補腎解毒方對低劑量輻射孕鼠胎盤組織氧化損傷及妊娠結(jié)局的影響

喬祚，曹惠敏，李延暉，張蓉，楊云霜

(1.錦州醫(yī)科大學(xué) 火箭軍特色醫(yī)學(xué)中心 研究生培養(yǎng)基地，遼寧 錦州 121000;2.蘇州大學(xué) 火箭軍特色醫(yī)學(xué)中心 研究生培養(yǎng)基地，江蘇 蘇州 215000;3.火箭軍特色醫(yī)學(xué)中心 中醫(yī)與康復(fù)醫(yī)學(xué)科，北京 100088;4.火箭軍特色醫(yī)學(xué)中心 核與輻射損傷實驗室，北京 100088;5.北京市隆福醫(yī)院 中醫(yī)科,北京 100010)

在核能利用日益廣泛的今天，相對于高劑量的輻射，中、低劑量的輻射在人們的生活和發(fā)展中接觸幾率更大、更密切.生殖是關(guān)乎人類繁衍生息的重要一環(huán)，伴隨著人類對于輻射危害認(rèn)識的日益清晰，中低劑量的輻射對于人類生殖的影響越來越受到重視.祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為，腎主生殖，為藏精之腑[1]，在人體的發(fā)育成長以及繁衍后代等方面起重要的作用，與生殖系統(tǒng)關(guān)系極為密切.而電離輻射屬火熱暴戾之邪，可直中臟腑，傷津劫液耗損肝腎之陰精，動搖生殖之根本.畢煥洲[2]認(rèn)為輻射后性功能減退以及生殖功能出現(xiàn)障礙等臨床表現(xiàn)，均乃腎精受損之候.實驗研究發(fā)現(xiàn)輻射致病原因及防治均與腎陰虧虛密切相關(guān)[3].本小組就補腎解毒方對生殖系統(tǒng)防護(hù)作用進(jìn)行研究，通過對雌鼠最終生殖結(jié)果和胎盤數(shù)據(jù)的分析，探討補腎解毒方對低劑量輻射孕鼠妊娠結(jié)局的影響和胎盤組織氧化損傷的防護(hù)作用及其機制.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

于2019年7月，選取清潔級健康 C57BL/6J 雌性小鼠80只，體質(zhì)量為(21±2)g，雄性小鼠40只，體質(zhì)量為(25±2)g，均為3月齡，由北京鑫源順康科技有限公司提供，實驗動物許可證號：SCXK(京)2016-0008.于北京火箭軍特色醫(yī)學(xué)中心動物飼養(yǎng)室進(jìn)行飼養(yǎng)，實驗期間自行進(jìn)食攝水.

1.1.2 實驗藥品

補腎解毒方組成:熟地黃10 g，山萸肉12 g，澤瀉 10 g，茯苓10 g，山藥10 g，牡丹皮10 g，白花蛇舌草10 g，冬蟲夏草3 g，經(jīng)康仁堂藥業(yè)有限公司配置成中藥顆粒.

1.1.3 實驗儀器及試劑

丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)試劑盒及谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)試劑盒，均由北京瑞格博科技發(fā)展有限公司提供；電子天平由賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司提供，體積分?jǐn)?shù)為2.5%的戊二醛、多聚甲醛固定液、磷酸緩沖鹽溶液(PBS)由國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供.

1.1.4 輻射源

60Coγ-輻照裝置，由北京伽瑪高新有限公司提供，型號：GM-11-03-A.

1.2 實驗方法

1.2.1 分組、造模及處理方法

1.2.2 胎盤指數(shù)計算

將麻醉后的孕鼠，快速解剖，取出子宮，剖開子宮后去除胎鼠胞衣，將胎鼠和胎盤盡快相互剝離，一一對應(yīng)，分別稱質(zhì)量，并按照胎盤指數(shù)=(胎盤質(zhì)量/胎鼠體質(zhì)量)×100%的方法計算出胎盤指數(shù).

1.2.3 自由基損傷指標(biāo)檢測

取一部分稱質(zhì)量后的胎盤，放入PBS溶液中進(jìn)行清洗，清洗干凈后，制作成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%組織勻漿，其后嚴(yán)格按照試劑盒說明要求，測量SOD活性采用黃嘌呤氧化酶法進(jìn)行測定，測量GSH-Px活性使用還原型谷胱甘肽(GSH)消耗法進(jìn)行測定，測量MDA含量使用硫代巴比妥酸法(TBA)進(jìn)行測定.

