穩(wěn)定表達(dá) Cytoglobin的肝細(xì)胞株LO-2的 建立及生長(zhǎng)增殖的變化

王哲彥,陳柏洪,續(xù)艷梅,劉詩(shī)俐,張梓榮,董文其

(1.南方醫(yī)科大學(xué) 檢驗(yàn)與生物技術(shù)學(xué)院，廣東 廣州 510080;2.中山大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510275)

細(xì)胞珠蛋白(cytoglobin，CYGB)是2002年日本科學(xué)家在大鼠纖維化肝臟的星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells，HSC)里首次發(fā)現(xiàn)[1]的、哺乳動(dòng)物球蛋白家族中的一員，具有190個(gè)氨基酸殘基，在體內(nèi)有攜氧、運(yùn)輸氧氣的作用.另有研究發(fā)現(xiàn)，在肝臟氧化應(yīng)激的情況下，CYGB表達(dá)增多，降低活性氧對(duì)肝臟的損傷，體現(xiàn)了其作為一種細(xì)胞內(nèi)抗氧化蛋白的作用[2]；CYGB參與一氧化氮的解毒[3]，具有一氧化氮雙加氧酶的作用，在調(diào)節(jié)血管張力以及相關(guān)疾病方面起關(guān)鍵作用[4]；此外，CYGB也被認(rèn)為可以保護(hù)細(xì)胞，減少氧自由基介導(dǎo)的DNA損傷和細(xì)胞功能的破壞[5]；本實(shí)驗(yàn)室的前期工作證實(shí)，CYGB 對(duì)大鼠脂肪肝、肝纖維化有一定的治療作用[6-7].但是其具體作用機(jī)制尚未明確，為了探究CYGB在肝臟中的作用和分子機(jī)制，本研究利用慢病毒系統(tǒng)建立了穩(wěn)定表達(dá)CYGB的人肝細(xì)胞LO-2細(xì)胞系，使LO-2細(xì)胞在長(zhǎng)期且穩(wěn)定表達(dá)CYGB的環(huán)境中生長(zhǎng)，并且利用CCK-8試劑盒以及流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)穩(wěn)定表達(dá)CYGB對(duì)LO-2細(xì)胞的生長(zhǎng)影響，為深入研究CYGB在肝臟中的作用以及分子機(jī)制建立了理想的細(xì)胞模型，進(jìn)而探究CYGB 對(duì)肝臟功能以及相關(guān)代謝性疾病的作用以及其分子機(jī)制.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人腎上皮細(xì)胞HEK293T由本實(shí)驗(yàn)室凍存；人肝細(xì)胞LO-2由本實(shí)驗(yàn)室凍存；慢病毒表達(dá)載體質(zhì)粒Plenti-N-GFP，包裝質(zhì)粒pMD2.G以及psPAX2由本實(shí)驗(yàn)室保存；真核表達(dá)載體 pCMV-MYC-CYGB由本實(shí)驗(yàn)室保存.

1.1.2 試劑

無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒小提中量試劑盒(#R6565)購(gòu)自天根；PrimeSTAR? GXL DNA Polymerase (#R050Q)購(gòu)自TAKARA；LR酶購(gòu)自Thermofisher；CCK8試劑盒(CK04) 購(gòu)自日本同仁，DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自GIBICO；胎牛血清購(gòu)自GIBICO；L-谷氨酰胺購(gòu)自SIGMA；質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%胰蛋白酶溶液(含EDTA)購(gòu)自GIBICO；NotⅠ限制性內(nèi)切酶和AscⅠ限制性內(nèi)切酶均購(gòu)自Thermofisher；LIPOFECTAMINE 2000 REAGENT 1.5 mL購(gòu)自Thermofisher；Annexin V-APC/7AAD Apoptosis Detection Kit試劑盒購(gòu)自聯(lián)科生物公司.

1.1.3 儀器

PCR儀購(gòu)自BIOMETRA，流式細(xì)胞儀購(gòu)自BAKEMAN，熒光顯微鏡、垂直電泳槽、半干轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜儀均購(gòu)自BIO-RAD，化學(xué)發(fā)光儀購(gòu)自GE、酶標(biāo)儀購(gòu)自BIO-TEK，水平電泳槽購(gòu)自BAYGENE，BD AccuriC6流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司.

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)CYGB的編碼序列設(shè)計(jì)引物見(jiàn)表1，在5′端和3′端分別添加NotⅠ和AscⅠ的酶切位點(diǎn)，委托北京擎科生物公司合成.

