DOX@CaCO3復(fù)合藥物研制及在骨肉瘤中的應(yīng)用效果*

李天博, 高磊, 王江寧

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院矯形外科(北京 100038)

骨腫瘤是發(fā)生于骨骼的惡性腫瘤。骨肉瘤作為骨腫瘤的一種，常在20歲以下年齡段發(fā)病，且患者的5年生存率很低，通過(guò)單純的手術(shù)治療，患者的生存率僅有20%左右[1-3]。因此，手術(shù)治療聯(lián)合化療等手段成為骨肉瘤最重要的治療手段之一，進(jìn)而改善骨肉瘤患者的預(yù)后。順鉑、阿霉素、甲氨蝶呤等高效廣譜抗癌藥，對(duì)多種腫瘤具有良好的治療效果[4-6]。然而，腫瘤組織對(duì)化療藥物的敏感性低，導(dǎo)致了化療藥物的療效差；化療藥物本身毒副作用大、非特異性全身血液運(yùn)輸，造成了全身的毒副作用[7-8]。因此，提高化療藥物在腫瘤附近的敏感性和降低全身循環(huán)成為提高化療藥物在骨肉瘤治療的關(guān)鍵所在[9]。近年來(lái)，納米生物材料已經(jīng)廣泛應(yīng)用于對(duì)腫瘤的診斷和治療[10-14]。其中，納米生物材料通過(guò)設(shè)計(jì)空隙結(jié)構(gòu)，用于裝載具有高毒性的化療藥物可以有效降低血液循環(huán)中的毒副作用，減少不良反應(yīng)；此外，納米藥物通過(guò)高通透性和滯留效應(yīng)(EPR)，被動(dòng)運(yùn)輸并滯留在腫瘤環(huán)境，在腫瘤微環(huán)境進(jìn)行緩釋化療藥物，進(jìn)一步降低藥物在體內(nèi)積累形成的不良反應(yīng)[15-18]。此外，通過(guò)對(duì)納米藥物的腫瘤微環(huán)境(酶、酸堿性、電荷)響應(yīng)，從而控制藥物的定點(diǎn)釋放，達(dá)到對(duì)化療藥物的特異性給藥的目的[19-20]。碳酸鈣作為一種使用最廣泛的無(wú)機(jī)納米化合物，由于其具有高含鈣量，已經(jīng)作為補(bǔ)鈣技廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、生物技術(shù)等多個(gè)領(lǐng)域[21-23]。此外，通過(guò)不同的合成技術(shù)對(duì)碳酸鈣的結(jié)構(gòu)調(diào)控，可以使得碳酸鈣具有了空隙結(jié)構(gòu)，通過(guò)上載的方法，將化療藥物載入納米碳酸鈣中；此外，碳酸鈣可以在酸性環(huán)境下分解作為藥物載體后可在酸性環(huán)境緩釋化療藥物。與正常的細(xì)胞及組織相比，骨肉瘤腫瘤組織會(huì)體現(xiàn)出比較低的pH值(5.5～6.8)，通過(guò)在低pH環(huán)境的響應(yīng)，實(shí)現(xiàn)酸響應(yīng)從而可控釋放藥物。分解的鈣離子作為補(bǔ)鈣劑，減少骨質(zhì)由于腫瘤形成的缺損。這種既能夠降低化療藥物毒性，又能夠減少鈣缺失的治療方案有望成為骨肉瘤治療的新策略[24-28]。本研究于2018年11月至2019年8月，合成碳酸鈣納米顆粒用于包裹常用化療藥物阿霉素，通過(guò)對(duì)包裹藥物的碳酸鈣顆粒結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、體外細(xì)胞毒性、體內(nèi)藥物分布、體內(nèi)腫瘤抑制等不同方面評(píng)價(jià)此納米載藥體系對(duì)骨肉瘤的治療效果，希望可改善目前化療藥治療骨肉瘤過(guò)程中的不良反應(yīng)，減少患者痛苦，提升患者生活質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1 材料 體重約25 g，5～6周雄性BALB/c裸鼠(北京維通利華公司)；鼠源骨肉瘤細(xì)胞K7(協(xié)和細(xì)胞庫(kù)購(gòu)買(mǎi))。

