流式細(xì)胞術(shù)在蘭科植物中的應(yīng)用

李春楠 傅巧娟 沈國(guó)正 趙?？?張曉瑩 阮若昕

(杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 杭州 310024)

蘭科(Orchidaceae)是顯花植物中最大的科，全世界至少有800個(gè)屬，25 000～30 000個(gè)原生種，分布于各大洲(包括南極島)，具有很高的觀賞、藥用及生態(tài)價(jià)值[1-2]。蘭科植物歷史悠久，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的進(jìn)化和演變，加之上世紀(jì)80年代蘭花產(chǎn)業(yè)的大規(guī)模興起，種屬間雜交育種得以迅速發(fā)展，育種體系龐大而繁雜，種質(zhì)間細(xì)胞染色體數(shù)目、倍性等遺傳信息發(fā)生了復(fù)雜的變化[3]。研究蘭科種質(zhì)資源遺傳背景已成為育種的一項(xiàng)重要的基礎(chǔ)工作，對(duì)于親本合理選配、后代倍性預(yù)測(cè)、提高雜交成功率、掌握育種主動(dòng)性具有重要意義。

流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)是20世紀(jì)70年代發(fā)展起來(lái)的一種對(duì)懸浮的單細(xì)胞進(jìn)行高速分析和分選的技術(shù)，在動(dòng)植物細(xì)胞、微生物、細(xì)菌和病毒等生物體分選及其DNA、蛋白質(zhì)或其他分子的快速分析中廣泛應(yīng)用，是現(xiàn)代生物學(xué)、醫(yī)學(xué)常用的細(xì)胞分選技術(shù)[4]。在植物學(xué)研究中，流式細(xì)胞術(shù)常用于倍性分析、核型分析、細(xì)胞計(jì)數(shù)、DNA和RNA含量測(cè)定、轉(zhuǎn)基因檢測(cè)等方面，具有分析速度快、靈敏度高、可靠性好等優(yōu)點(diǎn)[5]。本文在簡(jiǎn)要介紹流式細(xì)胞術(shù)基本原理和關(guān)鍵技術(shù)的基礎(chǔ)上，對(duì)其在蘭科植物中的應(yīng)用現(xiàn)狀進(jìn)行綜述，旨在為全面了解細(xì)胞群體的流式快速分析方法，挖掘蘭科遺傳信息，拓展染色體結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)進(jìn)化、多組學(xué)聯(lián)合應(yīng)用等領(lǐng)域提供基礎(chǔ)資料。

1 FCM的原理及關(guān)鍵技術(shù)

1.1 FCM的原理

流式細(xì)胞儀的工作原理:在一定壓力下，待測(cè)樣品經(jīng)特異性熒光染色制備而成的細(xì)胞懸液進(jìn)入流動(dòng)室與鞘液在噴嘴處匯合，加速進(jìn)入照射室，細(xì)胞精確排成單列依次通過(guò)激光束，激光照射細(xì)胞發(fā)生散射和折射，發(fā)射出前向散射光(forward scatter，F(xiàn)SC)和側(cè)向散射光(side scatter，SSC)，前者與細(xì)胞的大小和體積有關(guān)，后者與細(xì)胞表面、內(nèi)部結(jié)構(gòu)如胞質(zhì)、胞膜、核膜及其大小和形狀有關(guān)；同時(shí)，激光激發(fā)細(xì)胞所攜帶的熒光素發(fā)射出熒光。檢測(cè)器把散射光和熒光轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，信號(hào)放大后再經(jīng)數(shù)據(jù)化處理，進(jìn)行細(xì)胞分析和分選[4]。

1.2 FCM關(guān)鍵技術(shù)

在植物學(xué)研究中，F(xiàn)CM的基本操作流程包括單細(xì)胞懸液的制備、細(xì)胞核熒光染色、流式細(xì)胞儀分析和熒光數(shù)據(jù)收集和整理等[6]。由于不同物種組織和細(xì)胞代謝產(chǎn)物的差異，流式細(xì)胞檢測(cè)的成敗和準(zhǔn)確性很大程度上取決于細(xì)胞核懸液制備及熒光染色2個(gè)步驟，因此，細(xì)胞緩沖液和熒光染料的制備和選擇至關(guān)重要。

