激活轉(zhuǎn)錄因子-2在非特指型彌漫大B細胞淋巴瘤中的表達及其與臨床病理特征的關系*

袁振亞， 王明華， 翁陽△

1海南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院病理科(海南?？?570100)； 2海南醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院病理科(海南?？?570100)

彌漫大B細胞淋巴瘤(DLBCL)是最常見的非霍奇金淋巴瘤(NHL)，約占所有NHL的30%～40%，是一組異質(zhì)性明顯的侵襲性淋巴瘤，臨床病情進展迅速，預后較差，發(fā)病機制尚不清楚。據(jù)報道DLBCL患者5年總體生存率僅為46%[1]。激活轉(zhuǎn)錄因子2(ATF-2)屬于ATF/CREB(cAMP response element binding protein)轉(zhuǎn)錄因子家族，是激活蛋白1(AP1)轉(zhuǎn)錄復合物不可或缺的組成成分[2]。研究表明ATF-2在惡性黑色素瘤、食管癌、肺癌、肝癌、腎癌等多種惡性腫瘤中發(fā)揮一定致癌作用[3-7]，也有報道證實ATF-2基因在DLBCL細胞株BJAB、SUDHL-4、HBL-1、OCI-LY3中高表達，當抑制ATF-2基因表達時，這些細胞株的生長受到抑制[8]。但ATF-2蛋白在非特指型彌漫大B細胞淋巴瘤(DLBCL，NOS)與淋巴結反應性增生(RH)病例中的表達情況及表達差異，以及ATF-2蛋白表達與DLBCL，NOS的臨床病理特征和預后之間的關系鮮有報道。因此本研究旨在探討ATF-2蛋白在DLBCL，NOS中的表達意義，分析其表達與患者臨床病理特征及預后之間的關系，為DLBCL，NOS的發(fā)病機制及診療策略提供理論基礎。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集海南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院病理科2013年1月至2018年6月60例DLBCL，NOS病例和40例淋巴結RH病例，從醫(yī)院數(shù)據(jù)庫中獲取患者的年齡、性別等臨床數(shù)據(jù)。60例DLBCL，NOS病例中，男33例，女27例，年齡23～88歲，平均(61±16.22)歲。40例淋巴結RH病例中，男21例，女19例，年齡5～78歲，平均(44.6±18.33)歲。所有標本均經(jīng)過4%的中性甲醛固定及石蠟包埋，組織蠟塊采用4 μm連續(xù)切片，術后病理診斷明確。

1.2 免疫組織化學染色 4 μm石蠟切片脫蠟，梯度乙醇水化，去離子水2次(1 min/次)，雙氧水5 min，流水沖洗5 min，EDTA熱修復24 min，采用MAX Vision二步法進行免疫組化檢測，DAB顯色，蘇木素復染，脫水透明，中性樹膠封片。ATF-2兔抗人單克隆抗體為美國Cell Signaling Technology公司產(chǎn)品，選用已知子宮內(nèi)膜樣腺癌陽性片作為陽性對照，PBS取代一抗作為陰性對照，稀釋比例1∶100。CyclinD1、BCL-2、CD10、BCL-6及MUM1抗體均為福州邁新生物技術開發(fā)有限公司產(chǎn)品，為即用型抗體。

1.3 免疫組織化學結果判讀 ATF-2以腫瘤細胞細胞核或細胞質(zhì)呈棕褐色染色為陽性，BCL-2、CD10以腫瘤細胞細胞膜或細胞質(zhì)呈棕褐色染色為陽性，CyclinD1、BCL-6、MUM1以腫瘤細胞細胞核呈棕褐色染色為陽性。在顯微鏡低倍(10×)視野下瀏覽整張切片，選擇目標細胞高表達區(qū)域，隨機對5個高倍(40×)視野進行判讀，根據(jù)著色程度及陽性細胞所占比例用組織學評分(∑Pi)計算積分，取平均值。其中i代表細胞染色深淺，包括0分：不顯色或顯色不清；1分：淺黃色；2分：棕黃色；3分：深褐色。P代表將陽性細胞的百分率數(shù)值進行半定量分級：<5% 為0分；5%～24%為1分；25%～49%為2分；50%～74%為3分；≥75%為4分。所得積分≤7分，記為低表達；>7分，記為高表達。

