CYP2D6抑制劑對(duì)艾瑞昔布大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)的影響*

何文娟，王偉美，貢 瑩，張志清△

（1.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，河北 石家莊050000；2.哈勵(lì)遜國(guó)際和平醫(yī)院，河北 衡水053000）

艾瑞昔布為環(huán)氧合酶（COX）-2抑制劑，為我國(guó)自主研發(fā)的化學(xué)藥品1.1類(lèi)新藥[1]。其通過(guò)抑制COX-2 mRNA的表達(dá)而發(fā)揮抗炎作用[2-3]，用于緩解骨關(guān)節(jié)炎的疼痛癥狀。CHEN等[4]研究表明，艾瑞昔布具有與羅非昔布相當(dāng)?shù)目寡鬃饔谩Ｅ亮_西汀作為一種選擇性5-羥色胺（5-HT）再攝取抑制劑，廣泛用于治療抑郁癥和強(qiáng)迫癥等疾病[5-6]。帕羅西汀既是細(xì)胞色素P450酶（CYP）2D6的底物，又是其強(qiáng)抑制劑，但對(duì)其他P450酶很少產(chǎn)生影響。因此常作為CYP2D6的選擇性抑制劑用于藥物相互作用的研究[7-10]。目前，有關(guān)艾瑞昔布體內(nèi)代謝機(jī)制的研究尚不完善。本研究中選擇帕羅西汀作為CYP2D6的選擇性抑制劑，比較合用帕羅西汀前后艾瑞昔布在大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)的變化，考察CYP2D6抑制劑對(duì)艾瑞昔布在大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)的影響，進(jìn)一步考察艾瑞昔布是否通過(guò)CYP2D6進(jìn)行代謝，從而完善艾瑞昔布體內(nèi)代謝機(jī)制的研究?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器、試藥與動(dòng)物

1.1 儀器

API 4000 Plus型液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀，配有電噴霧離子化源和Analyst 1.6.1數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（AB Sciex公司）；Prominence CBM-20A型液相色譜儀，配有二元梯度泵、在線脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器和柱溫箱（日本島津公司）。

1.2 試藥

艾瑞昔布對(duì)照品（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)為66311003，純度99.6%）；甲苯磺丁脲對(duì)照品（大連美侖生物技術(shù)有限公司，批號(hào)為20110601，純度99.4%）；艾瑞昔布片（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)為13052151，規(guī)格為每片0.1 g）；鹽酸帕羅西汀片（葛蘭素史克有限公司，批號(hào)為13060410，規(guī)格為每片20 mg）；甲酸和乙腈為色譜純，乙酸乙酯為分析純，水為屈臣氏蒸餾水。

1.3 動(dòng)物

健康雄性SD大鼠40只，清潔級(jí)，體質(zhì)量（220±20）g，由河北省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)為1401040。所有實(shí)驗(yàn)操作均符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)要求。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：30℃；流動(dòng)相：甲醇-水-甲酸（85∶15∶0.1，V/V/V）；等度洗脫；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 質(zhì)譜條件

離子化方式：電噴霧離子化源（ESI）；監(jiān)測(cè)方式：正離子監(jiān)測(cè)；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；離子源噴射電壓（IS）：5500 V；離子源溫度：550℃；氣簾氣（CUR）壓力：15 psi；霧化氣（GS1，N2）壓力：40 psi；輔助氣（GS2，N2）壓力：40 psi；碰撞氣壓力：6 psi；艾瑞昔布的DP和CE值分別為100 V和45 eV，甲苯磺丁脲的DP和CE值分別為22 V和32 eV；用于定量分析的離子反應(yīng)分別為m/z：370.1→236.2（艾瑞昔布）和m/z：270.1→155.2（甲苯磺丁脲）。

2.3 灌胃液制備

艾瑞昔布灌胃液：將艾瑞昔布片研成粉末，取約550mg（相當(dāng)于艾瑞昔布110mg），精密稱定，溶于1‰羧甲基纖維素溶液25 mL中，得質(zhì)量濃度約為4.40 mg/mL的艾瑞昔布灌胃液。

帕羅西汀灌胃液：將帕羅西汀片研成粉末，取帕羅西汀粉末約50 mg（相當(dāng)于帕羅西汀3.1 mg），精密稱定，溶于1‰羧甲基纖維素溶液7 mL中，得質(zhì)量濃度約為0.44 mg/mL的帕羅西汀灌胃液。

2.4 血漿樣品處理

取血漿200 μL，置5 mL離心管中，加內(nèi)標(biāo)溶液20 μL，渦旋混勻，加提取劑乙酸乙酯1 mL，渦旋混勻2 min，4 500×g離心6 min，取上清液置1.5 mL離心管中，40℃水浴氮?dú)獯蹈桑?00 μL流動(dòng)相復(fù)溶，10 μL進(jìn)樣測(cè)定。