1.2.1 單細(xì)胞懸液的制備 對(duì)于細(xì)胞核分離緩沖液的基本要求是抑制核酸酶、維持細(xì)胞核的完整性并能提供核酸染料染色最佳條件[7]。組織破碎不充分則單細(xì)胞得率較低，研究認(rèn)為組培苗幼嫩葉片組織是流式分析的合適材料[8]，但若組織過(guò)于幼嫩，破碎過(guò)程中易產(chǎn)生細(xì)胞碎片，會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果。此外，一些細(xì)胞次級(jí)代謝產(chǎn)物如花青素、草酸鈣等會(huì)對(duì)單細(xì)胞懸液質(zhì)量產(chǎn)生較大影響，因此，有效識(shí)別和去除這些特殊的細(xì)胞次級(jí)代謝產(chǎn)物，根據(jù)組織特點(diǎn)和細(xì)胞代謝產(chǎn)物類(lèi)別等篩選適宜的緩沖液，有利于提高檢測(cè)精度，獲取更美觀的流式峰圖。植物中常用的緩沖液有Galbraith’ s buffer[9]、LB01 buffer[10]、Otto’ s buffers[11]、MgSO4buffer[12]、Tris-MgCl2buffer[13]、Marie’ s buffer[14]、GPB(general purpose buffer)和WPB (woody plant buffer)[15]等。蘭科屬生育期較長(zhǎng)的多年生草本，成熟葉片組織質(zhì)地堅(jiān)硬且富含多種細(xì)胞代謝產(chǎn)物，如蝴蝶蘭(Phalaenopsis)細(xì)胞中含有大量的草酸鈣，極大地影響了完整細(xì)胞核的得率。Lee 等[16]在研究蝴蝶蘭的FCM 檢測(cè)系統(tǒng)時(shí)提出一種適用于堅(jiān)硬葉片組織且富含多糖類(lèi)、草酸鈣和其他代謝物的細(xì)胞懸液制備方法，可供借鑒和參考。

1.2.2 熒光染料的選擇 目前蘭科植物中使用最多的熒光染料是4，6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚(4，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)和碘化丙啶(propidium iodide，PI)染液。一般在分析植物倍性水平時(shí)，DAPI和PI 染液均能獲得良好的分離效果，但由于DAPI 特異性結(jié)合在腺嘌呤和胸腺嘧啶上[17]，所以在細(xì)胞核總DNA含量精確度要求較高時(shí)常用PI 染液。表1列舉了部分蘭科不同種屬所采用的FCM 緩沖液成分和熒光染料。

1.3 蘭科基因組大小和C值測(cè)定方法

基因組大小是物種遺傳信息的重要參數(shù)，在基因序列分析、種群基因組多樣性和進(jìn)化演變等研究中占有重要地位。物種基因組大小常通過(guò)C值反映，C值是指生物體不復(fù)制的單倍體細(xì)胞核(無(wú)論倍性水平)所含DNA的含量[42]。通常C值以基因組的堿基對(duì)來(lái)表示，一般認(rèn)為1 pg DNA的量相當(dāng)于978 Mb 堿基對(duì)[43]。由于C值反映的是單倍體細(xì)胞核總DNA含量，因此，二倍體(2n=2x)的基因組大小與C值相同，而多倍體的C值大于基因組大小[7]?；蚪M和C值的測(cè)定方法主要有Feulgen 分光光度法和FCM[44]，后者因其分辨率、靈敏度高，操作簡(jiǎn)便而被廣泛應(yīng)用。一般以已知基因組大小的標(biāo)準(zhǔn)品作為參照進(jìn)行DNA 總量分析來(lái)計(jì)算目標(biāo)基因組大小，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品與待測(cè)物混合上樣與否，又可分為內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法。通常先采用外標(biāo)法，估測(cè)未知基因組的大小范圍，確定合適的參考基因組，再將內(nèi)參加入待測(cè)物同時(shí)檢測(cè)，通過(guò)DNA含量峰值計(jì)算目標(biāo)基因組大小。計(jì)算公式如下[45]:

適宜的參考標(biāo)準(zhǔn)是獲得準(zhǔn)確基因組大小和C值數(shù)據(jù)的關(guān)鍵。通常選擇能較好區(qū)分待測(cè)樣品、二者之間基因組相差不大又不會(huì)重疊的物種作為參照，通過(guò)上述公式計(jì)算目標(biāo)C值。表2列舉了蘭科植物中常用的參考標(biāo)準(zhǔn)。此外，也可以植物DNA C值數(shù)據(jù)庫(kù)(https:/ /cvalues.science.kew.org/)中已公布基因組大小信息的物種作為參照樣本[46]。

2 FCM 在蘭科植物鑒定中的應(yīng)用研究

2.1 基因組大小和C值鑒定

早在1975年，Capesius 等[52]報(bào)道估測(cè)了第一個(gè)蘭科植物(一個(gè)蘭屬雜交種)的基因組大小，之后在FCM不斷發(fā)展和完善的背景下，越來(lái)越多的蘭科植物基因組大小和C值被測(cè)定。Jones 等[53]利用FCM 檢測(cè)了蘭科26個(gè)屬共70個(gè)種的基因組大小，2C 核DNA含量值介于1.91～15.19 pg之間(不包含石斛屬)，C值最小的為Cadetia taylori，最大的是Vanilla phaeantha；其中，石斛屬的2C值介于1.53(Dendrobium cruentum)～ 4.23 pg (Dendrobium spectabile)之間；汪琛穎等[19]以鐵皮石斛(Dendrobium officinale)為外參測(cè)定蘭屬蕙蘭的基因組大小為4.39±0.12 Gb，即2C DNA含量為8.98 pg；Ahmadian 等[27]測(cè)定頭蕊蘭屬3個(gè)種的基因組大小(2C)分別為27.49、35.39和36.33 pg；原沼蘭屬藥用植物Malaxis wallichii的2C DNA含量約為2.76 ± 0.02 pg，即1C=1 349.64 Mb[41]；Rewicz 等[34]估測(cè)了2個(gè)居群火燒蘭的基因組2C值平均為27.71和27.49 pg。此外，利用FCM 還測(cè)定了兜蘭[3，49]、樹(shù)蘭屬[28]和扇葉蘭屬[25]等蘭科的基因組大小和C值。

基因組是一個(gè)物種的基本特性，每個(gè)物種的C值通常是恒定的，然而，Leitch 等[54]在以327個(gè)蘭科植物為對(duì)象分析基因組多樣性時(shí)發(fā)現(xiàn)，盡管它們中不存在自然界中最大和最小的基因組，但在被子植物家族中卻是變異性最大、多樣性最豐富的，從C值最小1C=0.33 pg (Trichocentrum maduroi)跨度到最大1C=55.4 pg (Pogonia ophioglossoides)；盡管基因組大小變異范圍較大，但多數(shù)品種表現(xiàn)出集中分布的特點(diǎn)，且核DNA含量較小(平均1C=8.5 pg，圖1)；在所分析的4個(gè)亞科中，樹(shù)蘭亞科(Epidendroideae)的基因組變異最大，基因組偏小，而杓蘭亞科(Cypripedioideae)和香莢蘭亞科(Vanilloideae)的基因組最大。

表1 部分蘭科植物流式細(xì)胞分析緩沖液和熒光染料Table1 List of nuclear isolation buffers and fluorescence dyes used in flow cytometry of some Orchidaceae

隨著FCM 更加廣泛地用于植物基因組大小和C值測(cè)定，蘭科家族基因組信息不斷被補(bǔ)充，這將有助于開(kāi)展蘭科植物種屬特征分析、種質(zhì)資源鑒定、進(jìn)化關(guān)系研究、種群結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性分析等研究工作。

