HBsAg致敏自體樹突狀細(xì)胞治療乙肝病毒相關(guān)性慢加急性肝衰竭患者的臨床效果*

朱其榮， 喻雪琴， 陳芳， 戢敏， 陳星， 梅怡晗， 梅小平△

1川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院感染科(四川南充 637000)； 2首都醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)系(北京 610041)

乙型肝炎(乙肝)病毒(HBV)相關(guān)性慢加急性肝衰竭(acute-on-chronic liver failure，ACLF)患者病情重，病死率達(dá)62.2%～72.3%[1]，其發(fā)病機(jī)制不明確，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為免疫失衡可能是其主要發(fā)病機(jī)制。樹突狀細(xì)胞(dendritic cell,DC)是免疫應(yīng)答啟動(dòng)的關(guān)鍵細(xì)胞，起源于骨髓, 1973年美國學(xué)Steinman和Cohn首次發(fā)現(xiàn),是當(dāng)前功能最強(qiáng)的專職抗原提呈細(xì)胞,能使原始T淋巴細(xì)胞激活的唯一的抗原提呈細(xì)胞,其功能狀態(tài)直接影響免疫應(yīng)答與抗病毒作用[2]，它的成熟、功能狀態(tài)是導(dǎo)致HBV持續(xù)感染的主要原因。ACLF患者免疫失衡的主因之一是其外周血DC數(shù)量下降，功能缺陷，無法有效提呈HBV抗原肽，不能誘導(dǎo)ACLF患者有效的特異免疫效應(yīng)，DC的抗原提呈功能處于靜息狀態(tài)及γ干擾素(IFN-γ)、白細(xì)胞介素-4(IL-4)等細(xì)胞因子釋放紊亂，誘發(fā)ACLF患者Treg/Th17、Th1/Th2等型細(xì)胞因子水平失調(diào)。觀察血清IFN-γ、IL-4等細(xì)胞因子變化來了解DC在ACLF中的作用具有一定指標(biāo)意義。DC主要有2種亞群：髓樣 DCs (myeloid DCs，mDCs)是最重要的抗原提呈細(xì)胞，通過Toll樣受體來產(chǎn)生IL-4等；漿系 DCs(plasmacytoid DCs，pDCs)通過TLR7和TLR來產(chǎn)生干擾素(IFN)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等，從而激活免疫反應(yīng)形成抗病毒免疫屏障[3], 而在ACLF患者體內(nèi)DC數(shù)量及功能下調(diào)，HBV抗原信息不能提呈給T淋巴細(xì)胞和HBV特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)答障礙，誘導(dǎo)ACLF的發(fā)生。在體外通過HBsAg致敏自體樹突狀細(xì)胞(抗HBV-DCs)治療對ACLF可能發(fā)揮一定效果。恩替卡韋(ETV)是目前常用的抗HBV感染藥物，具有直接抑制HBV作用。目前抗HBV治療是治療ACLF的手段之一，但調(diào)節(jié)機(jī)體免疫失衡,突破機(jī)體免疫耐受是有利于對病毒的清除和糾正免疫失衡。有研究結(jié)果顯示，DC疫苗可通過調(diào)節(jié)機(jī)體免疫失衡而抑制甚至清除病毒。為此筆者特將2015年7月至2018年6月ETV聯(lián)合特異性樹突細(xì)胞疫苗治療HBV相關(guān)ACLF患者外周血 DCs亞群頻率分布及TNF-α、IFN-γ、IL-4水平變化結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2015年7月至2018年6月住院治療的64例HBV相關(guān)ACLF患者為研究對象，其中男50例，女14例，年齡17～61歲，平均(29.8±17.6)歲。研究對象的64例ACLF患者外周血清HBsAg及HBV DNA均陽性。ACLF患者診斷符合《肝衰竭診治指南(2012年版)》[4]中診斷標(biāo)準(zhǔn)。ACLF患者隨機(jī)分為兩組，抗HBV-DCs聯(lián)合ETV治療組(聯(lián)合治療組)32例，其中男25例，女7例，給予ETV(江蘇正大天晴藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品)0.5 mg口服，1次/d，同時(shí)給予HBV-DCs懸液從外周靜脈回輸?shù)紸CLF患者體內(nèi)，觀察6個(gè)月，在治療的前3個(gè)月，每半個(gè)月輸入HBV-DCs懸液1次；治療后 3個(gè)月每月輸入HBV-DCs懸液1次。ETV單獨(dú)治療組(單獨(dú)治療組)32例，其中男26例，女6例，僅給予ETV 0.5 mg口服，1次/d。聯(lián)合治療組與單獨(dú)治療組同時(shí)接受綜合保肝治療措施。選取同期HBsAg陰性的年齡、性別與研究對象相匹配的健康志愿者20例為對照組，其中男15例，女5例，年齡(28.4±16.5)歲。3組之間年齡、性別差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡>18歲且<65歲；(2)HBV相關(guān)ACLF患者診斷符合《肝衰竭診治指南(2012年版)》診斷標(biāo)準(zhǔn)；(3)近6個(gè)月內(nèi)未用免疫調(diào)節(jié)藥，未接受過抗HBV治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他嗜肝病毒感染以及其他原因所致的ACLF患者；(2)合并腫瘤、自身免疫性疾病、糖尿病、高血壓、心臟?。?3)妊娠及哺乳期婦女。