2.5 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：取艾瑞昔布對(duì)照品溶液和內(nèi)標(biāo)溶液分別進(jìn)樣，得艾瑞昔布和內(nèi)標(biāo)甲苯磺丁脲色譜圖；分別取空白血漿、大鼠給藥后1 h的血漿樣品各200 μL，按2.4項(xiàng)下方法處理（其中空白血漿不加內(nèi)標(biāo)），進(jìn)樣，得空白血漿色譜圖及血漿樣品色譜圖。詳見(jiàn)圖1。結(jié)果表明，內(nèi)源性雜質(zhì)對(duì)艾瑞昔布和內(nèi)標(biāo)的測(cè)定無(wú)影響。

圖1 高效液相色譜質(zhì)譜圖

線性關(guān)系考察和最低定量限確定：制備艾瑞昔布質(zhì)量濃度依次為10，20，40，80，160，200，400 ng/mL的模擬血漿樣品，按2.4項(xiàng)下方法處理，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄艾瑞昔布和甲苯磺丁脲峰面積，以峰面積比值（Y）為縱坐標(biāo)、艾瑞昔布血漿濃度（X）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=0.016X+0.072，r=0.999 7（n=7）。結(jié)果表明，艾瑞昔布質(zhì)量濃度線性范圍為10～400 ng/mL，最低定量限為10 ng/mL。

回收試驗(yàn)和精密度試驗(yàn)：取空白血漿15份，分為3組，分別制備低、中、高（20，80，320 ng/mL）3種質(zhì)量濃度的艾瑞昔布模擬血漿樣品各5份，按2.4項(xiàng)下方法處理并分析，記錄艾瑞昔布和甲苯磺丁脲峰面積，并根據(jù)線性回歸方程計(jì)算艾瑞昔布的質(zhì)量濃度，該質(zhì)量濃度與理論質(zhì)量濃度的比值即方法回收率；于同日內(nèi)處理并測(cè)定，考察日內(nèi)精密度；連續(xù)5 d處理并測(cè)定，考察日間精密度。另取等量的艾瑞昔布和甲苯磺丁脲對(duì)照品溶液各20 μL，進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積；模擬血漿樣品中藥物峰面積與等量對(duì)照品溶液峰面積的比值，即提取回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：制備質(zhì)量濃度為80 ng/mL的艾瑞昔布模擬血漿樣品6份，分為兩組。一組即刻處理并測(cè)定，一組反復(fù)凍融3次后處理并測(cè)定，考察其反復(fù)凍融的穩(wěn)定性；一組即刻處理并測(cè)定，一組于-40℃保存30 d后處理并測(cè)定，考察低溫保存的穩(wěn)定性；一組按2.4項(xiàng)下方法處理后即刻進(jìn)樣測(cè)定，另一組按2.4項(xiàng)下方法處理后于4℃放置12 h進(jìn)樣測(cè)定，考察處理后的放置穩(wěn)定性。結(jié)果的RSD分別為2.1%，3.9%，2.1%（n=3），表明在上述條件下艾瑞昔布的穩(wěn)定性良好。

表1 回收試驗(yàn)和精密度試驗(yàn)結(jié)果（±s，n=5）

表1 回收試驗(yàn)和精密度試驗(yàn)結(jié)果（±s，n=5）

名稱艾瑞昔布RSD（%）日內(nèi)1.81 2.21 5.90日間1.13 2.38 8.19images/BZ_18_678_1699_714_1762.png±s，%）102.2±8.07 98.71±2.76 97.01±1.84質(zhì)量濃度（μg/mL）20 80 320 500方法回收率（內(nèi)標(biāo)提取回收率（%）61.65±1.79 65.33±3.27 72.57±2.39 51.84±1.71

2.6 藥代動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)

將健康雄性SD大鼠40只隨機(jī)分為兩組，各20只，實(shí)驗(yàn)組連續(xù)7 d灌胃帕羅西汀灌胃液（2 mg/kg），對(duì)照組灌胃1‰羧甲基纖維素溶液，每天固定時(shí)間給藥。第8天，每只大鼠灌胃艾瑞昔布（20 mg/kg，給藥前12 h禁食不禁飲），分別于給藥前（0 min）和給藥后10，20，30，45 min及1，1.5，2，3，4，6，8，12，24 h時(shí)眼底靜脈叢取血0.5mL，置肝素鈉抗凝離心管中，6500×g離心5 min，取血漿-40℃冷凍保存。

