟切片.按照常規(guī)方法染色：①蘇木精染核30 s，用自來水洗1次；②麗春紅品紅染色液染1 min，用自來水洗1次；③苯胺藍染色液染2 min，用自來水洗1次；④ 0.2%冰醋酸水溶液浸洗片刻；95%乙醇、無水乙醇、二甲苯透明各5 min、中性樹膠封片.熒光倒置顯微鏡下觀察各組大鼠軟骨組織的組織結(jié)構(gòu)變化.

1.2.12 ELISA檢測各組大鼠關(guān)節(jié)液中TNF-α、IL-6和IL-10表達水平

末次灌胃2 h后，各組大鼠取樣時均留取關(guān)節(jié)液，并稀釋50倍.按ELISA試劑盒操作說明進行后續(xù)的實驗.之后用酶標儀測定每孔在450 nm處的OD值，計算每孔中TNF-α、IL-6和IL-10的質(zhì)量濃度.

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 軟骨細胞鑒定

提取的原代細胞經(jīng)過3次傳代后，培養(yǎng)2～3 d，細胞貼壁、變形，呈三角形或多角形(圖1A)；培養(yǎng)第3代的軟骨細胞生長均勻，細胞形態(tài)不一，扁平有突起，經(jīng)甲苯胺藍染色，細胞核呈藍色，細胞質(zhì)為淺藍色，著色較細胞核淺，胞質(zhì)中可見少許異染顆粒(圖1B).符合軟骨細胞特征，因此可用于后續(xù)實驗.

A:軟骨細胞形態(tài)(×40);B:甲苯胺藍染色鑒定軟骨細胞(×100).
A:Morphology of chondrocytes (×40);B:identification of chondrocytes by toluidine blue staining(×100).
圖1 軟骨細胞的鑒定
Fig.1 Identification of chondrocytes

2.2 誘導損傷最適質(zhì)量濃度的IL-1β

選定質(zhì)量濃度梯度范圍(1、5、10、50、100 ng/mL)的IL-1β均能明顯抑制軟骨細胞的增殖，且隨著質(zhì)量濃度的增加，抑制效果也逐漸增強.當IL-1β的質(zhì)量濃度為10 ng/mL時，CCK-8檢測24 h后細胞存活率為48.36%(P<0.01)，接近半數(shù)致死量 .因此確定質(zhì)量濃度10 ng/mL的IL-1β為誘導軟骨細胞損傷的最適質(zhì)量濃度(圖2).

1) 與對照組比較，P<0.05;2) 與對照組比較，P<0.01;3) 與對照組比較，P<0.001
1) compared with the control group,P<0.05;2) compared with the control group,P<0.01;3) compared with the control group,P<0.001
圖2 IL-1β對軟骨細胞存活率的影響
Fig.2 Effect of IL-1β on chondrocyte survival

2.3 楊梅素對IL-1β誘導損傷的軟骨細胞的治療作用

IL-1β誘導軟骨細胞后，IL-1β模型組相對于對照組的細胞存活率明顯降低(P<0.001)，而與IL-1β模型組比較，濃度為5、10 μmol/L的楊梅素能明顯提高損傷后的軟骨細胞的細胞存活率，具有明顯的治療作用，但濃度為15 μmol/L時，軟骨細胞的增殖明顯減少，說明楊梅素對細胞有毒性作用(圖3).故對IL-1β?lián)p傷后的軟骨細胞起治療作用的楊梅素濃度應(yīng)該控制在0～10 μmol/L.在后續(xù)實驗中楊梅素最適作用濃度選擇為10 μmol/L，作用時間為24 h.

1) 與IL-1β模型組比較，P<0.05;2) 與IL-1β模型組比較，P<0.01.
1) Compared with the IL-1 β model group,P<0.05;2) Compared with the IL-1 β model group,P<0.01.
圖3 楊梅素對IL-1β?lián)p傷軟骨細胞的治療作用
Fig.3 Protective effect of myricetin on IL-1β-damaged chondrocytes

2.4 楊梅素對IL-1β誘導損傷的軟骨細胞增殖的影響

與對照組相比，IL-1β模型組中軟骨細胞增殖能力顯著下降(P<0.01)；與IL-1β模型組比較，楊梅素組中軟骨細胞增殖能力提高(P<0.05)(圖4).

2.5 楊梅素對IL-1β誘導損傷的軟骨細胞凋亡的影響

與對照組相比，IL-1β模型組中軟骨細胞凋亡能力顯著提高(P<0.001)；與IL-1β模型組比較，楊梅素組中軟骨細胞凋亡能力下降(P<0.01)(圖5).

