Cajal間質(zhì)細(xì)胞在出口梗阻性便秘直腸肌壁中的表達(dá)相關(guān)研究＊

王李瑤，孫 龍，毛加榮，霍黎生

陜西省中醫(yī)醫(yī)院（西安710003）

近年來隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們工作方式，飲食結(jié)構(gòu)的變化，功能性便秘（Functional constipation，F(xiàn)C）的發(fā)病率越來越高，F(xiàn)C是指由非器質(zhì)性原因引起的無法排便或排便困難相關(guān)的腹部病癥，并通過排糞造影，結(jié)腸鏡，腸道鋇劑灌腸或甲狀腺功能檢測(cè)等相關(guān)影像學(xué)或?qū)嶒?yàn)室檢查，排除其他原因造成的繼發(fā)出現(xiàn)的便秘癥侯群［1］。結(jié)合肛門直腸動(dòng)力和感覺功能的特點(diǎn)將FC大致分為以下三類［2］：①慢傳輸型便秘（Slow transit constipation，STC），②出口梗阻型便秘（Outlet obstructive constipation，OOC），③ 混 合 型 便 秘（Mixed constipation，MC ）。其中，出口梗阻型便秘（OOC）是指盆底組織、器官的結(jié)構(gòu)、功能發(fā)生改變，導(dǎo)致排便困難或羈留性便秘綜合征，慢性便秘一種，發(fā)病率高，女性高于男性［3］。直腸前突、直腸黏膜脫垂、直腸內(nèi)套疊是主要病因［4］。

直腸黏膜脫垂又稱直腸內(nèi)套疊，是指直腸黏膜與肌層間結(jié)締組織過于松弛，黏膜層下移，是引起出口梗阻型便秘的原因之一，為直腸本身的一種退行性改變［5］。我們的研究將集中于以直腸黏膜脫垂為主要病因的OOC病例。Cajal間質(zhì)細(xì)胞（Interstitial cells of Cajal，ICCs）是西班牙神經(jīng)解剖學(xué)家 Cajal于1893年觀察到的一種非神經(jīng)但又與神經(jīng)密切相關(guān)的特殊細(xì)胞，是胃腸道慢波的起搏細(xì)胞（Pacemaker cells），并參與慢波的傳播，對(duì)腸神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)信息傳遞具有重要的調(diào)控作用［6］。在光鏡下，ICCs呈紡錘狀或星狀，核大，幾乎所有的ICCs都表達(dá)CD117，通過免疫組織化學(xué)技術(shù)對(duì)CD117進(jìn)行標(biāo)記，可在光鏡水平觀察ICCs形態(tài)和分布特點(diǎn)［7］。Hagger等發(fā)現(xiàn)巨結(jié)腸標(biāo)本縱行肌，環(huán)形肌，平滑肌間ICCs密度明顯下降［8］，Adachi［9］等對(duì)4列乙狀結(jié)腸巨結(jié)腸患者腸標(biāo)本進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)神經(jīng)肌肉結(jié)構(gòu)未見明顯組織學(xué)改變，但是表達(dá)CD117的ICCs是減少的，因此指出：CD117陽性ICCs表達(dá)下調(diào)可能是導(dǎo)致巨結(jié)腸的重要因素。關(guān)于ICCs在OOC方面的研究報(bào)道極少，而ICCs在OOC病患病灶處的結(jié)構(gòu)形態(tài)分布特點(diǎn)還未見報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)利用通過免疫組織化學(xué)染色標(biāo)記CD117，觀察以直腸黏膜脫垂為主要病因的梗阻性便秘（OOC）患者相對(duì)于混合痔患者直腸肌壁的黏膜層、黏膜下層和肌層中Cajal間質(zhì)細(xì)胞的異常變化，從而推斷腸神經(jīng)系統(tǒng)在OOC中的調(diào)控作用。

材料與儀器

1 主要試劑 一抗：CD117免疫組化試劑 （中杉金橋），通用型二抗（安必平），DAB顯色試劑盒（邁新生物），0.1mol／L檸檬酸鹽緩沖液（邁新生物），100%、95%、80%乙醇（天津瑞金），二甲苯（天津瑞金），蘇木素染液（貝索），中性樹膠（上海懿洋）。

