ERK5對M1型巨噬細胞標志炎癥因子iNOS、MCP-1表達的影響

管新竹，王怡茹，張一凡，劉萍

(上海中醫(yī)藥大學 附屬龍華醫(yī)院 心內(nèi)科，上海 200032)

細胞外信號調(diào)節(jié)激酶5(extracellular-regulated kinase 5,ERK5，又稱為MAPK7)是MAPK家族目前最后發(fā)現(xiàn)的成員，其基因位于17p11.2人染色體上，由816個氨基酸構(gòu)成,是MAPK家族中最長的一員，是其他家族成員的兩倍長度[1]，激活時與其他細胞外信號調(diào)節(jié)激酶一致，遵從三級酶促級聯(lián)反應，即MAPKKK-MAPKK-MAPK[2]，其上游為MEK5，此激酶是ERK5的唯一上游激酶，過表達時對其他MAPK家族成員也無激活作用，對ERK5具有高度特異性[3].炎癥反應是動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)的重要病理機制之一，巨噬細胞主要極化為M1和M2兩種亞型，這兩種亞型對炎癥的發(fā)展具有完全相反的作用：M1型巨噬細胞以高表達MCP-1 和iNOS等促炎物質(zhì)為標志[4]，具有促進炎癥發(fā)展的作用，M2型巨噬細胞具有抗炎作用.AS中的巨噬細胞極化過程中由LPS和ox-LDL共同參與，故本研究欲以脂多糖(lipopolysaccharide；LPS)、氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein；ox-LDL)聯(lián)合誘導的M1型巨噬細胞為研究對象，探索ERK5抑制劑對M1型巨噬細胞模型中單核細胞趨化因子-1(monocyte chemo-attractant protein-1,MCP-1)和誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)表達的影響.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞

小鼠巨噬細胞株RAW264.7購于中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心.

1.1.2 試劑

ERK5抑制劑XMD8-92購于美國Selleck公司；DMEM高糖培養(yǎng)液和胎牛血清購于美國Hyclone公司；ox-LDL購于中國上海翊圣生物科技有限公司；LPS購于美國SIGMA公司；mRNA提取試劑盒購于中國上海海方生物技術(shù)有限公司；PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR反應試劑盒購于日本TAKARA公司，引物設(shè)計和合成服務(wù)由中國上海生工生物工程有限公司提供；PMSF、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑和蛋白裂解液RIPA購于中國上海威奧生物科技有限公司；BCA蛋白濃度測定，超敏ECL化學發(fā)光試劑盒購于中國上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Anti-MCP-1抗體和Anti-iNOS抗體購于美國Abcam公司;GAPDH購于美國Cell Signaling Technology(CST)公司;兔二抗購于中國上海arigo公司.

1.1.3 儀器與設(shè)備

美國Thermo Fisher公司超凈工作臺和細胞培養(yǎng)箱；芬蘭Eppendorf公司紫外分光光度計和高速冷凍離心機；美國應用生物系統(tǒng)公司Applied biosystems 7500熒光定量PCR儀；美國Bio-tek公司酶標儀；上海勤翔科學儀器有限公司凝膠成像系統(tǒng).

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和分組

RAW264.7細胞常規(guī)復蘇后，胎牛血清和DMEM高糖培養(yǎng)基配置成體積分數(shù)為10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，于體積分數(shù)為5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，傳至第2代時再進行造模與干預.分為空白組、模型組和模型+ERK5抑制劑組.參考文獻[5]，應用ox-LDL(質(zhì)量濃度為10 μg/mL)+LPS(質(zhì)量濃度為1 ng/mL)建立M1型巨噬細胞模型，ERK5抑制劑XMD8-92濃度為2.5 μmol/mL.

1.2.2 運用CCK-8法測定細胞活性

細胞培養(yǎng)同前，將對數(shù)生長期的細胞接種于96孔板，每孔1.0×104個，于37 ℃、體積分數(shù)為5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，XMD8-92提前1 h加入模型+抑制劑組中，1 h后吸棄上清，每組加入對應的干預培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，吸棄培養(yǎng)基，加入體積分數(shù)為10%的CCK-8稀釋液，放入細胞培養(yǎng)箱反應1 h，用酶標儀檢測吸光度值，重復3次.

