宮腔灌注粒細(xì)胞刺激因子對反復(fù)種植失敗患者妊娠結(jié)局的作用*

張曦倩, 羅燕群, 許虹, 朱秀蘭, 董梅, 劉風(fēng)華

廣東省婦幼保健院生殖中心(廣東廣州 511400)

隨著生育年限的推遲，不孕癥患者人數(shù)劇烈增加，接受體外受精-胚胎移植治療的不孕夫婦比例急劇增高。然而目前體外受精-胚胎移植術(shù)(IVF-ET)中單個移植周期胚胎植入率僅有20%～30%左右，妊娠率約50%，累積妊娠率達(dá)80%左右，但仍有近10%的女性患者多次移植胚胎均未能成功植入子宮內(nèi)膜，通常稱之為反復(fù)種植失敗(recurrent implantation failure, RIF)[1]。國內(nèi)外較為公認(rèn)的RIF定義為年齡<40歲，連續(xù)3次及以上鮮胚或凍胚移植, 至少移植4個優(yōu)質(zhì)胚胎, 未獲得臨床妊娠。目前認(rèn)為，胚胎的質(zhì)量和子宮內(nèi)膜容受性具有重要的影響，其中，子宮內(nèi)膜容受性占2/3[2]。子宮內(nèi)膜容受性是指子宮內(nèi)膜處于允許胚胎黏附、穿透并植入的一種狀態(tài)，稱為種植窗期。此時內(nèi)膜除受內(nèi)分泌系統(tǒng)調(diào)控外，免疫系統(tǒng)也參與了胚胎種植過程的調(diào)節(jié)[3]。近年來，隨著生殖免疫的發(fā)展，人們逐漸認(rèn)識到免疫因素在RIF中的重要作用。多年來，很多學(xué)者嘗試了不同的治療方式，試圖對種植窗期子宮內(nèi)膜進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)，其中包括淋巴細(xì)胞主動免疫、子宮內(nèi)膜輕刮術(shù)、靜脈滴注免疫球蛋白、口服潑尼松和阿司匹林、宮腔灌注外周血單個核細(xì)胞[4]和自體淋巴細(xì)胞等，取得了一定的效果，但妊娠率仍無法滿足臨床的要求[5]。粒細(xì)胞刺激因子(granulocyte-stimulating factor, G-CSF)是正常妊娠母胎對話中調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜免疫細(xì)胞功能的重要細(xì)胞因子之一。已有研究證明，外源性G-CSF是一個強(qiáng)有力的NK細(xì)胞數(shù)量和功能抑制劑，提示宮腔灌注可能調(diào)節(jié)子宮局部免疫或降低子宮內(nèi)膜的免疫異常[6]?；谏鲜鲅芯浚崾窘?jīng)G-CSF對子宮內(nèi)膜容受性起正向的調(diào)節(jié)作用，可能有助于胚胎的種植。但目前對于G-CSF宮腔內(nèi)灌注治療體內(nèi)研究甚少[7]。本研究對30例擬行冷凍胚胎移植的RIF患者進(jìn)行G-CSF宮腔內(nèi)灌注治療，并與20例對照組RIF患者妊娠結(jié)局比較，探討G-CSF宮腔內(nèi)灌注治療對RIF患者妊娠結(jié)局的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 研究對象為2016年3月至2018年12月間來我院就診的不孕不育癥患者。RIF患者入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡20～39歲女性；(2)新鮮或凍融胚胎移植的反復(fù)種植失敗的不孕癥患者； (3)連續(xù)移植3次累積超過4個優(yōu)質(zhì)胚胎者均未獲臨床妊娠患者。

對照組入選標(biāo)準(zhǔn)：輸卵管因素(輸卵管積水除外)或者男方因素行IVF/卵泡漿內(nèi)單精子注射(ICSI)助孕且臨床妊娠成功分娩的患者。

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡<20歲或≥40歲；(2)子宮解剖異常：縱隔子宮、雙角子宮、雙子宮、單角子宮、始基子宮等；(3)子宮和宮腔器質(zhì)性病變：宮腔內(nèi)膜息肉、結(jié)核、子宮肌瘤等; (4)宮腔鏡證實(shí)宮腔粘連；(5)慢性疾病(如高血壓、糖尿病)、精神病等；(6)子宮內(nèi)膜異位癥；(7)子宮內(nèi)膜菲薄；(8)宮腔鏡或者病理結(jié)果證實(shí)子宮內(nèi)膜炎未經(jīng)治療患者；(9)血栓前狀態(tài)。