2 儀器與設(shè)備 電子顯微鏡（奧林巴斯公司），圖像采集系統(tǒng)（奧林巴斯公司），超聲波清洗器KQ3200DA（昆山蘇美），F(xiàn)A1004A分析天平（上海精天電子儀器有限公司），電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司），RM2235型石蠟切片機(jī)（德國Leica公司），－20～4℃低溫冰箱（Hair公司），18cm不銹鋼高壓鍋（沈陽壓力國廠），數(shù)字顯示移液器（芬蘭GILSON公司），黏附載玻片（福州邁新）。

3 標(biāo)本的獲取 依據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)符合條件的患者查隨機(jī)數(shù)字表法選取72例，產(chǎn)生隨機(jī)序列。信封法對(duì)納入的患者查隨機(jī)數(shù)字表法分為OOC組（36例）、對(duì)照組（36例）。采取手術(shù)方式為改良TST切除術(shù)，切取OOC組及對(duì)照組患者經(jīng)排糞造影證實(shí)有直腸黏膜脫垂段直腸腸壁，術(shù)中腸管標(biāo)本取下后切取全層肌壁組織。

4 標(biāo)本處理 標(biāo)本取下后經(jīng)PBS緩沖液沖洗后置于4%多聚甲醛中固定24h后經(jīng)修整取材，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，浸蠟，包埋后制成石蠟標(biāo)本，應(yīng)用輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)切片，溫水漂浮法撈片，烤干備用。

5 蘇木素及伊紅染色 將切片依次放入二甲笨透明及梯度乙醇溶液中進(jìn)行醇化后入蘇木素染液中10min，伊紅染液3min后脫水、透明與封片。

6 免疫組化染色 將切片依次放入二甲笨透明及梯度乙醇溶液中進(jìn)行醇化后高壓蒸汽修復(fù)10min，3%甲醇雙氧水阻斷后滴加一抗（CD117）及二抗，然后經(jīng)DAB顯色，蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水等步驟最后透明封片。

7 顯微鏡下觀察計(jì)數(shù) 應(yīng)用光學(xué)顯微鏡觀察，以結(jié)構(gòu)清晰，著色明顯高于背景，在相應(yīng)部位胞膜和胞漿著色，出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒的細(xì)胞為陽性，無著色或著色強(qiáng)度與背景無差異為陰性，同一切片中隨機(jī)取10個(gè)高倍鏡視野（10×40倍）并計(jì)數(shù)黏膜固有層、黏膜下層及肌層中不同部位中CD117陽性細(xì)胞數(shù)量并觀察細(xì)胞的形態(tài)改變。然后在電腦中使用IPP6.0軟件進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)及灰度值分析。

8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 選用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以（±s）表示，檢驗(yàn)方法為兩樣本獨(dú)立t檢驗(yàn)，P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

顯微鏡下觀察到，與對(duì)照組相比較，OOC組患者直腸腸壁中肌層和黏膜下層中的CD117陽性表達(dá)細(xì)胞是明顯減少。正常Cajal間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)應(yīng)為紡錘狀或星狀，而本研究OOC組中，細(xì)胞染色較正常變?nèi)?，形態(tài)變圓鈍，形成的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)變少，而在黏膜固有層中的CD117陽性的表達(dá)的細(xì)胞幾乎不變甚至是增加的，細(xì)胞形態(tài)也沒有明顯變化（圖1）。人工計(jì)數(shù)和免疫組化分析軟件觀察CD117在患者黏膜層和黏膜下層中的表達(dá)的定量結(jié)果，見表1、2。

表1 CD117陽性細(xì)胞在OOC患者直腸腸壁中不同區(qū)域的計(jì)數(shù)比較（±s，個(gè)）

表1 CD117陽性細(xì)胞在OOC患者直腸腸壁中不同區(qū)域的計(jì)數(shù)比較（±s，個(gè)）

注：與正常對(duì)照組比較，△P＜0.05

分 組 黏膜固有層 黏膜下層 肌層OOC組 16.02±0.61 28.78±0.62△ 10.44±0.66△對(duì)照組 7.55±0.69 40.96±0.63 15.24±0.68