1)與IL-1β模型組比較，P<0.05;2) 與對照組比較，P<0.01.
1) Compared with IL-1β model group,P<0.05;2) Compared with control group,P<0.01.
圖4 楊梅素對IL-1β誘導的軟骨細胞增殖的影響
Fig.4 Effect of myricetin on IL-1β-induced chondrocyte proliferation

1) 與IL-1β模型組比較，P<0.01;2)與對照組比較，P<0.001.
1) Compared with the IL-1 β model group,P<0.01;2) Compared with the control group,P<0.001.
圖5 楊梅素對IL-1β誘導的軟骨細胞凋亡的影響
Fig.5 Effect of myricetin on apoptosis of IL-1β-induced chondrocytes

2.6 楊梅素對IL-1β誘導損傷的軟骨細胞培養(yǎng)液中TNF-α、IL-6和IL-10質(zhì)量濃度的影響

與對照組比較，IL-1β模型組軟骨細胞培養(yǎng)液中TNF-α、IL-6質(zhì)量濃度均增加(P<0.01)，IL-10質(zhì)量濃度減少(P<0.01)；與IL-1β模型組比較，楊梅素組軟骨細胞培養(yǎng)液中TNF-α、IL-6質(zhì)量濃度均減少(P<0.05)，IL-10質(zhì)量濃度增加(P<0.05，表1).

2.7 楊梅素對IL-1β誘導損傷的軟骨細胞中PI3K/AKT/NF-κB信號通路相關(guān)蛋白的表達影響

與對照組比較，IL-1β模型組軟骨細胞中PI3K、AKT、NF-κB P65、IKKαβ、IKBα蛋白的磷酸化程度均上調(diào)(P<0.001)，IKBα 蛋白表達下調(diào)(P<0.01)；與IL-1β模型組比較，楊梅素組軟骨細胞中PI3K、AKT、NF-κB P65、IKKαβ、IKBα蛋白的磷酸化程度均下調(diào)(P<0.05)，IKBα蛋白表達上調(diào)(P<0.05) (圖6).

表1 楊梅素對IL-1β誘導損傷的軟骨細胞培養(yǎng)液中TNF-α、IL-6和IL-10的質(zhì)量濃度的影響Table 1 Effect of myricetin on the concentration of TNF-α,IL-6 and IL-10 in culture medium of chondrocytes induced by IL-1β

1)與IL-1β模型組比較,P<0.05;2) 與IL-1β模型組比較,P<0.01;3) 與對照組比較,P<0.01;4) 與對照組比較,P<0.001.
1) Compared with the IL-1 β model group,P<0.05;2) Compared with the IL-1 β model group,P<0.01;3) Compared with the control group,P<0.01;4) Compared with the control group,P<0.001.

2.8 各組大鼠軟骨組織病理變化

Masson結(jié)果顯示：假手術(shù)組大鼠軟骨細胞形態(tài)規(guī)則，染色呈藍色，軟骨組織的膠原纖維排列緊密；OA模型組大鼠軟骨細胞含量較少，細胞紊亂分布，細胞呈多形性且細胞質(zhì)少，軟骨組織的膠原纖維排列紊亂，局部出現(xiàn)明顯斷裂和降解；楊梅素組軟骨細胞形態(tài)較規(guī)則，軟骨組織的膠原纖維排列比較緊密(圖7).

1) 與IL-1β模型組比較,P<0.05;2) 與IL-1β模型組比較,P<0.01;3)與對照組比較,P<0.001.
1) Compared with the IL-1 β model group,P<0.05;2) Compared with the IL-1 β model group,P<0.01;3) Compared with the control group,P<0.001.
圖6 楊梅素對IL-1β誘導的軟骨細胞中PI3K/AKT/NF-κB信號通路相關(guān)蛋白的表達情況
Fig.6 Effect of myricetin on the expression of PI3K/AKT/NF-κB signaling pathway-related proteins in IL-1β-induced chondrocytes

A：假手術(shù)組；B:OA模型組；C:楊梅素組.A:sham operation group;B:OA model group;C:myricetin group.圖7 Masson染色觀察各組大鼠軟骨組織的結(jié)構(gòu) (×400)

Fig.7 The structure of rat cartilage tissue observe by Masson staining (×400)

2.9 各組大鼠關(guān)節(jié)液中TNF-α、IL-6和IL-10表達情況比較

與假手術(shù)組比較，OA模型組大鼠關(guān)節(jié)液中TNF-α、IL-6質(zhì)量濃度均增加(P<0.001)，IL-10質(zhì)量濃度減少(P<0.01)；與OA模型組比較，楊梅素組大鼠關(guān)節(jié)液中TNF-α、IL-6質(zhì)量濃度均減少(P<0.05)，IL-10質(zhì)量濃度增加(P<0.05).(表2).

表2 各組大鼠關(guān)節(jié)液中TNF-α、IL-6和IL-10表達情況比較Table 2 Comparison of expression of TNF-α,IL-6 and IL-10 in synovial fluid of rats in each group

1) 與OA模型組比較,P<0.05;2) 與OA模型組比較,P<0.01;3) 與假手術(shù)組比較,P<0.01;4) 與假手術(shù)組比較,P<0.001.
1) Compared with osteoarthritis group,P<0.05;2) Compared with osteoarthritis group,P<0.01;3) Compared with sham operation group,P<0.01;4) Compared with sham operation group,P<0.001.