1.2 方法

1.2.1 載藥顆粒的合成 碳酸鈣納米顆粒的制備：碳酸鈣納米顆粒的制備，我們采用的是降溫制備法，從而可控地合成粒徑均一的碳酸鈣。配置2 mol/L的氯化鈣溶液，并取1.5 mL加入到反應(yīng)瓶中，加入磁子之后，放置在冰水浴中，利用磁力攪拌器以600 r/min攪拌30 min，待溶液穩(wěn)定后，以900 r/min加速攪拌溶液，并向其中緩慢滴加2.5 mL碳酸鈉溶液(冰水溶液，1 mol/L)，15 min后，向反應(yīng)瓶中加入5 mL去離子水并停止攪拌終止反應(yīng)，靜置后用過(guò)濾瓶濾出沉淀。取上清液，加入15 mL 離心管中，以5 000 r/min離心轉(zhuǎn)5 min，收集沉淀物。將沉淀物烘干備用。

載阿霉素碳酸鈣納米顆粒的制備：配制1 mol/L的DOX·HCl水溶液。精確稱(chēng)取上述碳酸鈣烘干粉，利用去離子水配成質(zhì)量濃度為5 g/L的納米粒子分散液并調(diào)節(jié)其pH值至8.0。將1 mL DOX·HCl水溶液緩慢滴加到該堿性溶液中，邊滴加邊攪拌，避光室溫下攪拌過(guò)夜。反應(yīng)12 h后，通過(guò)對(duì)混合液13 000 r/min離心30 min收集沉淀物，棄上清液從而去除過(guò)量的DOX·HCl。將沉淀物利用凍干機(jī)凍干，制得復(fù)合藥物凍干粉，即制得載阿霉素碳酸鈣復(fù)合納米藥物 (以下簡(jiǎn)稱(chēng)復(fù)合藥物)。

1.2.2 復(fù)合藥物納米顆粒的表征 通過(guò)透射電鏡(TEM)測(cè)定復(fù)合藥物的顆粒形貌來(lái)驗(yàn)證；通過(guò)粒度儀分析并獲得復(fù)合藥物納米顆粒的水合粒徑大小。

1.2.3 復(fù)合藥物酸響應(yīng)性的表征 配制pH值分別為5.2、6.8、7.2的緩沖溶液用于酸性響應(yīng)的檢測(cè)。稱(chēng)取相同質(zhì)量的復(fù)合藥物納米顆粒，溶解于10 mL的水中并封裝入透析袋中，然后完全浸入100 mL pH值為5.2、6.8、7.2的緩沖溶液中，置于37 ℃搖床中避光恒溫震蕩。待作用2 h后，通過(guò)UV-Vis外標(biāo)法檢測(cè)復(fù)合藥物納米顆粒在不同pH值下的藥物的釋放量，并繪制圖譜。

1.2.4 細(xì)胞毒性驗(yàn)證 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)采用的是CCK8法。鼠源骨肉瘤細(xì)胞K7以104個(gè)/孔的數(shù)量接種到96孔培養(yǎng)板中，在二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育24 h。配置不同含有藥物的培養(yǎng)基，200 μL含藥物的培養(yǎng)基。藥物濃度分別為0.15、0.3、0.6、1.2、2.5、5、10 mg/mL,對(duì)照組加入與上述藥物濃度相同濃度的游離DOX溶液，給藥后共培育24 h。待孵育完全后，向孔內(nèi)加入20 μL的5 g/L CCK8溶液，隨后繼續(xù)培養(yǎng)4 h。然后吸出所有培養(yǎng)基，每孔加入150 μL二甲基亞砜，震蕩5 min后，檢測(cè)490 nm處的吸光度值。

