TGF-β1在人前列腺上皮細(xì)胞炎癥過(guò)程中的表達(dá)機(jī)制及意義

黃敏玉，黃華武，黃群，吳軍，覃天資，孟冬冬，龍毅

(右江民族醫(yī)學(xué)院 附屬醫(yī)院 泌尿外科，廣西 百色 533000)

慢性前列腺炎(chronic prostatitis,CP)是一種由各種病因引發(fā)的前列腺組織的慢性炎癥反應(yīng)，為泌尿外科較常見(jiàn)的疾病之一，主要好發(fā)于青、中年男性，臨床表現(xiàn)以下腹疼痛、墜脹及尿道刺激癥狀為主，其臨床原因可大致分為慢性細(xì)菌性前列腺炎(chronic bacterial prostatitis,CBP)和慢性非細(xì)菌性前列腺炎(chronic nonbacterial prostatitis,CNP)兩種[1].研究表明，約10%男性出現(xiàn)前列腺炎癥反應(yīng)癥狀，但細(xì)菌性前列腺炎發(fā)生率僅為7%左右，臨床中以慢性非細(xì)菌性前列腺炎為主要類型[2].前列腺區(qū)域非細(xì)菌性炎癥是指由免疫、神經(jīng)內(nèi)分泌紊亂及精神心理狀態(tài)異常等諸多因素所引發(fā)的炎癥性反應(yīng)病變，而前列腺是男性生殖系統(tǒng)中最大的腺體，在生殖過(guò)程中扮演重要角色，因此CP除了給患者帶來(lái)前列腺區(qū)域不適癥狀外，還是引發(fā)男性不育的主要高危因素.有研究指出CNP與精液質(zhì)量下降有密切關(guān)系，導(dǎo)致男性不育的發(fā)生率可高達(dá)5.1%～25.7%[3].但目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)于CNP所致男性不育的具體機(jī)制尚未達(dá)成共識(shí)，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)在前列腺炎癥組織中高表達(dá)[4].因此，本研究通過(guò)采用人前列腺上皮細(xì)胞P69細(xì)胞構(gòu)建炎癥細(xì)胞模型，探討炎癥刺激誘導(dǎo)下TGF-β1的表達(dá)機(jī)制，為CNP所致生精功能障礙提供相關(guān)的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人前列腺上皮細(xì)胞P69細(xì)胞購(gòu)自上海酶研生物科技有限公司.脂多糖購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司;質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%的胰蛋白酶、Hanks液、DMSO、RPMI1640培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司；miRNA快速提取試劑盒(離心柱式)購(gòu)自上海雅吉生物科技有限公司；Real time PCR試劑盒購(gòu)自德國(guó)QIAGEN公司；蛋白提取及測(cè)定試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Abbiotec公司；兔抗c-Myb單抗、兔抗TGF-β1單抗均購(gòu)自上海Abcam公司.所用引物均由廣州吉賽生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成，引物序列詳見(jiàn)表1.

超凈工作臺(tái)(BCM-1600A)為北京中科星宇有限公司產(chǎn)品；低溫離心機(jī)、分子顯影儀均為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；PCR擴(kuò)增儀為美國(guó)ABI公司產(chǎn)品；實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增儀為瑞士羅氏公司產(chǎn)品.

表1 引物序列Table 1 Sequences of primers

1.2 研究方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和炎癥模型構(gòu)建

含有體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基、37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2無(wú)菌培養(yǎng)箱中體外培養(yǎng)P69細(xì)胞，待細(xì)胞生長(zhǎng)覆蓋85%培養(yǎng)瓶底面積時(shí)行傳代處理，傳代4～5次后培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%的胰蛋白酶消化后收集細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞為1×106/mL.將P69細(xì)胞均勻接種于24孔培養(yǎng)板上，每孔2 mL，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組6個(gè)復(fù)孔.其中實(shí)驗(yàn)組采用脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)進(jìn)行誘導(dǎo)處理構(gòu)建炎癥模型[5]，LPS終質(zhì)量濃度為0.02 μg/mL；對(duì)照組加入等量的DMEM培養(yǎng)基.隨后培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h.