3 討論

OA是一種常見的關(guān)節(jié)病，其特征在于軟骨損失和破壞.OA會顯著引起老年人的關(guān)節(jié)疼痛和身體殘疾[12-13].隨著世界人口的老齡化，OA的患病率正在上升.大約25%的55歲以上的人患有膝蓋疼痛[14].

PI3K/AKT/NF-κB途徑被證明在OA發(fā)病機制中的炎癥介質(zhì)具有重要作用.IL-1β能夠激活PI3K/AKT/NF-κB信號級聯(lián)，誘導分解代謝因子的表達.研究發(fā)現(xiàn)IL-1β刺激激活PI3K和AKT的磷酸化，從而使p-PI3K和p-AKT蛋白的磷酸化水平上調(diào).此外，IL-1β觸發(fā)IKKαβ和IKBα的磷酸化，進而釋放p65并將其從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細胞核[15].Huang等[16]研究表明，IL-1β能誘導細胞中ERK，JNK，PI3k和AKT，IKKαβ和IKBα的磷酸化，并促進NF-κB的核轉(zhuǎn)位.因此，IL-1β與PI3K/AKT/NF-κB信號通路關(guān)系密切.

楊梅素是廣泛存在的黃酮類化合物，已有研究報道楊梅素及其衍生物具有抗菌、抗病毒、抗癌、抗炎、抗氧化應(yīng)激和降糖等活性[17].舒雪蓮等[18]研究發(fā)現(xiàn)，連續(xù)給楊梅素(1.5 mg/kg)2周可改善佐劑性關(guān)節(jié)炎小鼠原發(fā)性關(guān)節(jié)滑膜增生，減少炎癥細胞浸潤，并降低小鼠關(guān)節(jié)腫脹率及血清炎癥因子水平.但是楊梅素在骨性關(guān)節(jié)炎的研究中甚少，其是否對骨性關(guān)節(jié)炎有緩解作用，需要進一步的研究.

本實驗首先確定了IL-1β的最適質(zhì)量濃度來建立體外骨性關(guān)節(jié)炎模型，當IL-1β的質(zhì)量濃度為10 ng/mL時，細胞抑制率為48.36%，接近半數(shù)致死量，因此在后續(xù)實驗中使用.之后，確定楊梅素的最佳濃度來提高細胞活性，當楊梅素濃度10 μmol/L時，能明顯提高損傷后的軟骨細胞的活性，因此后續(xù)實驗楊梅素的濃度選擇10 μmol/L.為了研究楊梅素是否對IL-1β誘導損傷的軟骨細胞有治療作用，進行了克隆形成實驗和流式細胞儀實驗，結(jié)果表明：克隆形成實驗和流式細胞實驗結(jié)果表明，楊梅素能提高軟骨細胞的增殖能力，降低軟骨細胞的凋亡能力；同時楊梅素使IL-1β誘導損傷的軟骨細胞中TNF-α、IL-6質(zhì)量濃度均減少，IL-10質(zhì)量濃度增加；Western blot實驗也表明楊梅素能使IL-1β誘導損傷的軟骨細胞中PI3K、AKT、NF-κB P65、IKKαβ、IKBα蛋白的磷酸化程度均下調(diào)，IKBα蛋白表達上調(diào).為了進一步證實楊梅素對骨性關(guān)節(jié)炎的治療作用，本研究進行了體內(nèi)實驗，Masson結(jié)果顯示：楊梅素使受損的軟骨細胞形態(tài)變規(guī)則，軟骨組織的膠原纖維排列變緊密；同時使大鼠關(guān)節(jié)液中TNF-α、IL-6質(zhì)量濃度均減少，IL-10質(zhì)量濃度增加.因此，楊梅素可促進軟骨細胞增殖，抑制軟骨細胞的凋亡，抑制骨性關(guān)節(jié)炎炎癥反應(yīng)，抑制PI3K/AKT/NF-κB信號通路的激活，明顯緩解關(guān)節(jié)軟骨的退變，降低骨性關(guān)節(jié)炎的進展水平，對骨性關(guān)節(jié)炎有一定的治療作用.

綜上所述，楊梅素能延緩骨性關(guān)節(jié)炎軟骨的退變，改善關(guān)節(jié)軟骨代謝.骨性關(guān)節(jié)炎的病理發(fā)展與PI3K/AKT/NF-κB信號通路存在緊密的聯(lián)系，楊梅素可能通過抑制PI3K/AKT/NF-κB信號通路來促進軟骨細胞增殖、抑制軟骨細胞的凋亡、抑制骨性關(guān)節(jié)炎炎癥反應(yīng)，在骨性關(guān)節(jié)炎的治療中有廣泛的應(yīng)用前景.但是，楊梅素是否通過其他通路對該病有緩解作用，需要進一步的研究.