篩選上述半數(shù)致死率的濃度5 mg/mL，利用該濃度給定相同的藥物，按照上述的培養(yǎng)細(xì)胞方式，將生長(zhǎng)良好的鼠源骨肉瘤細(xì)胞K7以104個(gè)/孔的數(shù)量接種到96孔培養(yǎng)板中，在二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育24 h。設(shè)定7組內(nèi)部對(duì)照組，在每隔0、1、3、6、12、24、72 h向孔內(nèi)加入20 μL的5 g/L CCK8溶液，隨后繼續(xù)培養(yǎng)4 h。然后吸出所有培養(yǎng)基，每孔加入150 μL二甲基亞砜，震蕩5 min后，檢測(cè)490 nm處的吸光度值。

1.2.5 動(dòng)物模型構(gòu)建及在體安全性驗(yàn)證 取18只BALB/C小鼠，向小鼠皮下注射100 μL鼠源骨肉瘤細(xì)胞K7懸液(約含細(xì)胞2.5×106個(gè))，制備皮下腫瘤模型。當(dāng)平均腫瘤體積大約到達(dá)50 mm3時(shí)，隨機(jī)分為3組，每組6只：DOX@CaCO3組實(shí)驗(yàn)組尾靜脈注射含載藥納米微粒的PBS，DOX組尾靜脈注射含游離阿霉素的PBS，PBS組尾靜脈注射PBS，給藥量以阿霉素5 mg/kg為標(biāo)準(zhǔn)。每4 d治療1次，共治療3次。每天測(cè)量并記錄腫瘤大小和小鼠體重。

2 結(jié)果

2.1 納米復(fù)合藥物的合成驗(yàn)證 如圖1-A所示：通過(guò)透射電鏡觀察可以得出，納米復(fù)合藥物的粒徑70 nm左右的規(guī)則球狀，通過(guò)灰度可以觀察發(fā)現(xiàn)，納米復(fù)合藥物為實(shí)心球狀，且分散均勻。將納米復(fù)合藥物溶解于水中，通過(guò)粒度儀檢測(cè)其水合粒徑發(fā)現(xiàn)，其水合粒徑大小為98 nm(圖1-B)；較之于透射電鏡所示，納米顆粒的水合粒徑有增加。

圖1-C所示，在pH 7.2時(shí)，通過(guò)半透膜透過(guò)的藥物含量極少，在72 h時(shí)，僅為負(fù)載量的12%，這是由于合成的復(fù)合藥物表面存在微孔，長(zhǎng)期的水溶液會(huì)使得極少量藥物通過(guò)布朗運(yùn)動(dòng)擴(kuò)散到水溶液中，從而通過(guò)半透膜透出；當(dāng)pH 6.8 時(shí)，水中存在的H+可以對(duì)碳酸鈣表面形成微弱的腐蝕作用，藥物的最高釋放量達(dá)到21.3%；當(dāng)pH 5.2時(shí)，水中存在的H+提高了，碳酸鈣的溶解效率提高，在72 h可以釋放62.7%的DOX藥物。

2.2 細(xì)胞毒性結(jié)果 在檢測(cè)復(fù)合納米藥物體外可行后，驗(yàn)證藥物的細(xì)胞殺滅效果。如表1所示,我們利用不同濃度的藥物對(duì)細(xì)胞進(jìn)行殺滅。藥物作用時(shí)間為12 h時(shí)，載藥納米微粒與游離阿霉素殺傷骨肉瘤細(xì)胞K7半數(shù)致死率的質(zhì)量濃度分別為2.6、4.5 mg/L；繼續(xù)孵育細(xì)胞，作用時(shí)間至24 h時(shí)，載藥納米微粒與游離阿霉素均將骨肉瘤細(xì)胞殺死。此外，我們利用12 h的半致死率濃度，研究藥物在不同時(shí)間段對(duì)細(xì)胞的殺傷作用。如表2所示，盡管在前24 h內(nèi)游離的DOX比納米復(fù)合藥物致死率高，然而在到72 h，納米復(fù)合藥物比DOX致死率高。