1.3 研究方法

1.3.1 標(biāo)本的采集 聯(lián)合治療組與單獨(dú)治療組在研究前及研究開始3、6個(gè)月時(shí)分別檢測肝功能、乙肝兩對半、HBV DNA，同時(shí)抽取外周靜脈血15 mL，加入10 U/mL肝素抗凝，其中10 mL應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測DC數(shù)量及頻率、T淋巴細(xì)胞亞群，5 mL應(yīng)用雙抗體夾心ABC-ELISA法檢測TNF-α、IFN-γ、IL-4水平。健康志愿者同上述過程。

1.3.2 DC分離及培養(yǎng) 外周靜脈血采集后2 h內(nèi)制備單個(gè)核細(xì)胞。按1∶1比例PBS緩沖液混勻稀釋靜脈血，將混勻外周靜脈血沿管壁緩慢加入已有淋巴細(xì)胞分離液的離心管中(靜脈血與分離液的比例為2∶1)，使兩者有明顯的分界，室溫2 000 r/min離心30 min，離心后用毛細(xì)吸管輕輕吸取血漿與淋巴細(xì)胞分離液之間的灰白色云霧層，轉(zhuǎn)入一干凈離心管中，加入5倍體積的PBS緩沖液，2 000 r/min離心10 min，棄上清液，1 500 r/min離心10 min，棄上清液。用不含血清的RPMI 1640培養(yǎng)基懸浮沉淀細(xì)胞，吸管吹打混勻，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106·mL-1，按每孔2 mL加入6孔板中，置于37℃、5%CO2孵箱中孵育，2 h后棄上清液，用預(yù)熱的RPMI 1640輕輕洗去懸浮細(xì)胞，往貼壁細(xì)胞中加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基2 mL/孔，按含rhGM-CSF 100 ng/mL、rhIL-4 100 ng/mL終濃度加入細(xì)胞因子，置37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，隔日半量換液1次(含細(xì)胞因子rhGM-CSF 50 ng/mL、rhIL-4 50 ng/mL),第5天加入TNF-α(100 ng/mL),第7天收集懸浮細(xì)胞并計(jì)數(shù)。

1.3.3 DC的數(shù)量及頻率檢測 采用直接熒光抗體標(biāo)記收集DC，流式細(xì)胞儀檢測外周血DC頻率及數(shù)量、髓樣及漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞數(shù)量與頻率。