表1 擴(kuò)增目的片段CYGB的引物序列Table 1 Primer sequences of CYGB

1.2.2 慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建

利用PCR技術(shù)以pCMV-MYC-CYGB載體為模板，上游引物F以及下游引物R擴(kuò)增目的基因CYGB，通過(guò)雙酶切、連接，構(gòu)建Pentr-CYGB中間載體，再利用GATEWAY克隆技術(shù)LR反應(yīng)系統(tǒng)將Pentr-CYGB中間載體中的目的片段重組連接到目的載體Plenti-N-GFP上，構(gòu)建慢病毒表達(dá)載體Plenti-N-GFP-CYGB.

1.2.3 慢病毒的包裝

將慢病毒載體質(zhì)粒Plenti-N-GFP-CYGB、包裝質(zhì)粒pMD2.G以及psPAX按4∶1∶3的體積比混勻，使用LipofectamineTM2000 Transfection Reagent共轉(zhuǎn)至細(xì)胞株匯合度達(dá)60%的HEK293T細(xì)胞中，在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別收集48、72 h的培養(yǎng)上清(含病毒顆粒)，1 000 r/min離心5 min，0.45 μm針頭濾器過(guò)濾，4 ℃、14 000 r/min高速冷凍離心2.5 h，棄上清用1 mL PBS溶解沉淀，0.22 μm針頭濾器過(guò)濾，使用終點(diǎn)稀釋法測(cè)定病毒滴度.同時(shí)，設(shè)置陰性對(duì)照組，利用同樣的方法構(gòu)建、收集含有Plenti-N-GFP的病毒顆粒.

1.2.4 含有CYGB編碼序列的慢病毒顆粒感染LO-2細(xì)胞

將用DMEM完全培養(yǎng)基(含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清)培養(yǎng)的HEK293T細(xì)胞，以1×106/孔LO-2細(xì)胞接種于6孔板中，12 h后每孔加入200 μL的慢病毒濃縮液，48 h后更換新鮮完全培養(yǎng)基(DMEM)，72 h后在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光.

1.2.5 篩選穩(wěn)定表達(dá)GFP的LO-2細(xì)胞

在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)的表達(dá)情況，利用流式細(xì)胞分選系統(tǒng)將單個(gè)細(xì)胞分至96孔板中培養(yǎng)，挑選熒光較強(qiáng)的細(xì)胞進(jìn)行繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng).將DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)的LO-2-GFP細(xì)胞和LO-2-GFP-CYGB細(xì)胞設(shè)為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組.

1.2.6 Western blot檢測(cè)鑒定CYGB的表達(dá)

將陰性對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞接種于6孔板中，48 h后用PBS清洗細(xì)胞，并用細(xì)胞裂解液cell lysis buffer裂解細(xì)胞，4 ℃、12 000 r/min離心6 min，收集上清保存于-20 ℃.測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度后，每組各取20 μg蛋白樣品(上述的細(xì)胞裂解產(chǎn)物)，加入4倍質(zhì)量濃度的上樣緩沖液，100 ℃金屬浴10 min后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，使用半干轉(zhuǎn)儀進(jìn)行半干轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，常溫封閉1 h，分別加入Anti-Tubulin和Anti-CYGB的抗體4 ℃孵育過(guò)夜，次日TBST洗膜3次，用辣根過(guò)氧化物(HRP)羊抗鼠IgG抗體室溫孵育1 h，TBST洗膜4次，滴加化學(xué)發(fā)光液，并記錄發(fā)光條帶，保存圖像.

1.2.7 CCK-8法檢測(cè)CYGB對(duì)LO-2的生長(zhǎng)增殖影響

對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組分別以4 000/孔接種于96孔板中，每組6個(gè)復(fù)孔，4 h后細(xì)胞貼壁設(shè)為零點(diǎn)，每孔加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃孵育1 h顯色，用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)定吸光度，并在同樣的條件下每隔24 h測(cè)定一次吸光度，最后采用Graphpad軟件對(duì)每組的光密度D450 nm繪制增殖曲線，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間采用單因素方差分析，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.