1.2.2 炎癥因子水平檢測(cè)

質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%的胰蛋白酶消化兩組細(xì)胞，4 ℃下4 000 r/min離心10 min，取上清液.采用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、白細(xì)胞介素-10(interleukin-10，IL-10)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的含量水平.

1.2.3 Western Blot法測(cè)定c-Myb和TGF-β1蛋白表達(dá)水平

將兩組細(xì)胞懸液于4 ℃ 2 000 r/min離心5 min，棄去上清，預(yù)冷的PBS液洗滌1次，加入200 μL RIPA裂解液震蕩混勻，冰浴裂解5 min，4 ℃低溫離心機(jī)中8 000 r/min離心10 min，棄上清.制備質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的SDS-PAGE凝膠對(duì)目的蛋白c-Myb和TGF-β1進(jìn)行電泳分離，電泳電壓參數(shù)設(shè)置為濃縮膠80 V，分離膠120 V.濕轉(zhuǎn)法將凝膠蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，經(jīng)麗春紅染色、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的脫脂牛奶封閉，室溫下?lián)u床震蕩2 h，一抗c-Myb(Vc-Myb∶V抗體稀釋液=1∶1 000)、TGF-β1(VTGF-β1∶V抗體稀釋液=1∶5 000)4 ℃孵育過(guò)夜；TBST漂洗3次后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(V二抗∶V抗體稀釋液=1∶1 500)避光孵育1 h；顯影液處理后進(jìn)行目的蛋白顯影，通過(guò)各條帶灰度分析蛋白表達(dá)水平.

1.2.4 Real time PCR法測(cè)定hsa-miR-150的mRNA表達(dá)水平

采用RNAeasy試劑盒分離純化兩組細(xì)胞的總RNA，使用miScript II RT Kit進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA.在 0.2 mL PCR 管中配制反應(yīng)溶液，震蕩混勻后置于PCR儀上進(jìn)行Real time PCR反應(yīng)，總反應(yīng)體積為25 μL，其中Premix Taq 12.5 μL，cDNA 2.0 μL，上下游引物分別為0.5 μL，設(shè)置反應(yīng)條件：5 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，40個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s、60 ℃ 15 s、95 ℃ 15 s進(jìn)行溶解曲線分析，應(yīng)用2-ΔΔCt方法計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量.每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.

1.2.5 hsa-miR-150激動(dòng)劑和抑制劑處理后c-Myb和TGF-β1的mRNA表達(dá)水平

hsa-miR-150激動(dòng)劑hsa-miR-150-mimic和hsa-miR-150抑制劑hsa-miR-150-inhibitor均委托上海生工生物科技公司合成.將兩組細(xì)胞懸液分別接種于24孔板中，每組3個(gè)復(fù)孔.首先通過(guò)qPCR法測(cè)定兩組細(xì)胞中c-Myb和TGF-β1的mRNA含量水平，隨后進(jìn)行激動(dòng)劑預(yù)處理，分別向各孔中加入hsa-miR-150-mimic 10 μL，37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2恒溫箱中培養(yǎng)24 h后，檢測(cè)c-Myb 和TGF-β1的mRNA表達(dá)水平.hsa-miR-150抑制劑處理方法同激動(dòng)劑，根據(jù)處理前后目的蛋白的mRNA表達(dá)水平評(píng)價(jià)反應(yīng)效果.

1.2.6 免疫熒光染色觀察c-Myb和TGF-β1的蛋白表達(dá)水平

收集兩組細(xì)胞懸液2 mL EP管中，2 000 r/min離心5 min后棄上清，PBS洗滌2次后重懸細(xì)胞并接種于24孔板中，1 500 r/min離心5 min，吸取上清，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛室溫下固定20 min，隨后每孔加入Triton100 體積150 μL靜置15 min破膜，PBS洗滌后10%羊血清封閉15 min.加入兔抗c-Myb單抗(Vc-Myb∶V抗體稀釋液=1∶100)、鼠抗TGF-β1單抗(VTGF-β1∶V抗體稀釋液=1∶150)，每孔100 μL，4 ℃孵育過(guò)夜.PBS洗滌后加入FITC標(biāo)記的羊抗兔二抗(V二抗∶V抗體稀釋液=1∶100)、Tritc標(biāo)記的羊抗鼠二抗(V二抗∶V抗體稀釋液=1∶100)，室溫下避光孵育4 h，PBS洗滌3次后重懸細(xì)胞，采用熒光共聚焦顯微鏡觀察染色結(jié)果.

