金蓮花顆粒的高效液相指紋圖譜研究*

孫秀漫，周楚娟，楊佳彬，杜淑雯，曾彩芳△

（1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，廣東 廣州511447；2.廣州醫(yī)科大學(xué)，廣東 廣州511436）

金蓮花顆粒為毛茛科金蓮花屬草本植物金蓮花的中藥制劑，淺棕黃色，味甜、微苦，臨床應(yīng)用廣，常用于治療風(fēng)熱邪毒襲肺，以及高熱引起的上呼吸道感染、扁桃體炎及咽炎。金蓮花顆粒收錄于2015年版《中國藥典（一部）》[1]，但其僅收載了金蓮花相關(guān)制劑的含量測定方法，未記載其指紋圖譜的分析方法。目前鮮有關(guān)于金蓮花顆粒指紋圖譜研究的文獻(xiàn)報道，主要集中在其臨床藥效研究[2-6]。為保證該藥的安全性和有效性，有必要建立其質(zhì)量控制方法。而化學(xué)成分復(fù)雜的中藥材，單一的活性成分不能成為有效評價中藥優(yōu)劣真?zhèn)蔚闹笜?biāo)，單一成分的質(zhì)量控制也難以體現(xiàn)整體質(zhì)量，指紋圖譜是目前較適合的質(zhì)量控制方法[7-9]。金蓮花顆粒、金蓮花膠囊均為金蓮花相關(guān)制劑，關(guān)于金蓮花藥材及金蓮花膠囊的指紋圖譜均有報道[10-13]。不同制劑工藝對金蓮花藥材有效成分影響不同，故本研究中采用高效液相色譜（HPLC）法建立金蓮花顆粒特征圖譜，旨在為金蓮花顆粒的質(zhì)量控制及評估提供參考?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20A型高效液相色譜儀（日本島津公司），包括LC-20AT型四元泵、DGU-20A5R型在線真空脫氣機(jī)、SIL-20A型自動進(jìn)樣器、CTO-10Asvp型柱溫箱、SPD-20A型紫外檢測器、LC-Solution色譜工作站；80-2型離心機(jī)（上海手術(shù)機(jī)械廠）；AUW220D型分析天平（日本島津公司，精度為十萬分之一）；Centrifuge 5424 R型離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；XW-80A型旋渦混合儀（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；GM-0.33A型津騰隔膜真空泵（天津津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；SB-3200DTN型超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 試藥

甲醇、乙腈均為色譜純（德國默克股份兩合公司）；冰醋酸（分析純，天津市恒興化學(xué)試劑制劑有限公司）；金蓮花顆粒購自10個社會藥房（S1批號為1802062，S2批號為1801023，S3批號為1804106，S4批號為1801011，S5批號為1707163，S6批號為1804134，S7批號為1710210，S8批號為1804105，S9批號為1804128，S10批號為1805153，承德天原股份有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：AgilentC18柱（250mm×4.6mm，4.0μm）；檢測波長：254 nm；柱溫：30℃；流速：0.6 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；流動相：乙腈（A）-1%HAc水系統(tǒng)（B），梯度洗脫（0～15 min時10%→17%A，15～25.01 min時17%→25%A，25.01～60 min時25%→46%A，60～64.99 min時46%→10%A）。

2.2 溶液制備

取不同批次的金蓮花顆粒2 g，精密稱定，置150 mL具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.3HPLC指紋圖譜的建立

精密度試驗(yàn)：吸取同一批（批號為1801011）樣品1份，依法制備溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積，結(jié)果的RSD均小于2.0%（n=6）。采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004A版）軟件進(jìn)行相似度計算，以第1次進(jìn)樣所得色譜圖為參照，其余5次進(jìn)樣所得色譜圖與之比較。結(jié)果顯示，所得特征圖譜與對照模式的相似度均大于0.99，表明試驗(yàn)精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批（批號為1801011）樣品6份，依法制備供試品溶液，測定其指紋圖譜，結(jié)果相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于2.0%（n=6）。采用同一軟件進(jìn)行相似度計算，以第1次進(jìn)樣所得色譜圖為參照，其余5次進(jìn)樣所得色譜圖與之比較。結(jié)果顯示6次所測得的特征圖譜與所得共有模式的相似度均大于0.99，表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：吸取同一供試品溶液（樣品批號為1801011）10 μL，分別于0，2，4，8，12，24 h時進(jìn)樣，測定各指標(biāo)成分峰面積，結(jié)果相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于2.0%（n=6）。采用同一軟件進(jìn)行相似度計算，以第1次進(jìn)樣所得色譜圖為參照，其余5次進(jìn)樣所得色譜圖與之比較。結(jié)果所得色譜圖整體特征相似，相似度均大于0.99，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