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組孕鼠一般情況

實驗過程中空白對照組的孕鼠至解剖前狀況一直穩(wěn)定，精神狀態(tài)良好，毛色光澤，飲食攝水量正常，排便質(zhì)量正常，妊娠期間體重均平穩(wěn)增長，無異常體質(zhì)量下降，無早產(chǎn)或出現(xiàn)難產(chǎn)征象.輻射組和中藥治療組在當(dāng)天接受輻射后，均出現(xiàn)情緒焦躁不安，容易驚恐，進(jìn)食量、攝水量明顯減少，輻射后第2天發(fā)現(xiàn)體質(zhì)量下降.之后的實驗過程中，輻射組毛色較對照組明顯黯淡，進(jìn)食攝水量較輻射前減少較顯著，且沒有明顯恢復(fù)，排尿量減少，糞便干燥，孕鼠精神狀態(tài)不佳，較為萎靡，且該組20只孕鼠中7只(35%)于第19天晚至第20天解剖前分別出現(xiàn)不同程度的難產(chǎn)征象，情緒異常煩躁，身體扭向一側(cè)，無法四肢平衡爬行，時常痛苦扭動身軀，甚至出現(xiàn)角弓反張體位，但未分娩.解剖后發(fā)現(xiàn)輻射組孕鼠有不同程度的胃腸道水腫，或存在腸道梗阻、胃積水.而中藥治療組，在之后的實驗中進(jìn)食飲水量逐漸上升，甚至與空白對照組無明顯差異.與輻射組相比，中藥治療組孕鼠毛色健康，精神狀態(tài)較好，排尿量和大便質(zhì)量在實驗后期也基本恢復(fù)正常，解剖后除其中3只胃腸道水腫明顯外，其余無明顯水腫，部分孕鼠胃腸道色澤與空白對照組比較為蒼白，無其余病癥，無早產(chǎn)，臨近分娩無難產(chǎn)體征.

2.2 3組孕鼠輻射前與輻射后的體質(zhì)量變化

輻射前1 d 3組孕鼠之間的體質(zhì)量差別并不明顯，不具有統(tǒng)計學(xué)差異.輻射后第1天，輻射組和中藥治療組孕鼠體質(zhì)量相較空白對照組均有明顯的下降(P<0.01，P<0.05)，較輻射前1天也有明顯下降(P<0.01).至輻射后第10天，輻射組與輻射后第1天相比體質(zhì)量有所上升(P<0.05),但相比空白對照組，體質(zhì)量減輕仍十分明顯(P<0.05)；中藥治療組孕鼠體質(zhì)量低于空白對照組(P<0.05)，相比輻射后第1天，體質(zhì)量明顯上升(P<0.01)，見表1.

表1 輻射前后3組孕鼠體質(zhì)量變化Table 1 Changes of body weight in three groups of pregnant rats before and after radiation

與同時期的空白對照組比較，1)P<0.05，2)P<0.01；與同組輻射前第1天比較，3)P<0.05，4)P<0.01；與同組輻射后第1天比較，5)P<0.05，6)P<0.01.
Compared with the blank control group of the same period,1)P<0.05,2)P<0.01;3)P<0.05,4)P<0.01.Compared with the same group on the first day after radiation,5)P<0.05,6)P<0.01.

2.3 3組孕鼠妊娠結(jié)局比較

2.3.1 3組孕鼠最終活胎率、死胎率、吸收胎率比較

活胎率：輻射組為29.60%(37/125)，中藥治療組為72.87%(94/129)，均低于空白對照組的96.27%(129/134),具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)；中藥治療組活胎率明顯高于輻射組活胎率，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05).死胎率：輻射組為60.00% (75/125)，中藥治療組為22.48%(29/129)，均高于空白對照組的3.73%(5/134)，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，中藥治療組明顯低于輻射組死胎率，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05).吸收胎率：輻射組為10.40%(13/125)，中藥治療組為4.65%(6/129)均高于空白對照組的0%(0/134)，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，中藥治療組吸收胎率明顯低于輻射組吸收胎率，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05，圖1).

與同時期的空白對照組比較，1)P<0.05；與輻射組比較，2)P<0.05.