1.3.4 TNF-α、IFN-γ、IL-4的含量檢測 取5 mL抗凝血，2 500 r/min離心20 min，取上清液放于無菌的EP管內(nèi)，將分離的血清標(biāo)本置于-80℃冰箱保存待檢。采用雙抗體夾心ABC-ELISA法檢測，操作方法按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。

1.3.5 抗HBV-DCs 制備與治療 用低分子肝素抗凝管取ACLF患者靜脈血20 mL，采取密度梯度離心法獲取PBMC。在37℃、5% CO2條件下以PRMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)孵育，加入GM-CSF和IL-4等誘導(dǎo)PBMC分化為非成熟的DC。在培養(yǎng)孵育第6天加入HBsAg蛋白短期刺激使DC負(fù)載HBV的HBsAg，加入TNF-α、IL-4、CD40L和PGE2混合因子誘導(dǎo)DC成熟。在培養(yǎng)第7天獲取體外抗HBV-DCs,數(shù)量為(1～10)×106，用20～40 mL生理鹽水混懸待用。治療的前3個(gè)月，每半月輸HBV-DCs懸液1次；治療3月后每月輸入HBV-DCs懸液1次。

1.3.6 T 淋巴細(xì)胞表面標(biāo)志物檢測 采用美國BD公司流式細(xì)胞儀及相關(guān)抗體進(jìn)行檢測外周血CD3+T淋巴細(xì)胞、CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T亞群百分比及CD4+T/CD8+T比值。

1.3.7 主要儀器、試劑與檢測方法 CO2培養(yǎng)箱(Thermo Forma，美國)，F(xiàn)ACScalibur流式細(xì)胞儀(美國BD公司)，采用貝克曼全自動(dòng)生化分析儀檢測肝功能；高速臺式離心機(jī)(CR4I,Thermo)；振蕩儀(蘇州太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠)。

血清HBV標(biāo)志物選取Roche公司試劑盒運(yùn)用電化學(xué)發(fā)光法檢測；血清HBV DNA水平選取廣州達(dá)安基因診斷試劑公司試劑盒運(yùn)用PCR法檢測；TNF-α、IFN-γ、IL-4檢測試劑盒(美國BioSource公司), rhGM-CSF、rhIL-4、鼠抗人CD40, CD83, 1640培養(yǎng)液來源于河北博海生物工程公司, HBsAg來源于中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒所。

2 結(jié)果

2.1 外周血DC數(shù)量及頻率比較 聯(lián)合治療組與單獨(dú)治療組患者治療前DC數(shù)量及頻率較對照組水平低(P<0.05)，兩治療組之間治療前DC數(shù)量及頻率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，兩治療組治療后外周血DC數(shù)量及頻率較治療前顯著上調(diào)(P<0.05)，聯(lián)合治療組較單獨(dú)治療組上調(diào)更明顯(P<0.05)，結(jié)果見表1。

2.2 外周血TNF-α、IFN-γ、IL-4水平比較 兩治療組治療前TNF-α、IFN-γ水平較對照組高，IL-4水平較對照組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，兩治療組治療前TNF-α、IFN-γ、IL-4水平間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，治療后聯(lián)合治療組TNF-α、IFN-γ水平下調(diào)較單獨(dú)治療組明顯，聯(lián)合治療組IL-4水平上調(diào)水平較單獨(dú)治療組顯著(P<0.05)，兩治療組治療后TNF-α、IFN-γ水平下降明顯，IL-4水平逐漸升高，治療24周后復(fù)常，較治療前比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，結(jié)果見表2。

項(xiàng)目對照組(n=20)聯(lián)合治療組(n=32)單獨(dú)治療組(n=32)治療前治療24周治療前治療24周髓樣DC數(shù)量(×106·L-1)15.70±1.577.36±1.25?13.69±1.17△7.37±1.19?10.63±1.17△▲髓樣DC頻率(%)0.61±0.060.32±0.03?0.59±0.04△0.32±0.02?0.41±0.02△▲漿細(xì)胞樣DC數(shù)量(×106·L-1)7.23±0.972.98±0.87?7.18±0.81△2.90±0.79?5.03±0.61△▲漿細(xì)胞樣DC頻率(%)0.31±0.050.14±0.02?0.35±0.03△0.14±0.01?0.26±0.02△▲