1.4 隨訪 生存時間以疾病確診之日算起至死亡日期或至末次隨訪日期，隨訪截止日期為2018年12月1日，以電話隨訪為主。到隨訪截止日期為止，60例DLBCL，NOS患者中死亡病例為14例，生存時間為1～47個月，平均生存時間為10.43個月。存活病例為26例。另外20例失訪。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，顯著性分析采用四格表Chi-Square檢驗，相關性分析采用Spearman相關分析，生存分析采用Kaplan-Meier法。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 ATF-2蛋白在DLBCL，NOS和淋巴結RH病例中的表達 免疫組化染色結果顯示：兩組病例中ATF-2蛋白均表現(xiàn)為目標細胞細胞核著色，不同病例細胞染色程度強弱不等，見圖1。ATF-2蛋白在DLBCL，NOS組織中的表達明顯高于在淋巴結RH組織中的表達，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000)，見表1。

2.2 ATF-2蛋白表達與DLBCL，NOS年齡、性別的關系 ATF-2蛋白在DLBCL，NOS不同年齡、性別分組之間表達的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2。

2.3 ATF-2蛋白表達與DLBCL，NOSHans分型的關系 ATF-2蛋白在DLBCL，NOS不同Hans分型分組之間表達的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表3～4。

2.4 ATF-2蛋白的表達與BCL-2蛋白及CyclinD1蛋白表達的關系 DLBCL，NOS組織中ATF-2蛋白表達與BCL-2蛋白表達無關(P=0.595)，見表5。60例DLBCL，NOS組織中Cyclin D1蛋白均無表達。

2.5 ATF-2蛋白表達與DLBCL，NOS患者預后關系 45例ATF-2蛋白高表達的DLBCL，NOS病例隨訪至2018年12月1日，16例失訪，21例健在，8例死亡，15例ATF-2蛋白低表達病例隨訪至2018年12月1日，4例失訪，5例健在，6例死亡。Kaplan-Meier生存分析結果顯示：ATF-2蛋白高表達的DLBCL，NOS患者與低表達的DLBCL，NOS患者總生存期的差異無統(tǒng)計學意義(P=0.194)。見表6、圖2。

注：A:ATF-2蛋白在DLBCL，NOS中高表達；B:ATF-2蛋白在淋巴結RH中高表達;C:ATF-2蛋白在DLBCL，NOS中低表達；D:ATF-2蛋白在淋巴結RH中低表達

圖1ATF-2蛋白在DLBCL，NOS組織與淋巴結RH組織中的表達(MAXvision法免疫組化，×40)

表1ATF-2蛋白在DLBCL，NOS組織與淋巴結RH組織中的表達 例

表2ATF-2蛋白的表達與DLBCL，NOS年齡、性別的關系 例(%)

表3DLBCL，NOS中CD10、BCL-6、MUM1蛋白的表達情況

表4ATF-2蛋白的表達與DLBCL，NOS Hans分型的關系例(%)

表5ATF-2蛋白表達與BCL-2蛋白表達的關系例(%)

3 討論

ATF-2又名m-XBP、CRE-BP1，位于人類染色體2q32，全長約為2.1 kb，共包含有505個氨基酸，是真核基因生物體內(nèi)獨有并且廣泛存在的細胞轉(zhuǎn)錄因子，屬于ATF/cAMP效應元件結合蛋白(CREB)家族。該家族包含有16個轉(zhuǎn)錄因子成員，其共同特征為包含有一段由5′-TGACGTCA-3′堿基序列構成的cAMP應答元件(CRE)，也都具有堿性亮氨酸拉鏈(bZIP)結構域，是bZIP蛋白家族中一個較大的群體[4-5，7，9]。