待測(cè)血漿室溫自然解凍，按2.4項(xiàng)下方法對(duì)血漿樣品進(jìn)行處理，根據(jù)當(dāng)日隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算每只大鼠各時(shí)間點(diǎn)的血藥濃度，繪制平均藥-時(shí)曲線（AUC）。詳見(jiàn)圖2。采用DAS 2.1.1軟件對(duì)血藥濃度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)矩?cái)M合，并計(jì)算相關(guān)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。詳見(jiàn)表2。采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)兩組大鼠的主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果顯示，合用帕羅西汀后，艾瑞昔布的AUC0-t，AUC0-∞，峰濃度（Cmax）均顯著升高，清除率（CL）顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明帕羅西汀可抑制艾瑞昔布的代謝，CYP2D6參與了艾瑞昔布的代謝。

圖2 兩組的平均藥-時(shí)曲線（n=18）

3 討論

CYP2D6在體內(nèi)的含量?jī)H次于CYP3A，分布于多個(gè)器官，如肝臟、大腦和骨骼肌等，代謝20%～25%的藥物[11-12]。因此，研究某一藥物與CYP2D6的作用關(guān)系對(duì)于研究該藥物的相互作用具有非常重要的意義。目前，只有體外研究結(jié)果顯示，肝微粒體酶CYP2D6參與艾瑞昔布的體外代謝過(guò)程。帕羅西汀為體內(nèi)CYP2D6的強(qiáng)抑制劑，且帕羅西汀與以CYP2D6酶系為代謝途徑的藥物聯(lián)用時(shí)，可影響其代謝，升高血藥濃度，甚至引起不良反應(yīng)[13]。故本研究中探討了CYP2D6是否參與艾瑞昔布的體內(nèi)代謝過(guò)程。

表2 兩組大鼠艾瑞昔布藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)（±s，n=18）

表2 兩組大鼠艾瑞昔布藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)（±s，n=18）

注：t1/2為半衰期，Tmax為達(dá)峰時(shí)間，CL為清除率，V為表觀分布容積。

藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)AUC0-24h[mg/（h·L）]AUC0-∞[mg/（h·L）]t1/2（h）Tmax（h）CL[L/（h·kg）]V（L/kg）Cmax（mg/L）實(shí)驗(yàn)組1 485.5±480.3 1 730.4±606.5 7.3±5.2 1.5±0.7 0.01±0.01 0.12±0.06 192.1±70.8對(duì)照組1 125.1±457.6 1 331.3±592.6 7.4±3.8 1.5±0.6 0.02±0.01 0.17±0.07 162.2±53.0 P值0.02 0.05 0.96 0.89 0.03 0.10 0.04

本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，經(jīng)CYP2D6抑制劑帕羅西汀預(yù)處理的大鼠，其體內(nèi)艾瑞昔布的Cmax增大為原來(lái)的1.18倍，表明艾瑞昔布在大鼠體內(nèi)的吸收速度變快；AUC升高為原來(lái)的1.32倍，表明艾瑞昔布在大鼠體內(nèi)的暴露量增加，生物利用度增加；CL降低為原來(lái)的65%，表明艾瑞昔布的代謝減慢。綜合分析，帕羅西汀抑制了艾瑞昔布在大鼠體內(nèi)的代謝，從而使其吸收增加、清除減慢，增大了艾瑞昔布在大鼠體內(nèi)的生物利用度。考慮帕羅西汀作為CYP2D6的特異性抑制劑，因而推斷CYP2D6參與了艾瑞昔布在大鼠體內(nèi)的代謝。該結(jié)果與體外大鼠肝微粒體酶實(shí)驗(yàn)[14]和重組人源肝微粒體酶研究[15]所得結(jié)果均一致，為CYP2D6參與艾瑞昔布的代謝提供了理論支持。

由于大鼠與人之間存在種屬差異，且實(shí)驗(yàn)中僅考察了帕羅西汀對(duì)艾瑞昔布在大鼠體內(nèi)代謝的影響，具有一定的局限性。故艾瑞昔布在人體內(nèi)的代謝途徑仍有待進(jìn)一步研究，以為臨床合理用藥提供更有力的依據(jù)。

本研究中選用帕羅西汀藥品而非對(duì)照品作為CYP2D6的選擇性抑制劑，主要基于以下考慮。首先，在人體的臨床研究中，受試者服用的均為藥品制劑，為保證和后續(xù)臨床研究的一致性，從而選擇帕羅西汀藥品而非對(duì)照品；其次，考慮到藥用輔料對(duì)提高給藥對(duì)象的安全性及減少不良反應(yīng)的發(fā)生具有一定作用，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物而言，更符合倫理要求；最后，藥品輔料屬商業(yè)機(jī)密，獲得帕羅西汀的輔料非常困難，且考慮到輔料的安全性已經(jīng)國(guó)家批準(zhǔn)，因而對(duì)肝酶產(chǎn)生作用的可能性不大。故最終選擇帕羅西汀藥品作為本研究中的選擇性抑制劑。