注：*與對照組比較P<0.05；△與本組治療前比較P<0.05；▲與聯(lián)合治療組治療24周比較P<0.05

時(shí)間對照組單獨(dú)治療組TNF-αIFN-γIL-4TNF-αIFN-γIL-4治療前87.23±4.3653.66±4.2333.29±2.69138.97±2.53?82.01±2.27?19.99±1.19?治療4周117.44±2.39△99.01±2.30△17.69±1.28△治療12周101.36±2.34△74.36±1.57△32.38±1.12△治療24周92.12±1.34△61.36±1.56△32.21±1.12△時(shí)間聯(lián)合治療組TNF-αIFN-γIL-4治療前137.01±2.42?81.85±1.38?19.77±1.27?治療4周93.49±2.18△▲90.74±1.37△▲25.69±1.17△▲治療12周86.99±2.69△▲64.01±2.02△▲ 28.24±1.01△▲治療24周81.36±1.13△▲51.31±1.57△▲35.89±1.24△▲

注：*與對照組比較P<0.05；△與本組治療前比較P<0.05；▲與單獨(dú)治療組比較P<0.05

2.3 外周血T淋巴細(xì)胞亞群水平影響分析 對照組外周血CD3+T、CD4+T水平高于治療前治療組水平，CD8+T低于治療組水平(P<0.05)，治療前治療組間CD3+T、CD4+T、CD8+T水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，治療后CD3+T、CD4+T水平較治療前上調(diào)明顯，CD8+T水平下調(diào)顯著(P<0.05)，治療后聯(lián)合治療組CD3+T、CD4+T水平較單獨(dú)治療組上調(diào)明顯(P<0.05)，結(jié)果見表3。

2.4 外周血DC數(shù)量與T淋巴細(xì)胞亞群水平的相關(guān)性 ACLF患者治療前外周血樹突狀細(xì)胞數(shù)量與CD3+T、CD4+T水平呈正相關(guān)(P<0.05)，與CD8+T水平呈負(fù)相關(guān)(P>0.05)，結(jié)果見表4。

項(xiàng)目對照組聯(lián)合治療組治療前單獨(dú)治療組治療前聯(lián)合治療組治療24周后單獨(dú)治療組治療24周后CD3+T69.92±2.2665.17±2.15?64.28±2.27?71.65±2.33 △65.12±2.13 ▲CD4+T46.88±2.9830.69±1.65?31.02±1.85?48.39±2.41△33.05±2.22▲CD8+T30.12±2.2339.65±2.15?40.05±1.74?29.97±1.15△30.25±1.28△