1.2.8 流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)CYGB對(duì)LO-2細(xì)胞凋亡的影響

對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組分別以1×106/孔接種于6孔板中，每組3個(gè)復(fù)孔，在細(xì)胞孵箱中37 ℃培養(yǎng)，用胰酶消化后，1 000 r/min離心5 min收集細(xì)胞，棄上清，用預(yù)冷PBS洗細(xì)胞兩次.加入Binding Buffer重懸細(xì)胞，使細(xì)胞為1.0×106/mL.吸取100 μL上述細(xì)胞懸液到另一離心管中，依次加入5 μL APC-AnnexinV、10 μL 7AAD，輕混勻后，室溫(25 ℃)避光反應(yīng)15 min.每管加入380 μL Binding Buffer，上機(jī)進(jìn)行流式分析.選擇合適的通道(FL4通道檢測(cè)APC，F(xiàn)L3通道檢測(cè)7AAD).觀察每組的細(xì)胞凋亡百分比，比較兩組間的凋亡情況.

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增目的基因CYGB

利用PCR技術(shù)以pCMV-MYC-CYGB載體為模板，上游引物F以及下游引物R擴(kuò)增目的基因CYGB(573 bp)，在500 bp到750 bp中間明顯有較亮條帶(圖1)，大小與預(yù)期目的條帶相符.

2.2 重組載體酶切鑒定以及測(cè)序結(jié)果

用NotⅠ和AscⅠ限制酶酶切慢病毒重組質(zhì)粒Plenti-N-GFP-CYGB，酶切產(chǎn)物電泳結(jié)果中可以看到在500～700 bp之間的位置有明顯條帶(圖2)，與預(yù)期條帶大小相符合；重組載體Plenti-N-GFP-CYGB測(cè)序結(jié)果，測(cè)序片段與預(yù)測(cè)的目的基因CYGB序列完全匹配(圖3).

M：D2000標(biāo)記物;a：PCR產(chǎn)物M:D2000Marker;a:PCR product圖1 PCR擴(kuò)增目的基因CYGB1 Amplification of the target gene CYGB by PCR

M：D2000標(biāo)記物；a：雙酶切產(chǎn)物M:D2000Marker;a:double digestion product圖2 Plenti-N-GFP-CYGB酶切產(chǎn)物2 Plenti-N-GFP-CYGB digestion product

2.3 HEK293T轉(zhuǎn)染三質(zhì)粒GFP表達(dá)情況

HEK293T轉(zhuǎn)染三質(zhì)粒48 h后，在熒光顯微鏡100倍下觀察LO-2細(xì)胞GFP表達(dá)情況，綠色熒光表明含目的基因的質(zhì)粒已轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)并成功表達(dá)熒光蛋白GFP(圖4).

2.4 LO-2細(xì)胞GFP表達(dá)情況

含目的片段CYGB編碼序列的慢病毒顆粒(病毒滴度為5×104TU/mL)感染人肝細(xì)胞LO-2，流式細(xì)胞分選儀篩選后,在熒光顯微鏡100倍下觀察細(xì)胞熒光表達(dá)情況，實(shí)驗(yàn)組大部分細(xì)胞均表達(dá)了目的蛋白與熒光蛋白的融合蛋白，獲得穩(wěn)定表達(dá)CYGB的LO-2細(xì)胞，陰性對(duì)照組大部分細(xì)胞均表達(dá)了熒光蛋白GFP(圖5).

2.5 Western blot檢測(cè)鑒定CYGB的表達(dá)情況

裂解細(xì)胞獲得的細(xì)胞總蛋白Western blot鑒定結(jié)果：內(nèi)參為β-Tubulin;在相對(duì)分子量(Mr)為48×103處，實(shí)驗(yàn)組LO-2-GFP-CYGB出現(xiàn)明顯條帶，陰性對(duì)照組LO-2-GFP未出現(xiàn)條帶(圖6)，表明實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞表達(dá)了GFP(Mr約27×103)與CYGB(Mr約21×103)的融合蛋白，結(jié)果與預(yù)期蛋白大小相符.

2.6 LO-2細(xì)胞生長(zhǎng)增殖曲線

CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的情況，繪制生長(zhǎng)增殖曲線(圖7).在兩組細(xì)胞(每組6復(fù)孔)剛貼壁設(shè)為零點(diǎn)時(shí)和生長(zhǎng)第24 h時(shí)，比較兩組細(xì)胞光密度值，兩組間增殖速率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(0 h:P>0.05;24 h:P>0.05)，在細(xì)胞生長(zhǎng)48、72、96 h時(shí)，P<0.01，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，穩(wěn)定過(guò)表達(dá)CYGB實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的增長(zhǎng)速率小于陰性對(duì)照組細(xì)胞的增殖速率.