Compared with the blank control group of the same period,1)P<0.05;Compared with the radiation group,2)P<0.05.

圖1 各組孕鼠活胎數(shù)(率)、死胎數(shù)(率)和吸收胎數(shù)(率)
Fig.1 Number of live births (ratio),number of stillbirths (ratio) and number of absorbed fetuses (ratio)

2.3.2 3組仔鼠一般情況和胎盤指數(shù)

3組窩仔數(shù)和仔鼠尾長之間差距不具有統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)；仔鼠體質(zhì)量方面，輻射組和中藥治療組仔鼠體質(zhì)量均輕于空白對照組，中藥治療組仔鼠體質(zhì)量明顯重于輻射組，各組間均具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)；仔鼠身長方面，輻射組和中藥治療組仔鼠身長均小于空白對照組，中藥治療組仔鼠身長明顯大于輻射組，各組間均具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)；胎盤指數(shù)方面，輻射組和中藥治療組胎盤指數(shù)均小于空白對照組，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，中藥治療組的胎盤指數(shù)優(yōu)于輻射組，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05，表2).

表2 輻射后仔鼠一般情況和胎盤指數(shù)Table 2 General condition and placental index of the offspring after radiation

1)與同時期的空白對照組比較P<0.05；2)與輻射組比較P<0.05.
Compared with the blank control group of the same period,1)P<0.05;Compared with the radiation group,2)P<0.05.

2.3.3 各組孕鼠胎盤SOD、GSH-Px活性和MDA的比較

輻射后第10天，輻射組和中藥治療組孕鼠胎盤中的SOD活力較空白對照組，均有所下降，其中輻射組尤為明顯，各組間具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，中藥治療組孕鼠胎盤中的SOD的活性明顯高于輻射組，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01，P<0.05)；輻射組和中藥治療組孕鼠胎盤中的GSH-Px活力較空白對照組有所下降(P<0.05)，中藥治療組孕鼠胎盤中的GSH-Px活性高于輻射組(P<0.05)；輻射組孕鼠胎盤中的MDA含量明顯高于空白對照組(P<0.01，P<0.05)，高于中藥治療組(P<0.05)，中藥治療組孕鼠胎盤每克蛋白MDA的mmol數(shù)量略高于空白對照組，但無統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05，表3).

表3 輻射對3組孕鼠胎盤SOD、GSH-Px、MDA的影響Table 3 Effects of radiation on the values of SOD,GSH-Px and MDA in the placenta of three groups of pregnant rats

與同時期的空白對照組比較，1)P<0.05，2)P<0.01；與輻射組比較，3)P<0.05，4)P<0.01.
Compared with the blank control group of the same period,1)P<0.05,2)P<0.01;Compared with the radiation group,3)P<0.05,4)P<0.01.

3 討論

近年來，具備標(biāo)本兼治、防治結(jié)合、低毒高效特點的中藥吸引了從事輻射防護(hù)研究人員的目光，但是目前該研究領(lǐng)域缺乏專門針對生殖機能及子代健康防治、治療靶點清晰的中藥復(fù)方研究.課題組在研究過程中發(fā)現(xiàn)低、中劑量電離輻射對雌鼠孕產(chǎn)情況、仔鼠成活率、畸形率和生長發(fā)育情況的影響研究較少，截至目前查閱的文獻(xiàn)，尚未見藥物抗電離輻射胎盤損傷研究相關(guān)報道.補腎藥物對生殖機能具有保護(hù)作用，補腎解毒方是否通過影響胎盤組織活性發(fā)揮輻射防護(hù)作用是本次研究的重點.

妊娠是整個生殖過程中的環(huán)節(jié)之一[4]，從中醫(yī)角度來說乃“腎”所管轄的范疇.《素問·上古天真論》曰：“腎者主水，受五臟六腑之精而藏之.”《素問．六節(jié)臟象論》稱腎為“封藏之本”，所藏既有先天之精又有后天之精.隨著科學(xué)的發(fā)展和研究的進(jìn)一步加深，輻射對于人類生殖、妊娠和子代健康的損傷得到了更深的認(rèn)識，Kante等[5]發(fā)現(xiàn)暴露于有效劑量E13.5 J/kg照射下的小鼠平均體質(zhì)量降低25%，胎盤質(zhì)量降低9%，這與胎盤基因表達(dá)相對較小的變化有關(guān).Samira等[6]研究了γ-射線輻照對f1成年雌蛹的生物學(xué)效應(yīng)，γ輻照對卵巢的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)出顯著的影響.