注：*與對照組比較P<0.05；△與本組治療前比較P<0.05；▲與聯(lián)合治療組治療24周后比較P<0.05

表4 外周血DC數(shù)量與T淋巴細(xì)胞亞群水平的相關(guān)性

3 討論

DC能激活細(xì)胞免疫,利用DC制備HBV核心疫苗治療HBV相關(guān)性肝病已成為當(dāng)前研究HBV相關(guān)性肝病的熱點(diǎn)之一。通常使用病毒抗原肽或蛋白直接沖擊DC來致敏DC[5],再回輸或免疫接種到相應(yīng)病毒宿主，致敏后的DC治療能誘導(dǎo)出病毒抗原特異性CTL，打破免疫耐受、促進(jìn)免疫應(yīng)答。研究發(fā)現(xiàn)，HBV相關(guān)性肝病患者DC存在發(fā)育與功能異常，導(dǎo)致CD4+T細(xì)胞不能接受抗原提呈，導(dǎo)致細(xì)胞免疫能力紊亂與失常。在體外特異性抗原激活DC后，能活化CTL而殺傷HBV感染的靶細(xì)胞。主要調(diào)節(jié)以TNF-α、IFN-γ、IL-4 等Th1/Th2型細(xì)胞因子的失衡，誘發(fā)急性自限性感染和HBV清除，IL-4等為Th2型細(xì)胞因子，誘導(dǎo)HBV持續(xù)感染，導(dǎo)致HBV清除障礙，HBV感染致Th1/Th2細(xì)胞及其細(xì)胞因子失衡與細(xì)胞免疫功能低下。通過給予抗HBV-DCs治療可能提高Th1型細(xì)胞因子水平，增強(qiáng)或恢復(fù)機(jī)體抗HBV免疫力，有利于對HBV的清除[6]。研究顯示，自體DC疫苗治療HBeAg陽性慢性乙型病毒性肝炎患者在肝功能改善、HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換率、HBV DNA陰轉(zhuǎn)方面均取得了較好的療效[7]。

本研究結(jié)果顯示，治療組治療前DC數(shù)量及頻率較對照組水平低(P<0.05)，兩治療組治療前DC數(shù)量及頻率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，治療組治療后外周血DC數(shù)量及頻率較治療前顯著上調(diào)(P<0.05)，治療后外周血DC數(shù)量及頻率聯(lián)合治療組較單獨(dú)治療組上調(diào)明顯(P<0.05)。研究結(jié)果顯示，ACLF患者DC的數(shù)量及頻率低于對照組。ACLF患者DC量下調(diào)明顯，表明ACLF患者DC發(fā)育、功能和成熟障礙。本研究顯示，抗HBV-DCs能明顯提高DC的數(shù)量與功能，促進(jìn)DC的成熟，ETV聯(lián)合抗HBV-DCs治療ACLF患者不僅能抑制HBV復(fù)制，也能糾正機(jī)體免疫失衡，打破機(jī)體免疫耐受，活化T細(xì)胞。筆者探討ETV聯(lián)合抗HBV-DCs治療過程中ACLF患者免疫細(xì)胞數(shù)量與功能所發(fā)生的變化，表明聯(lián)合治療可對抑制HBV復(fù)制有一定協(xié)同作用，在一定程度上改善ACLF患者免疫功能，提高患者生成率，這與孫春偉等[8]報(bào)道基本一致。