表6ATF-2蛋白表達與DLBCL，NOS患者預后關系

圖2ATF-2蛋白表達與DLBCL，NOS患者預后的關系

ATF-2具有轉(zhuǎn)錄因子、DNA損傷應答蛋白、組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(HAT)等多重活性，各種活性之間相互配合協(xié)調(diào)以調(diào)控機體正常細胞的增殖、分化及凋亡[10-11]。ATF-2基因編碼的蛋白質(zhì)在不同類型組織及細胞中的表達定位不盡相同，定位于細胞核或胞質(zhì)內(nèi)。ATF-2具有致癌和抑癌雙重功能，其中與其致癌功能緊密相關的特性為細胞核內(nèi)定位及轉(zhuǎn)錄因子活性[3，12]。其中細胞核內(nèi)定位受蛋白激酶PKCε的調(diào)控，PKCε可以直接磷酸化ATF-2的T52位點，維持ATF-2的核內(nèi)定位，使其可以發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子活性[12]。當受到各種由病原感染、精神壓力、環(huán)境應激等產(chǎn)生的炎性介質(zhì)、細胞因子以及缺氧、代謝釋放的活性氧類等的刺激時，絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)JNK/p38信號轉(zhuǎn)導通路被激活[5，13]，直接磷酸化ATF-2氨基端的Thr69和Thr71殘基[14-15]，磷酸化的ATF-2通過bZIP與其他bZIP蛋白發(fā)生異二聚化從而獲得轉(zhuǎn)錄因子活性，繼而與下游靶基因轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的特定DNA序列結合，參與轉(zhuǎn)錄啟動，實現(xiàn)對靶基因的調(diào)控[16-17]。能夠與ATF-2形成異二聚體的蛋白分子包括ATF/CREB家族成員，Jun家族成員，F(xiàn)os家族成員。其中ATF-2-c-Jun二聚體是和腫瘤發(fā)生最密切相關的二聚化形式[4]。

早期報道表明，在惡性黑色素瘤中，ATF-2定位在細胞核內(nèi)，并與c-Jun形成異二聚體，通過激活細胞周期蛋白D1基因的轉(zhuǎn)錄促進黑色素瘤細胞的增殖和侵襲，當抑制ATF-2轉(zhuǎn)錄活性時可以抑制惡性腫瘤細胞增殖[18-19]，同時增強腫瘤細胞對輻射誘導的細胞凋亡的敏感性[20]。人神經(jīng)母細胞瘤SK-N-SH細胞中，ATF-2被蛋白激酶JNK直接磷酸化，與c-Jun形成異二聚體，并與下游靶基因CyclinD1啟動子區(qū)的CRE元件結合，促進腫瘤細胞的增殖。前列腺癌細胞中，ATF-2被JNK/p38激活，作用于靶基因2OST啟動子區(qū)，調(diào)控2OST的表達，促進前列腺癌細胞的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲，加速前列腺癌進展過程。肝癌細胞內(nèi)，ATF-2呈現(xiàn)細胞核高表達，通過MAPK/ERK途徑被激活，促進肝癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移。相對于正常肺細胞和組織，非小細胞肺癌細胞和組織中，ATF-2基因表達顯著上調(diào)。通過si-RNA敲減ATF-2基因后發(fā)現(xiàn)非小細胞肺癌細胞增殖受到抑制。與ATF-2低表達患者相比，ATF-2高表達的非小細胞肺癌患者預后較差并且產(chǎn)生獲得性耐藥的概率更高[21]。在腎細胞癌組織中，ATF-2定位于細胞核中，并且ATF-2蛋白及mRNA的表達均高于相應的鄰近正常組織。當使用shRNA來抑制ATF2的表達時，RCC細胞增殖減少，CyclinB1和CyclinD1的mRNA和蛋白質(zhì)表達發(fā)生下調(diào)[22]。有報道稱DLBCL細胞系中檢測到JNK、p38和ERK的活化及c-Jun、JunB、JunD、ATF-2、ATF-3及ATF-7的表達水平升高，當單獨沉默c-Jun或ATF-2時，腫瘤細胞存活率明顯降低，表明c-Jun-ATF-2復合物是 DLBCL細胞系增殖的重要驅(qū)動因子[8]。