A：轉(zhuǎn)染Plenti-N-GFP-CYGB的HEK293T細(xì)胞(明場(chǎng)) B：轉(zhuǎn)染Plenti-N-GFP-CYGB的HEK293T細(xì)胞(熒光) ;C：轉(zhuǎn)染Plenti-N-GFP的HEK293T細(xì)胞(明場(chǎng));D：轉(zhuǎn)染Plenti-N-GFP的HEK293T細(xì)胞(熒光)
A:HEK293T cells transfected with Plenti-N-GFP-CYGB (Bright field);B:HEK293T cells transfected with Plenti-N-GFP-CYGB (Fluorescence);C:HEK293T cells transfected with Plenti-N-GFP (Bright field);D:HEK293T cells transfected with Plenti-N-GFP (Fluorescence)
圖4 HEK293T轉(zhuǎn)染三質(zhì)粒48 h后細(xì)胞GFP表達(dá)結(jié)果
Fig.4 Results of green fluorescent protein GFP expression after transfection of three plasmids in HEK293T for 48 h

A：實(shí)驗(yàn)組穩(wěn)定表達(dá)CYGB的LO-2細(xì)胞(明場(chǎng));B：實(shí)驗(yàn)組穩(wěn)定表達(dá)CYGB的LO-2細(xì)胞(熒光);C：陰性對(duì)照組LO-2細(xì)胞(明場(chǎng));D：陰性對(duì)照組LO-2細(xì)胞(熒光)
A:LO-2 cells stably expressing CYGB( Bright field );B:LO-2 cells stably expressing CYGB(Fluorescence);C:Control group( Bright field );D:Control group(Fluorescence)
圖5 經(jīng)流式細(xì)胞儀篩選后的細(xì)胞GFP表達(dá)情況結(jié)果
Fig.5 Results of green fluorescent protein expression GFP after screening by flow cytometry

M：標(biāo)記物；a：實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞LO-2-GFP-CYGB；b：陰性對(duì)照組細(xì)胞LO-2-GFP.
M:Marker;a:Test group;b:Control group.
圖6 鑒定蛋白表達(dá)情況的Western blot結(jié)果
Fig.6 The western blot results of protein expression

1)與陰性對(duì)照組比較,P<0.01.
1)Compared with negative control group,P<0.01.
圖7 CCK-8法測(cè)定生長(zhǎng)增殖曲線
Fig.7 Determination of growth and proliferation curve by CCK-8 method

2.7 CYGB對(duì)LO-2細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)各組LO-2細(xì)胞凋亡的情況(圖8)；實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的凋亡百分比高于陰性對(duì)照組細(xì)胞的凋亡百分比.流式檢測(cè)結(jié)果顯示，穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞組的細(xì)胞凋亡百分比高于陰性對(duì)照組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05).

1)與對(duì)照組比較，P<0.05.
A：實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞LO-2-GFP-CYGB凋亡情況；B：陰性對(duì)照組細(xì)胞LO-2-GFP凋亡情況；C：對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡百分比.
1)Compared with the control group,P<0.05.
A:Apoptosis of LO-2-GFP-CYGB cells in experimental group;B:Apoptosis of LO-2-GFP cells in negative control group;C:Percentage of apoptosis in control group and experimental group.
圖8 CYGB對(duì)LO-2細(xì)胞凋亡的影響
Fig.8 Effect of CYGB on apoptosis of LO-2 cell

3 討論

CYGB[8]屬于球蛋白家族成員之一，六配位體血紅素單體蛋白質(zhì)，廣泛存在于哺乳動(dòng)物組織中.CYGB具備球蛋白的生物特性，能可逆結(jié)合O2、CO等氣體配體[9],參與體內(nèi)氧氣運(yùn)輸.近年來(lái)，發(fā)現(xiàn)CYGB與肝硬化以及肝纖維化的發(fā)生發(fā)展有關(guān)；可促進(jìn)氧在組織中的擴(kuò)散，清除一氧化氮或活性氧，并在細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時(shí)起保護(hù)作用[10]，且與體內(nèi)的NO的代謝有關(guān)[11]；有研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤的發(fā)生發(fā)展[12-14]與其在體內(nèi)的甲基化現(xiàn)象有關(guān)[5,15-16];另外有文獻(xiàn)報(bào)道，其在器官發(fā)育發(fā)展也可能起到重要作用[17].