表2 CD117陽性細(xì)胞在OOC患者直腸腸壁中不同區(qū)域的IOD值差異比較（±s，個(gè)）

表2 CD117陽性細(xì)胞在OOC患者直腸腸壁中不同區(qū)域的IOD值差異比較（±s，個(gè)）

注：與正常對(duì)照組比較，△P＜0.05

分 組 黏膜固有層 黏膜下層 肌層OOC組 32.02±0.53 8.78±0.63△ 5.25±0.87△對(duì)照組 27.55±0.89 17.96±0.78 12.44±0.56

圖1 CD117陽性細(xì)胞在OOC患者直腸腸壁中不同區(qū)域的表達(dá)差異

討 論

目前，關(guān)于OOC的相關(guān)發(fā)病機(jī)制還都探索中，其中之一就是關(guān)于肛門直腸動(dòng)力改變及感覺功能障礙等學(xué)說［10］，某些神經(jīng)性疾病可引起相應(yīng)神經(jīng)支配肌肉的不協(xié)調(diào)性收縮。正常排便過程依賴于高度協(xié)調(diào)的感受和運(yùn)動(dòng)機(jī)制，其涉及自主神經(jīng)系統(tǒng)，腸神經(jīng)系統(tǒng)和依賴軀體神經(jīng)的相互作用與盆底肌肉活動(dòng)的順序變化，該途徑的任何部分的損害都將導(dǎo)致某種形式的便秘［11］。隨著神經(jīng)腸胃病學(xué)的發(fā)展，將在神經(jīng)、細(xì)胞和分支層次進(jìn)一步闡明控制腸道功能之間的相互關(guān)系［12］。例如Bassotti等研究發(fā)現(xiàn)，OCC患者黏膜下神經(jīng)叢中的神經(jīng)元明顯減少，在肌間神經(jīng)叢中數(shù)量正常，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞在兩種神經(jīng)叢中都減少［13］。又如崔華勤等通過對(duì)885例病人檢測(cè)的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，53例恥骨肌肥厚癥的病人，48例肌電圖表現(xiàn)明顯異常，31例盆底痙攣綜合征病人中，29例表現(xiàn)明顯異常［14］。通過以上研究我們初步推斷，OOC的病因與直腸肌壁的神經(jīng)電生理改變密切相關(guān)，而引起這種動(dòng)力異常的深部原因尚不明確，ICCs以網(wǎng)絡(luò)狀分布在胃腸道，分為黏膜下ICC、肌間ICC、肌內(nèi)ICC、深層肌叢ICC這四種，結(jié)腸肌間神經(jīng)叢周圍的ICCs數(shù)目高于環(huán)、叢肌層。ICCs是胃腸道慢波的發(fā)起者，它可以產(chǎn)生慢波并通過網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)及平滑肌之間的連接將慢波傳出，從而引起胃腸道的平滑肌的收縮，ICCs細(xì)胞膜上存在多種神經(jīng)遞質(zhì)受體，可作為神經(jīng)沖動(dòng)傳出與平滑肌之間的中介。結(jié)腸的ICCs具有控制結(jié)腸運(yùn)動(dòng)自主節(jié)律性的功能，ICC減少，特別是CC－SM和SS－SM的明顯減少，影響腸慢波的產(chǎn)生和傳播，擾亂腸道神經(jīng)系統(tǒng)與平滑肌間的信息傳遞，導(dǎo)致結(jié)腸運(yùn)動(dòng)功能紊亂，通過時(shí)間延長，出現(xiàn)臨床癥狀［15］。