圖110 批次金蓮花顆粒高效液相色譜特征圖譜重疊圖

2.4 指紋圖譜的建立及相似度分析

取10批次金蓮花顆粒，依法平行制備供試品溶液10份，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，得10批次的金蓮花顆粒HPLC特征圖譜重疊圖，詳見圖1。按中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004 A版）中進(jìn)行相似度評價，以S1樣品的指紋圖譜為參照譜圖，對照圖譜的生成采用中位數(shù)法，時間窗寬度為0.1，生成金蓮花顆粒特征圖譜共有模式，詳見圖2。相似度為0.994～0.999，詳見表1，表明金蓮花顆粒不同批次質(zhì)量較穩(wěn)定。從10批次金蓮花顆粒樣品分析結(jié)果顯示，根據(jù)特征峰的峰形、峰數(shù)、保留時間等共標(biāo)示出21個特征共有峰，其中峰2、峰4為2個最強(qiáng)峰，其次為峰6、峰7、峰17。根據(jù)所得10批次金蓮花顆粒樣品的HPLC特征圖譜，得出21個特征峰的絕對保留時間及絕對峰面積，以峰2為參照峰（S），分別計算各特征共有峰的相對保留時間、相對峰面積，以及各特征共有峰的平均相對保留時間及平均相對峰面積。結(jié)果表2。

圖2 金蓮花顆粒高效液相色譜特征圖譜共有模式圖

表110 批次金蓮花顆粒相似度

表210 批金蓮花顆粒高效液相色譜特征圖譜共有峰分析結(jié)果（±s，n=10）

表210 批金蓮花顆粒高效液相色譜特征圖譜共有峰分析結(jié)果（±s，n=10）

峰號峰號1 2（s）3 4 5 6 7 8 9 1 0 11平均相對保留時間（min）0.813±0.007 5 1.000 1.072±0.002 4 1.157±0.005 2 1.303±0.009 2 1.393±0.010 9 1.503±0.016 7 1.526±0.013 1 1.709±0.040 1 1.879±0.071 4 2.002±0.013 9平均相對峰面積0.101±0.017 4 1.000 0.080±0.030 3 1.957±0.241 5 0.080±0.014 9 0.280±0.026 0 0.216±0.018 8 0.052±0.013 3 0.069±0.015 6 0.043±0.015 2 0.090±0.008 6 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21平均相對保留時間（min）2.156±0.013 1 2.303±0.035 4 2.325±0.040 3 2.344±0.041 8 2.477±0.044 6 2.603±0.041 1 2.652±0.048 1 2.734±0.049 7 2.970±0.054 8 3.187±0.059 2平均相對峰面積0.105±0.009 2 0.034±0.004 0 0.040±0.005 8 0.046±0.010 6 0.031±0.004 5 0.091±0.026 2 0.044±0.006 0 0.069±0.006 9 0.058±0.009 1 0.099±0.010 8

3 討論

根據(jù)金蓮花化學(xué)成分相關(guān)文獻(xiàn)報道，選擇了4組流動相，分為是甲醇-醋酸（0.1%～0.5%）、乙腈-醋酸（0.1%～0.5%）、甲醇-水和乙腈-水，按不同比例，分別進(jìn)行梯度和等度洗脫。結(jié)果乙腈-醋酸（0.1%）系統(tǒng)梯度洗脫，各色譜峰分離度好，保留時間適中，故選擇乙腈-醋酸（0.1%）系統(tǒng)梯度洗脫為流動相。

對比了254，340，274 nm 3個波長下金蓮花顆粒的HPLC色譜圖。在340 nm波長下的出峰數(shù)較少，254 mm與274 nm波長下HPLC色譜圖相似，與254 nm波長相比，274 nm波長處峰響應(yīng)度較低，254 nm波長下檢測的各色譜峰分離度好，出現(xiàn)的色譜峰多，基線平穩(wěn)，故選取254 nm作為指紋圖譜檢測波長。同時對柱溫（25，30，40℃）和流速（0.6，0.7，0.8，1.0 mL/min）進(jìn)行了考察，結(jié)果表明，當(dāng)柱溫為30℃，流速為0.6 mL/min時，各色譜峰分離度好，保留時間適中。

收集的金蓮花顆粒樣品來自同一個廠家的不同包裝，對不同批次金蓮花顆粒進(jìn)行了指紋圖譜研究，并建立了金蓮花顆粒特征圖譜，共標(biāo)定了21個共有指紋峰，10批次金蓮花顆粒相似度為0.994～0.999，表明金蓮花顆粒不同包裝、不同批次間質(zhì)量較穩(wěn)定。

通過查閱金蓮花藥材及其制劑的文獻(xiàn)[13-15]可見，本研究中金蓮花顆粒指紋圖譜2～7號峰、11～12號峰與13～19號峰峰群與文獻(xiàn)[11]報道的金蓮花膠囊指紋圖譜相似，表明2個制劑指紋圖譜有相似性，這與2個制劑主要都是用金蓮花藥材制成有關(guān)。對比金蓮花藥材混合對照品圖譜及本研究中所得的金蓮花顆粒特征圖譜，推測本研究中共有模式圖中峰2為葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷，峰4為葒草苷，峰7為牡荊苷。

綜上所述，本研究中建立了金蓮花顆粒指紋圖譜，且該方法穩(wěn)定、重復(fù)性好，可為該藥的質(zhì)量控制提供參考。