在本實(shí)驗(yàn)室的前期研究中，發(fā)現(xiàn)CYGB有逆轉(zhuǎn)大鼠的肝纖維化[6]以及動(dòng)脈粥樣硬化的作用，尤其是氧化應(yīng)激引起的纖維化[18-19]，在氧化應(yīng)激的情況下，CYGB表達(dá)增加，起到保護(hù)細(xì)胞的作用[20].多項(xiàng)研究表明CYGB在肝臟的病理狀態(tài)下表達(dá)增加，如在肝纖維化中，起到了保護(hù)細(xì)胞的作用.結(jié)合實(shí)驗(yàn)室前期工作，CYGB有逆轉(zhuǎn)大鼠肝纖維化的作用，肝臟中主要以肝細(xì)胞為主，本研究在人肝細(xì)胞LO-2細(xì)胞中過(guò)表達(dá)CYGB，初步觀察CYGB對(duì)肝細(xì)胞的影響.以此為基礎(chǔ)，進(jìn)一步探究其機(jī)制以及發(fā)現(xiàn)其在肝臟中更多的作用.

由于在細(xì)胞內(nèi)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染帶有目的基因的質(zhì)粒無(wú)法將目的片段整合在細(xì)胞染色體上，容易在后續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中丟失，無(wú)法持續(xù)表達(dá)CYGB，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中僅能觀察其短期作用.但是基因是長(zhǎng)期存在于細(xì)胞內(nèi)的，多數(shù)疾病的發(fā)生發(fā)展也是與相關(guān)基因的長(zhǎng)期作用和參與有關(guān).為了觀察CYGB基因及其蛋白在細(xì)胞內(nèi)的長(zhǎng)期作用，進(jìn)一步探索CYGB的作用及機(jī)制，本研究選擇了利用慢病毒介導(dǎo)的細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染技術(shù)建立穩(wěn)定表達(dá)CYGB的LO-2肝細(xì)胞株.

本研究以人肝細(xì)胞LO-2為研究對(duì)象，通過(guò)Gateway克隆技術(shù)構(gòu)建了重組慢病毒表達(dá)載體Plenti-N-GFP-CYGB，通過(guò)病毒包裝、濃縮，得到慢病毒顆粒，并感染人肝細(xì)胞LO-2，經(jīng)過(guò)流式細(xì)胞術(shù)篩選，建立LO-2穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，通過(guò)Western blotting檢測(cè)LO-2中CYGB過(guò)表達(dá)情況.利用CCK-8法觀察過(guò)表達(dá)CYGB對(duì)LO-2細(xì)胞生長(zhǎng)影響，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)增殖曲線，利用統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，LO-2穩(wěn)定過(guò)表達(dá)CYGB實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞生長(zhǎng)增殖速度比LO-2正常表達(dá)CYGB組的生長(zhǎng)增殖速度低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)各組LO-2細(xì)胞凋亡的情況，穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞組的細(xì)胞凋亡百分比高于陰性對(duì)照組(P<0.05)，提示CYGB可能抑制LO-2細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖，并通過(guò)促進(jìn)LO-2細(xì)胞的凋亡從而抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖.有文獻(xiàn)報(bào)道CYGB與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，過(guò)表達(dá)CYGB基因可抑制肺癌、乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)[5,21]，本研究結(jié)果顯示CYGB過(guò)表達(dá)會(huì)引起LO-2細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖速度減慢，可能與此有關(guān).

另外，在實(shí)驗(yàn)室的前期工作中發(fā)現(xiàn)，分別提取正常大鼠、酒精性脂肪肝大鼠、CYGB治療酒精性脂肪肝大鼠、肝纖維化大鼠、CYGB治療肝纖維化大鼠的肝臟組織蛋白及大鼠血清，利用雙向電泳篩選出了多個(gè)差異表達(dá)蛋白[6,22]，其中多個(gè)與細(xì)胞生長(zhǎng)增殖、分化、凋亡相關(guān)，如TGF-β(轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β)[23]、Bdnf(腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子)等，與上述LO-2穩(wěn)定過(guò)表達(dá)CYGB實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖速度比陰性對(duì)照組細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖速度低的結(jié)論相關(guān)，提示我們CYGB可能通過(guò)與這些相關(guān)因子相互作用，抑制肝細(xì)胞生長(zhǎng)增殖.

本研究為驗(yàn)證CYGB與其相互作用蛋白的關(guān)系提供細(xì)胞模型，為進(jìn)一步探究CYGB 對(duì)肝臟功能以及相關(guān)代謝性疾病的作用以及其分子機(jī)制提供依據(jù).