1.2.3 運用實時定量PCR檢測MCP-1和iNOS mRNA 的表達

將對數(shù)生長期的細胞接種于6孔板中常規(guī)培養(yǎng)，每孔3.0×105個，至細胞生長至70%時分組，干預與培養(yǎng)方式同上，3 h后應用RNA提取試劑盒按說明書提取RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄RNA，條件為37 ℃ 15 min；85 ℃ 5 s.得到的樣本應用于RT-qPCR檢測，反應條件為95 ℃ 1 min；95 ℃ 3 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，共40循環(huán).引物由上海生工生物工程有限公司設(shè)計并合成，引物序列(表1).應用2-ΔΔCT法對得到的數(shù)據(jù)進行數(shù)據(jù)分析.

表1 RT-qPCR引物序列Table 1 Primer sequence of RT-qPCR

1.2.4 運用蛋白印記法檢測各組MCP-1和iNOS的蛋白表達

細胞培養(yǎng)和分組情況同上，加入干預藥物后，培養(yǎng)24 h后吸棄上清，PBS洗兩遍，吸棄PBS，將蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑、PMSF和蛋白裂解液RIPA按比例混勻后加入培養(yǎng)皿內(nèi)，用細胞刮刀刮下細胞，移入無菌無酶的1.5 mL EP管中，冰上裂解30 min，4 ℃，12 000 r/min離心20 min，上清即蛋白.用BCA試劑盒按說明書操作檢測蛋白濃度，制備上樣所需樣本，每孔20 μg蛋白，質(zhì)量分數(shù)為10%SDS-PAGE電泳，350 mA轉(zhuǎn)膜1 h，BSA封閉1 h，一抗(iNOS以1∶250體積比稀釋；MCP-1以1∶1 000體積比稀釋)4 ℃孵育過夜，次日TBST洗膜，兔二抗(1∶2 000體積比稀釋)室溫搖床孵育2 h，TBST洗膜后ECL化學發(fā)光顯影.用Image J分析各條帶的吸光度值D，進行相對定量分析(蛋白相對表達量=目的蛋白/內(nèi)參).

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 23.0統(tǒng)計數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以(均數(shù)±標準差)表示，采用獨立樣本t檢驗進行組間比較，P<0.05為有統(tǒng)計學差異.

2 結(jié)果

2.1 ERK5抑制劑對M1型巨噬細胞活性的影響

將CCK-8法所得D值進行計算(生存率=樣本孔D值/空白組D值)，得出的比值為細胞生存率.結(jié)果顯示，ox-LDL和LPS聯(lián)用會刺激巨噬細胞增殖，造模的基礎(chǔ)上加入XMD8-92后，與模型組相比細胞的生存率下降，空白組細胞的生存率(1.00±0.08)，模型組細胞的生存率(1.70±0.09)，模型+抑制劑組細胞的生存率(1.43±0.04)，各組間兩兩比較，有統(tǒng)計學差異(圖1).

與模型組相比，1)P<0.01.
Compared with model group,1)P<0.01.
圖1 LPS、ox-LDL和XMD8-92對細胞生存率的影響
Fig.1 Effect of LPS、ox-LDL and XMD8-92 on cell survival rate

2.2 ERK5抑制劑對M1型巨噬細胞MCP-1和iNOS mRNA的影響

造模后結(jié)果可見巨噬細胞MCP-1和iNOSmRNA表達增加，與空白組比較，有統(tǒng)計學差異(P<0.05);加入XMD8-92后，iNOS與MCP-1的表達均顯著下調(diào)，與模型組比較，具有顯著統(tǒng)計學差異(P<0.01)，表明ERK5抑制劑可以抑制M1型巨噬細胞標志因子MCP-1和iNOS基因的表達(圖2).