有研究應(yīng)用自體回輸樹突狀細(xì)胞-細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞聯(lián)合ETV治療慢性乙肝時(shí)，能有效降低IFN-γ水平，改善機(jī)體免疫功能[9]。本研究應(yīng)用HBsAg致敏自體DC治療ACLF患者，研究發(fā)現(xiàn)兩治療組治療前TNF-α、IFN-γ水平較對照組高，IL-4水平較對照組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，兩治療組治療前TNF-α、IFN-γ、IL-4水平間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，治療后聯(lián)合治療組TNF-α、IFN-γ水平下調(diào)較單獨(dú)治療組明顯，聯(lián)合治療組IL-4水平上調(diào)水平較單獨(dú)治療組顯著(P<0.05)，兩治療組治療后TNF-α、IFN-γ水平下降明顯，IL-4水平逐漸升高，治療24周后復(fù)常，較治療前比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。ACLF是宿主免疫系統(tǒng)對HBV復(fù)制調(diào)控、抗原免疫應(yīng)答及所致炎癥活動(dòng)的結(jié)果, ETV聯(lián)合抗HBV-DCs治療可對HBV復(fù)制和免疫調(diào)節(jié)發(fā)生作用,兩者聯(lián)合治療對DC成熟與相應(yīng)細(xì)胞因子水平失衡的糾正具有一定協(xié)同與調(diào)控作用,可彌補(bǔ)ETV不能直接清除HBV的缺點(diǎn),從而起到病原學(xué)治療作用。研究發(fā)現(xiàn)聯(lián)合組TNF-α、IFN-γ水平在治療4周水平下降，在病情好轉(zhuǎn)后水平與對照組水平一致，而IL-4水平在治療4周后隨病情好轉(zhuǎn)逐漸升高，病情好轉(zhuǎn)后和對照組一致，顯示抗HBV-DCs治療能明顯調(diào)節(jié)Th1/Th2型細(xì)胞因子水平，從而達(dá)到調(diào)控肝組織炎癥的發(fā)生與病毒清除的作用。本研究提示, 抗HBV-DCs聯(lián)合ETV抗病毒治療可能突破ACLF的CTL低應(yīng)答狀態(tài), 抗HBV-DCs治療有利于機(jī)體抗HBV免疫的恢復(fù)或增強(qiáng)，為清除病毒創(chuàng)造條件。筆者認(rèn)為，通過體外用HBsAg對 DC致敏并回輸體內(nèi)的治療，能夠直接或間接抑制HBV復(fù)制,降低促炎因子TNF-α、IFN-γ表達(dá)水平，減輕肝組織炎癥與損傷程度，顯示抗HBV-DCs治療對促炎性因子的明顯抑制作用。表明體外運(yùn)用一定的技術(shù)激活DC后可提高抗原的提呈功能并促進(jìn)其成熟和功能復(fù)常, 回輸體內(nèi)后能誘導(dǎo)出抗原特異性的CTL并突破機(jī)體的免疫耐受狀態(tài)，誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)對HBV感染后靶細(xì)胞的殺傷,起到清除HBV的作用。

本研究結(jié)果表明，對照組外周血CD3+T、CD4+T水平高于治療前治療組水平，CD8+T低于治療組水平(P<0.05)，治療前治療組間CD3+T、CD4+T、CD8+T水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，治療后CD3+T、CD4+T水平較治療前上調(diào)明顯，CD8+T水平下調(diào)顯著(P<0.05)，治療后聯(lián)合治療組CD3+T、CD4+T水平較單獨(dú)治療組上調(diào)明顯(P<0.05)，同時(shí)ACLF患者治療前外周血DC數(shù)量與CD3+T、CD4+T水平呈正相關(guān)(P<0.05)，與CD8+T水平呈負(fù)相關(guān)(P>0.05)，提示抗HBV-DCs治療能明顯提高T淋巴細(xì)胞的數(shù)量與功能，調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫失衡狀態(tài)，抑制ACLF的炎癥發(fā)生，促進(jìn)HBV的清除，這與徐公民[10]報(bào)道一致。

本研究探討了ETV聯(lián)合抗HBV-DCs治療ACLF患者機(jī)體T細(xì)胞數(shù)量及功能變化，顯示特異性DC疫苗可間接抑制HBV-DNA復(fù)制，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫失衡，HBV-DC疫苗可增強(qiáng)抗原遞呈細(xì)胞的抗原遞呈功能,又可以促進(jìn)DC-T細(xì)胞間的協(xié)同作用。但DC疫苗免疫途徑、免疫間隔周期和頻次等都可能影響DC疫苗效果，抗HBV-DCs在臨床應(yīng)用中還存在一些障礙，如DC來源、抗原負(fù)載路經(jīng)、DC在體外培養(yǎng)周期、如何判斷DC的成熟與否、免疫治療周期、劑量及途徑等，都可能影響抗HBV-DCs治療效果。盡管DC疫苗還存在一些問題，療效有待進(jìn)一步提高，但DC疫苗可能是ACLF等HBV相關(guān)性肝病生物治療的一種新途徑。

本研究的不足之處在于樣本量較小，觀察時(shí)間短，未對早期、中期、晚期不同時(shí)期ACLF患者的治療效果加以比較。下一步我們將擴(kuò)大樣本量，延長觀察時(shí)間，觀察抗HBV-DCs治療不同病情程度的ACLF患者的療效。