1.2 方法

1.2.1 分組方法 按隨機(jī)數(shù)表法將研究者分成治療組(宮腔灌注G-CSF治療組)和對照組(口服5 mg強(qiáng)的松治療組)。

1.2.2 宮腔灌注治療時間 第1次灌注治療時間：自然周期卵泡晚期或者激素補(bǔ)充治療(HRT)人工周期補(bǔ)充雌激素12 d左右；第2次灌注治療時間：自然周期排卵日或者HRT人工周期孕酮添加行內(nèi)膜轉(zhuǎn)化日行宮腔灌注治療。

1.2.3 宮腔灌注的操作步驟 G-CSF(瑞白，齊魯制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字$19990049)宮腔灌注患者均簽署書面知情同意書。常規(guī)外陰陰道消毒后，1 mL注射器連接COOK一次性人工授精管，抽吸G-CSF 150 μg緩慢注入宮腔。宮腔灌注后患者臥床30 min，每5 min改變體位1次，讓藥物涂布宮腔。子宮內(nèi)膜厚度和血流均為黃體酮轉(zhuǎn)化日經(jīng)陰道B超測量獲取，均由同一名主治醫(yī)師完成測量。

1.2.4 胚胎冷凍及解凍 利用玻璃化冷凍/解凍液和Cryotop冷凍載體進(jìn)行卵裂期胚胎冷凍/解凍。復(fù)蘇后胚胎卵裂球數(shù)目大于或等于冷凍胚胎卵裂球數(shù)目一半則為復(fù)蘇存活胚胎。

1.2.5 胚胎評分標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)Peter卵裂期胚胎評分系統(tǒng)選擇優(yōu)質(zhì)胚胎進(jìn)行胚胎移植。

1.2.6 子宮內(nèi)膜的準(zhǔn)備方案 將研究對象分為兩種不同的處理方式，其中月經(jīng)規(guī)律、正常排卵或內(nèi)膜厚度≥8 mm的研究對象行自然周期；否則行雌孕激素替代療法,即人工周期。

1.2.7 胚胎的移植方法 在B超的介導(dǎo)下將載有胚胎的移植管置入患者的子宮內(nèi)，將要移植的胚胎注入宮腔內(nèi)，停留片刻，隨后退出移植管。

1.2.8 移植后黃體支持治療與隨訪 移植后常規(guī)激素治療，移植后的第14天進(jìn)行血清人絨毛膜促性腺激素(HCG)水平檢測并判斷與否。HCG陽性者為生化妊娠，并繼續(xù)動態(tài)監(jiān)測血清HCG，胚胎移植后1個月行超聲檢查，如可見孕囊或胎心搏動，即診斷為臨床妊娠。

2 結(jié)果

2.1 研究對象一般情況 本研究共納入59例擬行冷凍胚胎移植的RIF患者，對照組29例，平均年齡為(35.3±3.2)歲，治療組30例，平均年齡為(34.5±3.6)歲，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。兩組患者血清卵泡刺激素(FSH)、黃體生成素(LH)、雌二醇(E2)均差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。兩組患者取卵周期數(shù)、移植周期數(shù)、移植胚胎數(shù)、單周期移植優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)均差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.2 冷凍胚胎移植前內(nèi)膜準(zhǔn)備情況 對照組中采用人工周期的患者為13個，采用自然周期的患者為17個，平均子宮內(nèi)膜厚度為(9.6±2.1)mm，治療組中采用人工周期的患者為14個，采用自然周期的患者為16個，平均子宮內(nèi)膜厚度為(9.8±1.8)mm，二者對比均差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

2.3 移植胚胎的情況 對照組共解凍冷凍胚胎87枚，存活胚胎82枚，存活率為94.3%。治療組共解凍冷凍胚胎90枚，存活胚胎84枚，存活率為93.3%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(2=0.002、P=0.964)。對照組在29個移植周期內(nèi)共移植胚胎82枚，平均移植(2.8±0.6)枚優(yōu)質(zhì)胚胎。治療組在30個移植周期內(nèi)共移植胚胎84枚，平均移植(2.8±0.4)枚優(yōu)質(zhì)胚胎。兩組對比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

