安胎合劑定性定量方法優(yōu)化研究*

管 敏，陳曉斌

（南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 南京210029）

安胎方是我院中醫(yī)婦科陸啟濱教授的經(jīng)驗(yàn)方，由炒淮山藥、山茱萸、槲寄生、杜仲、菟絲子、苧麻根、太子參、續(xù)斷、鹿角霜、生黃芪等12味藥材組方，具有清熱和血、補(bǔ)腎健脾、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等功效，主要用于封閉抗體缺失習(xí)慣性流產(chǎn)、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)，脾腎兩虛，血熱夾瘀的治療[1]，以及先兆性流產(chǎn)和復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的預(yù)防?，F(xiàn)擬將其開發(fā)為醫(yī)院制劑安胎合劑。制劑的質(zhì)量與療效息息相關(guān)，中藥制劑的組分眾多、成分復(fù)雜，且同種中藥不同批次差異大，以單純某一成分的含量較難控制中藥制劑的質(zhì)量，這些因素嚴(yán)重影響臨床用藥的安全性、有效性[2]。本制劑為婦幼用制劑，對(duì)安全性和有效性的要求更高，故本研究中建立了安胎合劑的相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，利用薄層色譜（TLC）法對(duì)山茱萸、續(xù)斷進(jìn)行定性鑒別，采用高效液相色譜（HPLC）法同時(shí)測(cè)定方中主要有效成分芍藥苷和川續(xù)斷皂苷Ⅵ的含量，以控制制劑質(zhì)量[3-5]?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

AR2140型電子天平（美國(guó)Ohaus Corp，精度為萬(wàn)分之一）；BP211D型電子天平（Sartorius，精度為十萬(wàn)分之一）；AD-03型多功能粉碎機(jī)（上海愛德科技有限公司，150 g）；DW型調(diào)溫電熱器（上海平環(huán)燃燒設(shè)備工程技術(shù)有限公司，2 000 mL）；HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市杰瑞爾電器有限公司）；SK6200H型超聲清洗儀（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；1260S型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）；硅膠G板（青島海洋化工廠分廠，批號(hào)為20151108）。

1.2 試藥

芍藥苷對(duì)照品（批號(hào)為110736-201337），川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)照品（批號(hào)為111685-201305），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；含量測(cè)定所用試劑均為色譜純；水為超純水；其他試劑均為分析純；安胎合劑（江蘇省中醫(yī)院自制，批號(hào)分別為1805001，1805002，1805003）。

2 方法與結(jié)果

2.1 定性鑒別

山茱萸：取安胎合劑50 mL，蒸干，殘?jiān)蛹状?0 mL超聲30 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另取山茱萸對(duì)照藥材5 g，加水50 mL加熱回流30 min，放冷，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状?0 mL使溶解，作為對(duì)照藥材溶液。取缺山茱萸的陰性樣品溶液50 mL，按供試品制備方法制成陰性對(duì)照品溶液。分別吸取上述3種溶液各10 μL，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇（4∶1，V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液顯色，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色斑點(diǎn)。詳見圖1 A。

續(xù)斷：取安胎合劑30mL，用水飽和正丁醇萃取3次，每次20 mL，合并正丁醇溶液，用新配制氨試液洗2次，每次30 mL，分取正丁醇層，蒸干，使用4 mL甲醇溶液溶解，作為供試品溶液。另取川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。取缺續(xù)斷的陰性樣品溶液，按供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照品溶液。分別吸取上述3種溶液各5 μL，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-10%NaOH（26∶15∶4，V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液顯色，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)。詳見圖1 B。

圖1 薄層色譜圖

2.2 芍藥苷和川續(xù)斷皂苷Ⅵ含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：0.1%磷酸水溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脫（0～21 min時(shí)14%B，21～23 min時(shí)30%B，23～40 min時(shí)30%B，40～45 min時(shí)14%B）；柱溫：30℃；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：0～21 min時(shí)230 nm，21～45 min時(shí)212 nm。

圖2 高效液相色譜圖

2.2.2 溶液制備

精密量取樣品10 mL，置50 mL容量瓶中，加80%乙醇適量，超聲處理（功率240 W，頻率45 kHz）15 min，放冷，加80%乙醇至刻度，搖勻，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。分別稱取芍藥苷對(duì)照品14.40 mg與川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)照品37.60 mg，精密稱定，置200 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成混合對(duì)照品溶液。各取缺白芍與續(xù)斷的陰性樣品溶液，按供試品溶液制備方法制得白芍陰性對(duì)照品溶液和續(xù)斷陰性對(duì)照品溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察

專屬性考察：按擬訂色譜條件，進(jìn)樣測(cè)定芍藥苷和川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)照品、安胎合劑供試品、缺續(xù)斷和白芍的陰性對(duì)照品溶液，結(jié)果見圖2?？梢?，芍藥苷和川續(xù)斷皂苷Ⅵ的色譜峰有效板數(shù)、分離度、拖尾因子均符合要求，陰性對(duì)照無(wú)干擾。