注：A：透射電鏡示意圖，復(fù)合藥物呈現(xiàn)球狀，控制粒徑在100 nm左右；B：水合粒徑示意圖，復(fù)合藥物的水合粒徑與透射電鏡展示的粒徑相符；C： 復(fù)合藥物在不同酸性環(huán)境pH 7.2、 6.8、 5.2 下藥物的釋放量

圖1復(fù)合藥物DOX@CaCO3的表征

表1 不同藥物在不同濃度作用下骨肉瘤細(xì)胞K7的平均存活率 %

表2 不同藥物作用時(shí)間下骨肉瘤細(xì)胞K7的平均存活率 %

2.3 腫瘤治療實(shí)驗(yàn)結(jié)果 在活體動(dòng)物中開(kāi)展藥物的治療驗(yàn)證。荷瘤鼠構(gòu)建成功后，分別設(shè)置3個(gè)組， 3組小鼠分別注射PBS、 DOX、 DOX@CaCO3開(kāi)始治療。如圖2-A可見(jiàn)，經(jīng)過(guò)治療周期22 d后，PBS組腫瘤體積達(dá)(607±163) mm3，DOX組平均腫瘤體積達(dá)(514±173) mm3，DOX@CaCO3組平均腫瘤體積為(212±89) mm3。盡管DOX@CaCO3組對(duì)腫瘤具有治療作用，但仍然具有腫瘤細(xì)胞存活。圖2-A的模型動(dòng)物沒(méi)有進(jìn)行手術(shù)切除直接注射藥物，盡管腫瘤有一定程度的抑制，但是腫瘤還在繼續(xù)生長(zhǎng)，只能從生長(zhǎng)速率判定腫瘤的生長(zhǎng)效果。為進(jìn)一步驗(yàn)證療效，我們決定采用先手術(shù)，切除部分腫瘤后，留下較小的瘤塊，再給藥，如圖2-B為藥物治療期間小鼠腫瘤體積變化，研究發(fā)現(xiàn)，整體給藥后的小鼠腫瘤都在變小，DOX@CaCO3組復(fù)合納米藥物組減小的趨勢(shì)明顯。

3 討論

骨肉瘤常發(fā)于青少年，術(shù)后化療是目前骨肉瘤治療最常見(jiàn)的方式之一。但化療藥物對(duì)骨肉瘤不敏感以及全身給藥的毒副作用，為患者造成很大的負(fù)擔(dān)[13]。鹽酸阿霉素作為細(xì)胞周期非特異性抗腫瘤藥，對(duì)多種腫瘤細(xì)胞均有殺傷作用[29]。然而，與大量的化療藥物相同，它對(duì)骨肉瘤敏感度低，且全身毒副作用也很大。近年來(lái)，新發(fā)展的復(fù)合納米藥物技術(shù)、即納米載藥系統(tǒng)為降低化療藥物毒副作用，提高藥物對(duì)腫瘤的敏感度具有良好的作用。通過(guò)溶解或包埋等技術(shù)設(shè)計(jì)納米載藥材料，將化療藥物吸附或溶解在納米顆粒內(nèi)部或表面，通過(guò)納米藥物在體EPR作用將藥物遞送到腫瘤附近，實(shí)現(xiàn)了藥物在腫瘤附近的緩釋?zhuān)瑥亩徑饬怂幬镌隗w的毒副作用。此外，納米載體可以通過(guò)設(shè)計(jì)對(duì)腫瘤微環(huán)境進(jìn)行相應(yīng)，真正實(shí)驗(yàn)在腫瘤環(huán)境中藥物釋放的目的。目前常用的載藥體系有脂質(zhì)體、氧化硅等物質(zhì)，然而這種物質(zhì)不具備腫瘤微環(huán)境響應(yīng)的特性，因此，我們利用了一種可以在酸性環(huán)境下溶解緩釋藥物的碳酸鈣納米顆粒開(kāi)展進(jìn)一步的研究。