電離輻射給機體帶來的損傷具有驟發(fā)性和廣泛內(nèi)損性，損傷會隨照射劑量的增加而增大，且能直中多個臟腑，燔津灼血,耗損陰陽，這與中醫(yī)的外邪實證和火熱之邪的特點相符.輻射直中于“腎”，邪熱灼陰，損傷腎氣，耗竭陰精，動搖生命先天之本，故生殖結(jié)局受到影響.實驗中，接受低劑量60Coγ-射線照射的兩組孕鼠，死胎率、吸收胎率，高于空白對照組，仔鼠體質(zhì)量和胎盤指數(shù)較空白對照組偏低.

補腎解毒方以六味地黃丸為裁劃，在其基礎(chǔ)上加入冬蟲夏草和白花蛇舌草.梁秋峰等[7]研究發(fā)現(xiàn)六味地黃丸對大鼠的下丘腦-垂體-卵巢軸具有調(diào)節(jié)作用，對卵巢功能的恢復(fù)及改善有很好的促進(jìn)作用，利于女性生殖.冬蟲夏草，歸肺腎經(jīng)，《藥性考》謂之“味甘性溫，秘精益氣，專補命門.”羅勝勇等[8]研究發(fā)現(xiàn)冬蟲夏草能調(diào)節(jié)抗氧化酶基因表達(dá)，可以明顯提高氧化損傷小鼠的抗氧化能力.白花蛇舌草性苦寒，清熱解毒，可泄火熱邪盛，減少輻射帶來的熱性損傷，防止熱邪進(jìn)一步蘊久傷陰.同時白花蛇舌草也具有抗氧化的作用，孟新周等[9]發(fā)現(xiàn)白花蛇舌草醇提物劑量越高，小鼠血清當(dāng)中SOD活性、肝腦組織中的CAT、GSH-Px等抗氧化酶活力越高.

本課題組前期研究[10]顯示，同時接受5 Gy60Coγ-射線照射的雄性小鼠，中藥治療組輻射后第1天及第14天小鼠的睪丸指數(shù)遠(yuǎn)優(yōu)于輻射模型組.受此啟發(fā)，后期實驗[11]中予雌性小鼠5 Gy60Coγ-射線照射，最終中藥治療組小鼠卵巢重量、卵巢指數(shù)均高于輻射模型組，可見補腎解毒方對機體抗輻射氧化及兩性生殖系統(tǒng)抗輻射損傷均具有防御和治療作用.現(xiàn)階段實驗旨在根據(jù)胎盤數(shù)據(jù)和妊娠結(jié)局來探究補腎解毒方對輻射造成生殖系統(tǒng)和子代損傷的防護(hù)作用，結(jié)果顯示中藥治療組孕鼠體質(zhì)量、胎盤指數(shù)、仔鼠存活率均高于輻射組，死胎率、吸收胎率低于輻射組，具有統(tǒng)計學(xué)差異.可見補腎解毒方對輻射損傷造成的生殖差異具有良性干預(yù)作用，對妊娠結(jié)局和生殖系統(tǒng)保護(hù)有積極作用.對各組孕鼠進(jìn)行胎盤檢測后顯示，與空白對照組相比，經(jīng)過輻射的兩組胎盤中SOD、GSH-Px活性都偏低，MAD含量較空白組偏高，輻射后起到清除體內(nèi)過量生成的自由基的SOD以及提高機體抗氧化能力的GSH-Px活性都明顯降低，自由基異常升高，使脂質(zhì)過氧化物MAD含量升高.實驗結(jié)果可見中藥治療組中清除過量自由基的SOD，GSH-Px明顯高于輻射組，MAD含量受到抑制和清除明顯低于輻射組，具有統(tǒng)計學(xué)差異.由此可見，補腎解毒方對于輻射所造成的胎盤組織氧化損傷有防御和修復(fù)作用.

綜上所述，補腎解毒方對低劑量電離輻射造成的C57BL/6J孕鼠妊娠損傷有良好的防護(hù)作用，可提高子代存活率和子代質(zhì)量，對于孕鼠妊娠結(jié)局具有積極影響，對低劑量輻射造成的胎盤過氧化損傷有防護(hù)和修復(fù)作用，從而降低子代健康風(fēng)險.