2.4 妊娠結(jié)局的比較 對照組胚胎種植率為11.0%(9/82)，治療組胚胎種植率為23.8%(20/84)，治療組胚胎種植率高于對照組 (P>0.05)。對照組臨床妊娠率為17.2%(5/29)，治療組臨床妊娠率為53.3%(15/30)，治療組臨床妊娠率高于對照組，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。對照組單周期活嬰出生率為17.2%(5/29)，治療組單周期活嬰出生率為53.3%(16/30)。治療組胚胎活嬰出生率高于對照組(P<0.05)，見表3。

項(xiàng)目對照組治療組t值P值例數(shù)2930年齡35.3±3.234.5±3.60.9010.371BMI(kg/m2)21.8±2.222.0±2.50.3260.746不孕年限(年)7.2±2.47.4±2.60.3070.761FSH(IU/L)5.8±1.95.4±2.30.7270.470LH(U/L)5.3±1.35.5±1.20.6150.542E2 (pmol/L) 164±14.7168±15.41.0200.313取卵周期數(shù)(個)3.5±1.23.2±1.60.8130.420移植周期數(shù)(個)4.6±1.74.2±1.50.9590.342移植胚胎數(shù)(枚)2.4±0.42.6±0.51.6930.096單周期移植優(yōu)質(zhì)1.7±0.81.8±0.70.5120.611 胚胎數(shù)(枚)

表2 兩組冷凍胚胎移植周期內(nèi)膜準(zhǔn)備方案比較例(%)

項(xiàng)目對照組治療組t/2值P值移植周數(shù)2930移植胚胎總數(shù)8284臨床妊娠周期數(shù)[例(%)]5(17.2)16(53.3)8.3790.004胚胎種植數(shù)[例(%)]9(11.0)20(23.8)4.7400.030平均移植胚胎數(shù)2.8±0.62.8±0.40.0010.999平均移植優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)(枚)2.2±0.82.4±0.61.0890.281活嬰出生數(shù)5168.3790.004

3 討論

妊娠作為一種同種異體移植，需避免母體免疫系統(tǒng)對胎兒產(chǎn)生排斥作用。因此，子宮局部免疫系統(tǒng)能否耐受胚胎抗原直接影響了妊娠的建立和維持[8]。

近年來，控制性超促排卵方案、 實(shí)驗(yàn)室胚胎培養(yǎng)以及移植技術(shù)不斷優(yōu)化為越來越多的家庭帶來了希望，但是， RIF 仍是臨床工作中的一個難題[9]。目前的研究進(jìn)展表明，引起RIF的主要因素包括許多方面，主要有宮腔異?；蛘尺B、子宮內(nèi)膜菲薄、免疫排斥、子宮內(nèi)膜炎以及黏附分子表達(dá)異常等。通過改善子宮內(nèi)膜容受性、優(yōu)化胚胎選擇、加強(qiáng)胚胎內(nèi)膜同步化以及優(yōu)化移植技術(shù)等大大提高了RIF患者的胚胎種植率。甾體類激素、抗凝藥物、宮腹腔鏡手術(shù)和內(nèi)膜搔刮機(jī)械刺激等方法都在臨床上得到了不同程度的運(yùn)用，但均有藥物不良反應(yīng)和操作疼痛等缺點(diǎn)。因此，尋找操作更簡便、無疼痛、患者依從性更好的治療方法是目前研究的方向。

越來越多的文獻(xiàn)報道，RIF與母胎界面免疫系統(tǒng)的失衡相關(guān)，即子宮內(nèi)膜局部免疫調(diào)節(jié)存在異常。自體G-CSF宮腔內(nèi)灌注治療作為一種新型的技術(shù)，在RIF的治療中越來越受到關(guān)注[10]。

本研究共納入59例擬行冷凍胚胎移植的RIF患者，對照組29例，治療組30例。其基礎(chǔ)年齡、BMI、不孕年限方面均差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。有研究顯示，基礎(chǔ)激素水平的差異可能引起妊娠差異，但本研究納入的研究對象在FSH、LH、E2這三項(xiàng)基本指標(biāo)方面沒有明顯區(qū)別。兩組患者均為反復(fù)種植失敗患者，我們評估了兩組患者的既往情況，發(fā)現(xiàn)其在既往平均取卵周期數(shù)、平均移植周數(shù)、平均移植胚胎數(shù)、平均移植優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)方面均差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，由此可見，治療組與對照組在可能影響胚胎移植成功率的因素方面均無明顯差別。