注：A：腫瘤體積變化(沒(méi)有進(jìn)行手術(shù)切除)；B：腫瘤體積變化(進(jìn)行了部分手術(shù)切除)

圖2復(fù)合藥物DOX@CaCO3、DOX·HCl與PBS藥物在小鼠腫瘤處的療效評(píng)估

在本次研究中，我們合成的碳酸鈣納米藥物復(fù)合物能夠?qū)崿F(xiàn)化療藥物向骨肉瘤細(xì)胞呈遞并且調(diào)控釋放的目的。透射電鏡觀察顯示，碳酸鈣納米藥物具有形態(tài)規(guī)整的、均一的球狀顆粒，粒徑大小在70 nm左右。水合粒徑的驗(yàn)證證明了納米顆粒具有良好的水分散性，能夠?yàn)榧{米顆粒在溶液環(huán)境中酸性分解產(chǎn)生水膜。為了證明載藥納米微粒的穩(wěn)定性，實(shí)驗(yàn)測(cè)量了不同pH值條件下復(fù)合納米藥物的藥物釋放水平，發(fā)現(xiàn)在常規(guī)pH值(7.2)條件下，復(fù)合納米藥物的緩釋效率很低，只有自由擴(kuò)散的部分藥物；但隨著pH值降低，載藥納米微粒的結(jié)構(gòu)開(kāi)始變得不穩(wěn)定，在酸性環(huán)境下降解，研究表明，藥物的釋放量與環(huán)境中的酸度呈正相關(guān)。這樣，載藥納米微粒就具備了微環(huán)境酸性降解的功能。在細(xì)胞層面，我們驗(yàn)證了復(fù)合納米藥物體系對(duì)骨肉瘤細(xì)胞具有長(zhǎng)效殺傷作用，其在24 h內(nèi)，半致死率低于游離的DOX藥物，同時(shí)這也證明了游離DOX的毒副作用比復(fù)合納米藥物的毒副作用高。在72 h的緩釋過(guò)程中，復(fù)合納米藥物明顯優(yōu)于游離阿霉素產(chǎn)生的腫瘤細(xì)胞殺傷作用。在體研究中，不論是直接治療組，還是手術(shù)切除后化療組，復(fù)合納米藥物都比游離的鹽酸阿霉素藥物對(duì)小鼠的腫瘤治療具有良好的作用，結(jié)果表明相對(duì)于游離阿霉素來(lái)說(shuō)，載藥納米微粒可明顯減小游離化療藥物的系統(tǒng)毒性，提高其安全性。降低了化療藥物的全身不良反應(yīng)。研究通過(guò)碳酸鈣納米顆粒實(shí)現(xiàn)了化療藥物的腫瘤部位，碳酸鈣在腫瘤微環(huán)境中緩釋藥物可以提高化療藥物的利用率，并且降低了由化療藥物帶來(lái)的不良反應(yīng)，提高治療效果。

在此次研究中所合成的復(fù)合納米藥物具有尺度均一，分散狀態(tài)良好，且在腫瘤酸性微環(huán)境可控釋放化療藥物的材料，通過(guò)體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)證明，較之于游離阿霉素，碳酸鈣納米顆粒能夠明顯降低化療藥物在骨肉瘤治療中的細(xì)胞毒性，提高DOX在腫瘤部位的高釋放率和利用率，降低了化療藥物在機(jī)體帶來(lái)的毒副作用。因此，我們相信這種復(fù)合納米藥物在骨肉瘤的臨床化療中具有很高的應(yīng)用前景。