與模型組相比，1)P<0.01.
Compared with model group,1)P<0.01.
圖2 各組細胞的MCP-1和iNOSmRNA的表達情況
Fig.2 The mRNA expression ofMCP-1andiNOSin each group

2.3 ERK5抑制劑對M1型巨噬細胞MCP-1和iNOS蛋白表達的影響

通過結(jié)果可知，模型組MCP-1、iNOS的表達較空白組顯著提高，兩組比較差異具有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)；加入XMD8-92之后，MCP-1、iNOS的表達皆有不同程度的下調(diào)，與模型組相比，抑制劑組MCP-1的表達有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，iNOS的表達具有顯著統(tǒng)計學差異(P<0.01).表明ERK5可以抑制M1型巨噬細胞標志因子MCP-1和iNOS蛋白的表達(圖3).

與模型組相比，1)P<0.01;2)P<0.05.Compared with model group,1)P<0.01,2)P<0.05.圖3 各組細胞的MCP-1和iNOS蛋白的表達情況3 The protein expression of MCP-1 and iNOS in each group

3 討論

巨噬細胞的可塑性和異質(zhì)性強，在不同周圍細胞因子和刺激因子的誘導下可以分化成完全不同功能的亞型，這種現(xiàn)象被稱之為巨噬細胞極化.Toll樣受體配體LPS和干擾素γ[6]、以及ox-LDL[7]可誘導巨噬細胞轉(zhuǎn)化為促炎的經(jīng)典活化巨噬細胞(M1型巨噬細胞)；在白介素4、13的誘導下巨噬細胞可分化成抗炎的替代活化巨噬細胞(M2型巨噬細胞).AS中巨噬細胞不同的極化方向?qū)膊〉陌l(fā)展具有干預作用，與具有爭議的M2型巨噬細胞不同，目前認為M1型巨噬細胞對AS的發(fā)生和發(fā)展具有促進作用，加重斑塊內(nèi)的炎癥反應，增強斑塊的易損性.

活化后的M1型巨噬細胞會高表達iNOS、MCP-1等促炎細胞因子，并通過核因子κB(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells,NF-κB)通路上調(diào)C反應蛋白[7]，釋放基質(zhì)金屬蛋白酶，降解細胞外基質(zhì)，使斑塊處纖維帽變薄，從而降低斑塊的穩(wěn)定性[8]，增加心血管事件發(fā)生率.M1型巨噬細胞的標志性因子MCP-1可上調(diào)AS相關(guān)細胞的粘附和遷移能力，具有促進脂肪條紋形成的作用[9-11]；另一標志因子iNOS可誘導一氧化氮的分泌，具有促進炎癥進展，加重AS的作用[12-13].ERK5信號通路具有向細胞核內(nèi)傳導刺激信號，調(diào)控包括巨噬細胞、血管平滑肌細胞等多種細胞的增殖、分化和凋亡的功能[14]，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)ERK5抑制劑可以通過調(diào)控胞葬相關(guān)的信號分子的表達，干預巨噬細胞的胞葬作用[15].有研究顯示，ERK5特異性敲除的小鼠與未敲除小鼠相比較，其腹腔巨噬細胞極化的差異具有統(tǒng)計學意義[16].XMD8-92作為常用的ERK5的抑制劑，可以幫助研究在ERK5失活狀態(tài)下，巨噬細胞各炎癥因子表達的情況[15].NF-κB是炎癥反應中的重要環(huán)節(jié)，對包括MCP-1、iNOS在內(nèi)的多種炎癥因子具有調(diào)控作用，ERK5 作為NF-κB的上游，對其有調(diào)控作用[17].本次研究，結(jié)果中ERK5抑制劑對ox-LDL和LPS聯(lián)合誘導的M1型巨噬細胞亞型的細胞活性有顯著抑制作用，并可以顯著下調(diào)M1型巨噬細胞的標志性信號因子MCP-1和iNOS的表達，說明阻斷ERK5激酶的表達可能可以通過調(diào)控NF-κB，抑制M1型巨噬細胞炎癥因子的表達，控制炎癥進展.極化是一個動態(tài)過程，巨噬細胞極化的方向是M1型巨噬細胞和M2型巨噬細胞數(shù)量的相對多少決定的，故ERK5對巨噬細胞極化方向的干預作用還需要進一步深入研究.