本研究對60例DLBCL，NOS病例及40例淋巴結RH病例進行了ATF-2蛋白的免疫組織化學檢測，結果顯示兩組病例ATF-2蛋白均定位于細胞核中，ATF-2蛋白在DLBCL，NOS中的表達明顯高于淋巴結RH中的表達。這一結果提示ATF-2可能在DLBCL，NOS的發(fā)生、發(fā)展中起到一定促進作用，并且與其細胞核定位相關。該結果與ATF-2蛋白在其他惡性腫瘤組織中的表達結果一致。

ATF-2包含有一段由5′-TGACGTCA-3′堿基序列構成的CRE元件，所以任何在驅(qū)動區(qū)帶有CRE結合位點的基因都是其潛在的靶基因[23-24]。ATF-2調(diào)控的與腫瘤發(fā)生相關的靶基因有CyclinD1和CyclinA、2OST、血小板源性生長因子受體a、選擇素E、BCL-2、EMT、Snail、和Vimentin等。ATF-2與Cyclin D1啟動子區(qū)的CRE元件結合，直接激活Cyclin D1表達，Cyclin D1通過結合并激活細胞周期蛋白依賴性激酶CDK4，推動細胞周期由G1期進入到S期，促進細胞增殖，當其過度表達時可致細胞增殖失控而惡變。本研究60例DLBCL，NOS組織中，免疫組化檢測結果顯示Cyclin D1蛋白均無表達?？赡艿脑蛉缦拢?1)在B細胞性非霍奇金淋巴瘤中，由于t(11；13)(q13；q32)染色體易位導致的IgH/BCL1基因融合和CyclinD1蛋白過表達是套細胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma，MCL)特征性的細胞遺傳學改變。因此，大多數(shù)Cyclin D1蛋白過表達的B細胞非霍奇金淋巴瘤病例都診斷為MCL，而非DLBCL，NOS；(2)在DLBCL，NOS中，ATF-2可能不是調(diào)控CyclinD1基因表達的上游基因。BCL-2是最有效的抑制細胞凋亡基因之一，通過調(diào)控線粒體外膜通透性發(fā)揮作用，其啟動子區(qū)含有一個可結合ATF-2的CRE元件。有研究表明在DLBCL，NOS中發(fā)現(xiàn)BCL-2的過表達。本研究60例DLBCL，NOS病例中，ATF-2蛋白和BCL-2蛋白免疫組化檢測結果顯示兩者的表達無相關性，究其原因，可能如下：(1)本組病例樣本量少，ATF-2和BCL-2蛋白在DLBCL，NOS中的關系尚需要大樣本進行探討；(2)與其他惡性腫瘤不同，在DLBCL，NOS病例中，ATF-2可能不是通過調(diào)控BCL-2基因的表達而促進腫瘤細胞增殖。(3)在DLBCL，NOS病例中，BCL-2基因的表達除受ATF-2調(diào)控外，可能還受其它基因調(diào)控。

本組60例DLBCL，NOS病例的隨訪結果與ATF-2蛋白表達的統(tǒng)計學分析結果提示：ATF-2蛋白高表達的DLBCL，NOS患者與低表達的DLBCL，NOS患者總生存期的差異無統(tǒng)計學意義。對該結論的分析如下：本組病例樣本量較少，隨訪時間較短，部分近期確診患者處于存活期，部分病例失訪，導致事件數(shù)據(jù)過少。因此ATF-2的表達與DLBCL，NOS患者生存預后的關系仍需大樣本及長時間隨訪進一步研究。

綜上所述，ATF-2在DLBCL，NOS中定位于細胞核，并有可能在DLBCL，NOS的發(fā)生發(fā)展中起到一定促進作用，但ATF-2具體通過調(diào)控哪些下游靶基因而促進DLBCL，NOS的發(fā)生、發(fā)展以及與患者預后的關系還需進一步研究。鑒于ATF-2在腫瘤中發(fā)揮致癌作用主要與其核內(nèi)轉(zhuǎn)錄功能相關，抑制ATF-2的核內(nèi)定位及轉(zhuǎn)錄因子活性可能將為今后DLBCL，NOS治療提供一個新的參考方案。