1.2.7 抑制c-Myb后檢測(cè)TGF-β1的mRNA表達(dá)水平

c-Myb抑制劑c-Myb-inhibitor委托上海生工生物科技公司合成.收集兩組細(xì)胞懸液分別接種于24孔板中，每組6個(gè)復(fù)孔.在處理前通過(guò)qPCR法測(cè)定兩組細(xì)胞前3個(gè)孔中TGF-β1的mRNA表達(dá)水平；同樣在兩組細(xì)胞其余3孔中加入c-Myb-inhibitor 10 μL進(jìn)行抑制處理，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，依照qPCR操作流程檢測(cè)處理后TGF-β1的mRNA表達(dá)水平.

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 炎癥因子水平分析

酶聯(lián)免疫法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組IL-6、IL-10和TNF-α水平均較對(duì)照組明顯升高(t=21.260、14.392、12.303，P=0.000、0.000、0.000，表2)，表明P69細(xì)胞經(jīng)脂多糖處理后可生成炎癥因子，炎癥模型構(gòu)建成功.

表2 兩組細(xì)胞炎癥因子水平結(jié)果Table 2 Results of cytokine levels in two groups

2.2 c-Myb和TGF-β1的蛋白表達(dá)情況

以β-actin為內(nèi)參，實(shí)驗(yàn)組c-Myb和TGF-β1的蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組升高，提示在前列腺細(xì)胞炎癥反應(yīng)過(guò)程中，可增加c-Myb和TGF-β1蛋白的表達(dá)(圖1).

圖1 兩組細(xì)胞c-Myb和TGF-β1蛋白表達(dá)情況

Fig.1 The protein expression of c-Myb and TGF-β1 in two groups

2.3 hsa-miR-150的mRNA表達(dá)情況

通過(guò)RT-PCR法對(duì)兩組hsa-miR-150表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果提示，實(shí)驗(yàn)組的mRNA水平明顯高于對(duì)照組(t=4.879，P=0.008)，表明炎癥刺激可增強(qiáng)hsa-miR-150的mRNA表達(dá)(圖2).

2.4 hsa-miR-150激動(dòng)劑及抑制劑處理后hsa-miR-150、c-Myb和TGF-β1的表達(dá)變化

兩組細(xì)胞基線狀態(tài)下hsa-miR-150、c-Myb和TGF-β1的mRNA表達(dá)水平分別比較，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，實(shí)驗(yàn)組表達(dá)水平均較對(duì)照組升高(t=2.631、10.599、4.301，P=0.021、0.007、0.013).

1)P<0.01.
圖2 兩組細(xì)胞hsa-miR-150的mRNA表達(dá)情況
Fig.2 The mRNA expression ofhsa-miR-150in two groups

hsa-miR-150激動(dòng)劑處理后，實(shí)驗(yàn)組hsa-miR-150、c-Myb和TGF-β1的mRNA表達(dá)水平與處理前比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=0.764、3.783、-1.040，P=0.437、0.162、0.357)；對(duì)照組hsa-miR-150、c-Myb、TGF-β1的表達(dá)水平均較處理前升高(t=-3.116、-6.766、-8.387，P=0.004、0.020、0.001)；處理后兩組間hsa-miR-150、c-Myb和TGF-β1的表達(dá)水平比較，結(jié)果均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=3.538、0.025、0.824，P=0.219、0.983、0.456，圖3).