我們實(shí)驗(yàn)組嘗試從腸神經(jīng)系統(tǒng)的變化中尋找原因。Cajal間質(zhì)細(xì)胞是腸神經(jīng)系統(tǒng)特殊類型的間質(zhì)細(xì)胞，大量研究表明，它是胃腸道慢波的起搏細(xì)胞（Pacemaker cells）并參與慢波的傳播，對(duì)腸神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)信息傳遞具有重要的調(diào)控作用［16］。近年來，ICCs與胃腸動(dòng)力紊亂所導(dǎo)致的疾病之間的關(guān)系也越來越得到了實(shí)驗(yàn)支持，目前關(guān)于功能性便秘，國內(nèi)外已有不少相關(guān)研究，多數(shù)應(yīng)用Cajal間質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志物CD117來進(jìn)行研究。例如包云光等發(fā)現(xiàn)，在慢性傳輸性便秘患者中，遠(yuǎn)端結(jié)腸黏膜的CD117的數(shù)量少于對(duì)照組［17］。Torihashi等對(duì)30余例慢性特發(fā)性假性腸梗阻患者的腸壁組織進(jìn)行的研究指出：其中有三分之一的患者CD117陽性的ICC缺失或大量減少，從而推測(cè)ICCs的正確移行和分化障礙可能導(dǎo)致慢性特發(fā)性假性腸梗阻［18］。

在我們的研究中，通化利用免疫組合標(biāo)記Cajal間質(zhì)細(xì)胞特異標(biāo)記物CD117后，分析結(jié)果顯示，在OOC患者的結(jié)腸黏膜下層中CDⅡ7陽性的細(xì)胞表達(dá)計(jì)數(shù)平均值為（28.78±0.62），肌層中CD117表達(dá)陽性細(xì)胞的計(jì)數(shù)平均值為（10.44±0.66），而在相應(yīng)對(duì)照組，結(jié)腸黏膜下層中CDII7陽性的細(xì)胞表達(dá)計(jì)數(shù)平均值為（40.96±0.63），肌層中 CD117表達(dá)陽性細(xì)胞的計(jì)數(shù)平均值為（15.24±0.68），相應(yīng)的IOD平均值也都有類似的改變?？偟膩碚f，OOC組的ICCs細(xì)胞是明顯低于對(duì)照組的，并且可見直腸黏膜下層及肌層中腸壁中的ICCs體積變小，形成的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)變少。而王亮等發(fā)現(xiàn)在先天性巨結(jié)腸患兒狹窄段腸壁各層ICCs密度明顯減少或消失，正常網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)遭到破壞［19］。童衛(wèi)東等發(fā)現(xiàn)慢性傳輸性便秘患者肌壁個(gè)區(qū)域CD117的表達(dá)均下降［20］。ICCs在胃腸道不同層面幾乎都有分布，且功能也略有不同，比如肌間神經(jīng)層ICCs是胃腸道的主要起博細(xì)胞，而黏膜下層的ICCs是結(jié)腸的主要起博細(xì)胞［21］。在我們的實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，無論是OOC組還是對(duì)照阻，患者的黏膜固有層中，ICCs的數(shù)量幾乎沒有變化甚至略有升高，這可能與ICCs在腸壁中不同部位的分布不同有關(guān)。結(jié)合各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，ICCs數(shù)量的減少及功能缺失與多種胃腸道功能障礙性疾病高度相關(guān)。

正常情況下直腸膨脹刺激腸壁和恥骨直腸肌壓力感受器，引起內(nèi)、外括約肌及恥骨直腸肌松弛，肛直角變大，開始排便活動(dòng)［22］。出口梗阻性便秘的發(fā)病機(jī)制目前尚不明確，但國內(nèi)外的相關(guān)研究主要集中的胃腸動(dòng)力學(xué)、腸神經(jīng)遞質(zhì)、腸神經(jīng)系統(tǒng)、Cajal間質(zhì)細(xì)胞等方面。恥骨直腸肌長期反復(fù)發(fā)炎、充血、水腫，引起結(jié)締組織增生纖維化，瘢痕化，最終導(dǎo)致恥骨直腸肌彈性減退，舒縮功能降低，造成排便困難，可導(dǎo)致出口梗阻性便秘［22］。我們的研究表明OOC的形成可能主要與黏膜下層及肌層中的與ICCs的功能及形態(tài)變化密切相關(guān)，ICCs的數(shù)量減少，功能減弱，可能是引起OOC發(fā)病的病理生理機(jī)制之一，而引起這以上變化的原因還有待于進(jìn)一步的研究。