其次，我們評估了兩組冷凍胚胎移植周期內(nèi)膜準(zhǔn)備方案，二者在人工周期的實(shí)施上，并無明顯差別，內(nèi)膜情況亦無明顯差異。在進(jìn)一步評估復(fù)蘇胚胎的存活率后，我們發(fā)現(xiàn)，治療組與對照組并無明顯差別。

最終結(jié)果顯示，治療組有16例患者獲得臨床妊娠，胚胎種植率(23.8%)高于對照組(11.0%)(P<0.05)，臨床妊娠率亦顯著高于對照組(17.2%)(P<0.05)，提示G-CSF官腔內(nèi)灌注治療可能有利于胚胎種植。

G-CSF宮腔內(nèi)灌注治療 RIF 的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。研究發(fā)現(xiàn)人子宮內(nèi)膜和母胎界面均有表達(dá)G-CSF受體，人子宮基質(zhì)CD56+細(xì)胞和CD3+細(xì)胞均可檢測到G-CSF受體[11]。G-CSF是正常妊娠母胎對話中調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜免疫細(xì)胞功能的重要細(xì)胞因子之一，被證明在外源性給人類患者或動物時具有免疫調(diào)節(jié)作用[12]。

Morris等研究[13]發(fā)現(xiàn)小鼠結(jié)腸癌模型中，采用anti-GCSF治療組與對照組相比NK1.1和CD3+細(xì)胞增加3倍以上，CD4+T細(xì)胞增加5倍，而CD8+細(xì)胞增加3倍，阻斷G-CSF作用后，白細(xì)胞介素(IL)-10明顯減少，IL-12增加(IL-12能激活NK細(xì)胞活性), γ-干擾素(IFN-γ):IL-10 比例明顯增加；穿孔素增加了4.61倍,granzyme B增加了3.14倍。提示anti-GCSF治療可通過增加NK細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞數(shù)量誘導(dǎo)抗腫瘤免疫。同時也有證據(jù)提示改變Th1/TH2、CD4+/CD8+T細(xì)胞亞群的比值或者有溶解細(xì)胞活性。國外學(xué)者在糖尿病和移植物抗宿主疾病研究發(fā)現(xiàn)G-CSF支持調(diào)節(jié)T細(xì)胞(Tregs)的積累，且G-CSF誘導(dǎo)T細(xì)胞產(chǎn)生IL-10[14-17]。Rondelli等證明G-CSF處理的外周血單個核細(xì)胞中CD16+、CD56+和CD57+NK細(xì)胞的比例顯著降低[18]。Jeffrey則發(fā)現(xiàn)用G-CSF動員搜集外周血前體細(xì)胞時，NK細(xì)胞功能改變和NK細(xì)胞祖細(xì)胞減少，表明添加少量的G-CSF可能會降低體外NK細(xì)胞的生長和功能[19]。

Schlahsa等[20]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在移植物抗宿主疾病的研究中發(fā)現(xiàn)，接受G-CSF治療的移植患者顯示NK細(xì)胞功能受損和外周血中NK細(xì)胞數(shù)量減少，G-CSF被證實(shí)是一個強(qiáng)有力的NK細(xì)胞功能抑制劑。在體外G-CSF被發(fā)現(xiàn)是通過下調(diào)腫瘤壞死因子-α(TNF-α)產(chǎn)生而影響NK細(xì)胞和細(xì)胞毒[21]。分子學(xué)相關(guān)研究為G-CSF臨床應(yīng)用于反復(fù)種植失敗患者，對其進(jìn)行免疫干預(yù)提供了理論依據(jù)[22-23]。

本研究中治療組共有16個活嬰出生，對照組有 5個活嬰出生。目前暫未發(fā)現(xiàn)該項(xiàng)治療方法對子代發(fā)育有不良影響。兩組患者分娩的嬰兒均無畸形，但是需要進(jìn)一步隨訪G-CSF宮腔內(nèi)灌注的治療方法對子代發(fā)育是否有影響。

本文結(jié)果表明，自宮腔內(nèi)灌注治療可提高RIF患者臨床妊娠率及胚胎種植率。本研究提示G-CSF宮腔內(nèi)灌注是治療 RIF 的有效方法，且操作方便，依從性好， 對RIF患者提高妊娠率具有一定意義。