A:兩組細(xì)胞經(jīng)hsa-miR-150-mimic處理后c-MybmRNA表達(dá)情況；B:經(jīng)hsa-miR-150-mimic處理后TGF-β1mRNA表達(dá)情況；1)P<0.05，2)P<0.01.
A:The mRNA expression ofc-Mybafter hsa-miR-150-mimic treatment in two groups;B:The mRNA expression ofTGF-β1after hsa-miR-150-mimic treatment;1)P<0.05,2)P<0.01.
圖3 hsa-miR-150-mimic處理后兩組細(xì)胞c-Myb和TGF-β1的mRNA表達(dá)情況
Fig.3 The mRNA expression ofc-MybandTGF-β1in two groups of cells after hsa-miR-150-mimic treatment

hsa-miR-150抑制劑處理后，實(shí)驗(yàn)組hsa-miR-150、c-Myb和TGF-β1的mRNA表達(dá)水平與處理前比較均降低(t=-2.859、8.497、4.038，P=0.017、0.001、0.016)；對(duì)照組hsa-miR-150、c-Myb和TGF-β1的表達(dá)水平較處理前無(wú)明顯改變(t=4.313、2.620、1.075，P=0.423、0.059、0.343)；處理后兩組間hsa-miR-150表達(dá)結(jié)果比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=2.558，P=0.395)，而兩組間c-Myb和TGF-β1的表達(dá)水平分別比較，結(jié)果均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=4.241、3.673，P=0.049、0.021，圖4).

A:兩組細(xì)胞經(jīng)hsa-miR-150-inhibitor處理后c-MybmRNA表達(dá)情況；B:經(jīng)hsa-miR-150-inhibitor處理后TGF-β1mRNA表達(dá)情況；1)P<0.05，2)P<0.01.
A:The mRNA expression of c-Myb after hsa-miR-150-inhibitor treatment in two groups;B:The mRNA expression of TGF-β1 after hsa-miR-150-inhibitor treatment;1)P<0.05,2)P<0.01.
圖4 hsa-miR-150-inhibitor處理后兩組細(xì)胞c-Myb和TGF-β1的mRNA表達(dá)情況
Fig.4 The mRNA expression ofc-MybandTGF-β1in two groups of cells after hsa-miR-150-inhibitor treatment

2.5 hsa-miR-150激動(dòng)劑及抑制劑處理后c-Myb和TGF-β1的免疫熒光結(jié)果改變

熒光共聚焦顯微鏡下，c-Myb蛋白表達(dá)呈綠色熒光，TGF-β1表達(dá)呈紅色熒光.經(jīng)hsa-miR-150-mimic處理后，對(duì)照組c-Myb和TGF-β1的熒光強(qiáng)度均較實(shí)驗(yàn)組增強(qiáng)，提示對(duì)照組兩指標(biāo)蛋白表達(dá)水平均高于實(shí)驗(yàn)組；經(jīng)hsa-miR-150-inhibitor處理后，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組c-Myb和TGF-β1的熒光強(qiáng)度均較hsa-miR-150-mimic處理后水平降低，但此時(shí)實(shí)驗(yàn)組熒光水平仍較對(duì)照組升高，提示對(duì)照組兩指標(biāo)蛋白表達(dá)水平均低于實(shí)驗(yàn)組(圖5).

A:hsa-miR-150-mimic處理后，實(shí)驗(yàn)組c-Myb和TGF-β1熒光表達(dá)較對(duì)照組降低；B:hsa-miR-150-inhibitor處理后，實(shí)驗(yàn)組c-Myb和TGF-β1表達(dá)較對(duì)照組增強(qiáng).
A：after hsa-mir-150-mimic treatment，the fluorescence expression of c-Myb and TGF-beta 1 in experimental group were lower than that in control group；B:after hsa-mir-150-inhibitor treatment,the fluorescence expression of c-Myb and TGF-beta 1 in experimental group were higher than that in control group.
圖5 兩組細(xì)胞經(jīng)激動(dòng)劑和抑制劑處理后鏡下免疫熒光結(jié)果(×20)
Fig.5 Microscopic immunofluorescence results of two groups of cells treated with agonists and inhibitors(×20)

2.6 抑制c-Myb后TGF-β1的mRNA表達(dá)情況

基線狀態(tài)下實(shí)驗(yàn)組c-Myb和TGF-β1的mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組升高，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.837、6.073，P=0.026、0.004)；c-Myb-inhibitor抑制處理后，實(shí)驗(yàn)組c-Myb表達(dá)水平較處理前明顯降低(t=0.752，P=0.008)，對(duì)照組c-Myb表達(dá)水平較處理前無(wú)明顯變化，此時(shí)兩組間表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.113，P=0.396).不僅如此，c-Myb抑制劑處理后，實(shí)驗(yàn)組TGF-β1表達(dá)水平較處理前出現(xiàn)降低，對(duì)照組表達(dá)水平與處理前比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；兩組間表達(dá)水平差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=4.111，P=0.015，圖6)，實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組表達(dá)水平高.