線性關(guān)系考察：取芍藥苷對(duì)照品10.10 mg、川續(xù)斷皂苷Ⅵ50.15 mg，精密稱定，加甲醇配置成25 mL的溶液作為母液，并依次稀釋2，4，8，16，32倍，過(guò)0.45 μm微孔濾膜制成系列對(duì)照品溶液。分別進(jìn)樣10 μL，以溶液質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)、峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得芍藥苷和川續(xù)斷皂苷Ⅵ回歸方程Y芍=13 445X+7.288 1（R2=0.999 5）和Y川=2 139.1X+10.048（R2=0.999 8）。結(jié)果表明，芍藥苷和川續(xù)斷皂苷Ⅵ質(zhì)量濃度在12.625～404 μg/mL和62.687 5～2 006 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：精密吸取對(duì)照品溶液，按擬訂色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次。結(jié)果芍藥苷與川續(xù)斷皂苷Ⅵ峰面積的RSD分別為2.89%和0.56%（n=6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：平行量取同一批供試品溶液，共6份，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件測(cè)定。結(jié)果芍藥苷和川續(xù)斷皂苷Ⅵ峰面積的RSD分別為1.48%和1.40%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一份供試品溶液，分別于0，2，4，6，8，12 h時(shí)按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果芍藥苷與川續(xù)斷皂苷峰面積的RSD分別為1.18%和1.14%（n=6），表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗(yàn)：精密量取安胎合劑5 mL，置50 mL容量瓶中，加入相當(dāng)于3.65 mg芍藥苷，10.50 mg川續(xù)斷皂苷Ⅵ的混標(biāo)溶液，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率及RSD。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.2.4 樣品含量測(cè)定

取安胎合劑樣品3批，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定安胎合劑中芍藥苷與川續(xù)斷皂苷Ⅵ的含量。結(jié)果見表2。

表2 安胎合劑中芍藥苷與川續(xù)斷皂苷Ⅵ的含量（mg/mL）

3 討論

本試驗(yàn)中建立了安胎合劑中山茱萸、續(xù)斷的TLC鑒別方法，優(yōu)化了同時(shí)測(cè)定主藥續(xù)斷和白芍中川續(xù)斷皂苷Ⅳ和芍藥苷的HPLC法，經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，其精密度、重復(fù)性均較好，可用于安胎合劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立。

安胎合劑處方中共有12味藥材，成分復(fù)雜，且?guī)孜端幹芯型惓煞郑缋m(xù)斷和黃芪中均含有皂苷類，山茱萸和槲皮素中均含有三萜類化合物，采用TLC法鑒別陰性有干擾。山茱萸的TLC鑒別參考2015年版《中國(guó)藥典（一部）》[6]，甲醇超聲，以莫諾苷和馬錢苷為對(duì)照，但陰性有干擾，可能是方中其他藥味中含有相似成分，故以山茱萸對(duì)照藥材為對(duì)照，鑒別斑點(diǎn)清晰明了。

續(xù)斷的TLC鑒別參考2015年版《中國(guó)藥典（一部）》[6]，甲醇超聲，以川續(xù)斷皂苷Ⅳ為對(duì)照，硫酸乙醇顯色，樣品中斑點(diǎn)較多，背景有干擾，因此采用正丁醇萃取，氨試液洗滌方法制備樣品溶液，斑點(diǎn)少，主斑點(diǎn)清晰，陰性無(wú)干擾，列入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

方中其他藥材山藥、鹿角霜、杜仲在2015年版《中國(guó)藥典（一部）》中無(wú)TLC鑒別項(xiàng)，槲寄生、菟絲子、太子參曾采用《中國(guó)藥典（一部）》方法[6]，但供試品溶液中鑒別點(diǎn)均不清晰，之后又嘗試其他方法[7-8]，依然不能得到理想結(jié)果。黃芪采用《中國(guó)藥典（一部）》方法，陰性有干擾，調(diào)整展開劑比例后仍有干擾，故該幾味中藥的定性鑒別未列入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中。

續(xù)斷補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、止崩漏，白芍養(yǎng)血，兩者為該方主藥。參考2015年版《中國(guó)藥典（一部）》中續(xù)斷和白芍項(xiàng)下的含量測(cè)定方法[6]，進(jìn)行梯度洗脫和檢測(cè)波長(zhǎng)的變換，同時(shí)測(cè)定安胎合劑中芍藥苷和川續(xù)斷皂苷的含量。制備供試品溶液時(shí)，考察了不同濃度乙醇的提取率，結(jié)果60%乙醇提取的芍藥苷和川續(xù)斷皂苷Ⅵ最多，故供試品溶液制備方法確定為取供試品10 mL，加80%乙醇超聲，定容至50 mL，最終乙醇濃度約為60%。同時(shí)考察了超聲提取時(shí)間對(duì)2個(gè)成分含量的影響，結(jié)果供試品溶液分別超聲15，30，60 min后，芍藥苷和川續(xù)斷皂苷Ⅵ的含量無(wú)明顯差異，故確定供試品溶液制備時(shí)超聲15 min，放冷后定容。HPLC法的方法學(xué)考察結(jié)果表明，芍藥苷和川續(xù)斷皂苷Ⅵ的測(cè)定方法重復(fù)性好、專屬性強(qiáng)，可為安胎合劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供依據(jù)。

中藥制劑含藥味多，成分復(fù)雜，若不同藥味中有相似成分時(shí)，可以對(duì)照藥材為對(duì)照，增加可鑒別的信息。目前制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究過(guò)程中，含量測(cè)定指標(biāo)的選擇多考慮主要成分、易得、易測(cè)、穩(wěn)定等因素[9-12]，部分制劑所測(cè)得成分與藥效的發(fā)揮是否有直接關(guān)系不確定，即便有直接關(guān)系的成分，其在制劑中的含量也不是越高越好。筆者認(rèn)為在中藥制劑開發(fā)過(guò)程中，采用“多成分”及“質(zhì)量標(biāo)志物”等為綜合指標(biāo)控制中藥和制劑的質(zhì)量是一種趨勢(shì)[13-15]，同時(shí)在篩選制劑制備工藝時(shí)應(yīng)注重與臨床所用湯劑的一致性。