1)P<0.05，2)P<0.01.圖6 c-Myb-inhibitor處理后兩組細(xì)胞TGF-β1 mRNA表達(dá)情況

Fig.6 The mRNA expression ofTGF-β1in two groups of cells after c-Myb-inhibitor treatment

3 討論

CNP是一種起病緩慢、病情遷延且臨床多發(fā)的前列腺炎癥，已逐漸成為影響成年男性生活質(zhì)量的重大健康問(wèn)題[6-7].該病最早由Schaeffer等[8]發(fā)現(xiàn)，在前列腺組織中發(fā)現(xiàn)炎癥細(xì)胞，但在細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)過(guò)程中未發(fā)現(xiàn)任何致病菌，因此又稱為無(wú)菌性前列腺炎.由于CNP病情進(jìn)展過(guò)程中會(huì)引起劇烈的盆底疼痛及尿頻、尿急、尿痛等尿道刺激征，因此臨床治療目標(biāo)仍以緩解疼痛、改善排尿癥狀和提高生活質(zhì)量為主，但對(duì)于其發(fā)病原因及機(jī)制尚未完全明確[9].近年來(lái)，隨著CNP患者在育齡男性中發(fā)病率的逐年增高，其對(duì)男性生育能力的影響引起了人們的廣泛關(guān)注.正常生理?xiàng)l件下，精液由精漿和精子組成，其中精漿中的主要成分由前列腺液、精囊液和尿道腺體分泌的液體構(gòu)成，前列腺液在精漿中的比重可高達(dá)2/3.精漿中含有大量的糖類、酶類和維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，是精子存活和運(yùn)動(dòng)的物質(zhì)基礎(chǔ).

研究表明，當(dāng)前列腺發(fā)生慢性炎癥時(shí)，精漿中蛋白水解酶的含量會(huì)急劇下降，無(wú)法水解纖維蛋白，直接引起精液液化時(shí)間延長(zhǎng)，精子的活力和穿透力降低，進(jìn)而導(dǎo)致不育的發(fā)生[10].臨床觀察結(jié)果顯示，CNP患者的精液可出現(xiàn)精液量異常、黏稠度增加、白細(xì)胞數(shù)升高、精子活動(dòng)率降低、精漿免疫球蛋白水平升高等一系列病理生理性變化[11].TGF-β1是一種由雙硫鍵聯(lián)結(jié)的堿性細(xì)胞因子，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、發(fā)育、炎癥和凋亡等多種生物學(xué)活性[12].Hinz[13]研究指出，TGF-β1及其受體在人體睪丸組織間質(zhì)細(xì)胞、支持細(xì)胞及精子細(xì)胞均有表達(dá)，而且TGF-β1還具有抑制睪丸間質(zhì)細(xì)胞類固醇激素合成的作用，提示TGF-β1在CNP所致男性不育的過(guò)程中具有一定作用.

本研究采用脂多糖對(duì)人前列腺素上皮P69細(xì)胞進(jìn)行處理，研究顯示實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中炎癥因子IL-6、IL-10和TNF-α的水平明顯上升，提示無(wú)菌性炎癥模型構(gòu)建成功.Western Blot結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組炎癥細(xì)胞中c-Myb和TGF-β1的表達(dá)水平均較正常細(xì)胞出現(xiàn)升高；RT-PCR試驗(yàn)表明炎癥細(xì)胞中hsa-miR-150表達(dá)亦較正常細(xì)胞升高，以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果共同提示，炎癥反應(yīng)與c-Myb、TGF-β1和hsa-miR-150的表達(dá)具有相關(guān)性，炎癥反應(yīng)可增強(qiáng)前列腺細(xì)胞各相關(guān)因子的表達(dá)程度.Paulis[14]的研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1可在前列腺炎組織中高表達(dá)，這與本研究結(jié)果相一致，這些結(jié)果均揭示TGF-β1不僅可能參與調(diào)控前列腺炎的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，還可能與生精功能密切相關(guān).轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白c-Myb是Myb家族的主要成員之一，主要在脊椎動(dòng)物中表達(dá)，并與細(xì)胞增殖、分化、凋亡、胚胎發(fā)育等多種生物學(xué)功能緊密相關(guān).已有研究發(fā)現(xiàn)，c-Myb作為轉(zhuǎn)錄活化因子，可促進(jìn)精子的形成，且隨著精子的成熟，c-Myb的表達(dá)水平可逐漸降低，提示c-Myb在人體生精功能中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[15].但c-Myb是否參與調(diào)節(jié)慢性非細(xì)菌性前列腺炎生精功能障礙目前尚未明確.Ottley等[16]研究提示，在體外培養(yǎng)細(xì)胞中下調(diào)c-Myb的表達(dá)能夠顯著抑制TGF-β1高表達(dá)，提示TGF-β1的表達(dá)及其介導(dǎo)的生物學(xué)功能可能受c-Myb調(diào)控.

另外，本研究中通過(guò)在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中給予hsa-miR-150-mimic，結(jié)果顯示c-Myb和TGF-β1均出現(xiàn)表達(dá)增強(qiáng)，正常細(xì)胞表達(dá)升高水平可與炎癥細(xì)胞表達(dá)水平相當(dāng)；當(dāng)給予hsa-miR-150-inhibitor時(shí)，炎癥細(xì)胞c-Myb和TGF-β1表達(dá)水平可顯著降低.miR-150作為一種由內(nèi)源基因編碼的長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA 分子，定位于人類染色體19q13.33，于脾臟和淋巴結(jié)部位高度表達(dá)，在免疫細(xì)胞的存活或遷移能力調(diào)控中具有相關(guān)性作用[17].已有研究指出，miR-150可通過(guò)降解其靶基因的mRNA或抑制靶基因翻譯的方式參與并調(diào)控炎癥因子表達(dá).同時(shí)結(jié)合本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果，揭示hsa-miR-150是前列腺炎癥反應(yīng)中的重要調(diào)控因子.同樣，本研究通過(guò)c-Myb-inhibitor對(duì)兩組細(xì)胞進(jìn)行處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)炎癥細(xì)胞TGF-β1表達(dá)明顯降低，正常細(xì)胞組表達(dá)水平無(wú)明顯改變，提示TGF-β1為c-Myb的下游靶因子，且TGF-β1的表達(dá)水平與c-Myb的表達(dá)呈正相關(guān).不僅如此，本研究對(duì)c-Myb的上游基因進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)hsa-miR-150因子對(duì)c-Myb-TGF-β1的信號(hào)軸具有調(diào)控影響.

Noveski等[18]指出，大量miRNA在睪丸或附睪組織中表達(dá)，并可定位表達(dá)于精子發(fā)生早期的精原細(xì)胞和初級(jí)精母細(xì)胞，對(duì)精子的形成、成熟和獲能過(guò)程均產(chǎn)生重要調(diào)控作用.同樣，本研究結(jié)果對(duì)其進(jìn)行了驗(yàn)證，在慢性非細(xì)菌性前列腺炎刺激條件下，hsa-miR-150可能通過(guò)調(diào)節(jié)c-Myb-TGF-β1信號(hào)軸，導(dǎo)致生精功能障礙.盡管本研究對(duì)前列腺炎癥細(xì)胞模型中誘導(dǎo)的信號(hào)通路進(jìn)行了分析，但關(guān)于生物體內(nèi)的炎癥損傷效應(yīng)及生精障礙機(jī)制仍需進(jìn)一步探究.

綜上，本研究結(jié)果表明人前列腺上皮細(xì)胞在炎癥刺激下可引發(fā)hsa-miR-150水平增高，進(jìn)而激活c-Myb-TGF-β1信號(hào)軸，引發(fā)c-Myb和TGF-β1的表達(dá)升高，最終引起功能障礙，為慢性非細(xì)菌性前列腺炎的發(fā)病機(jī)制提供了細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)依據(jù).