2.2 DNA倍性分析

在植物育種中，倍性是種質(zhì)資源的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)。植物倍性鑒定主要有2種方式，一是直接鑒定法，在細(xì)胞水平上確定染色體數(shù)目，即染色體計(jì)數(shù)；二是間接鑒定法，從表型特征、氣孔大小、保衛(wèi)細(xì)胞數(shù)目、核DNA含量等方面間接鑒定倍性。二者相比，染色體計(jì)數(shù)法準(zhǔn)確、可靠，但對(duì)細(xì)胞學(xué)操作技術(shù)要求較高，且費(fèi)時(shí)費(fèi)工，而傳統(tǒng)的間接鑒定法從表型和生理指標(biāo)上反應(yīng)倍性變化，但準(zhǔn)確性不高，很難區(qū)分非整倍體和嵌合體。隨著流式細(xì)胞術(shù)的發(fā)展，其能夠?qū)Υ罅刻幱诜至哑陂g的染色體核DNA含量進(jìn)行檢測(cè)間接分析植物DNA倍性，已成為快速、高通量鑒定種質(zhì)資源和多(單)倍體倍性的主流方法[55-56]。

表2 蘭科植物中常用的參照標(biāo)準(zhǔn)Table2 List of common reference standards used in Orchidaceae

圖1327 個(gè)蘭科植物的基因組大小分布[54]Fig.1 Distribution of genome sizes (1C-values)for 327 species of Orchidaceae[54]

2.2.1 種子低溫貯藏后成苗倍性鑒定為了保護(hù)瀕危蘭科植物，通常將種胚玻璃化后離體儲(chǔ)藏于低溫干燥的環(huán)境，并利用FCM 鑒定種胚在低溫貯藏后成苗的遺傳穩(wěn)定性。Hirano 等[21]對(duì)比不同成熟度(授粉后2～4月)白及種胚在不同低溫保存方式下離體成苗的倍性變化，發(fā)現(xiàn)種胚低溫貯藏后發(fā)育而成的植株能夠正常生長(zhǎng)，DNA倍性水平未發(fā)生改變；類(lèi)似的，石斛屬[2]、文心蘭屬[24]種子在低溫貯藏后萌發(fā)成苗仍能保持遺傳上的穩(wěn)定，未改變DNA倍性。

2.2.2 組織培養(yǎng)中遺傳穩(wěn)定性鑒定種苗在組培擴(kuò)繁過(guò)程中可能發(fā)生變異，因此，確保育種材料的遺傳穩(wěn)定性，或?qū)⒆儺惵士刂圃诤侠矸秶翘m花育種和生產(chǎn)中的重要環(huán)節(jié)，F(xiàn)CM 已成為高通量評(píng)估蘭科植物組培成苗遺傳穩(wěn)定性的主要手段，在藥用蘭科美冠蘭屬[20]、皇后蘭[26]、貝母蘭屬[36]、石斛屬[53，57-58]、蘭屬[59]及文心蘭屬[60]等蘭花中均有應(yīng)用。

2.2.3 多倍體和單倍體識(shí)別 利用化學(xué)誘變劑處理蘭花類(lèi)原球莖(protocorm like body，PLB)是獲得多倍體的有效手段。Chen 等[39]用已知倍性的對(duì)照作參照，利用FCM 鑒定加倍后的蝴蝶蘭倍性；Chung 等[40]分別采用不同濃度的秋水仙素和氨磺樂(lè)靈誘導(dǎo)蝦脊蘭雜交種子(Calanthe discolor×Calanthe sieboldii)，F(xiàn)CM鑒定種子成苗倍性，確定四倍體誘導(dǎo)率最高的是0.003%氨磺樂(lè)靈處理1～2 d；Han 等[23]利用FCM 檢測(cè)秋水仙素處理白及原球莖成苗后二倍體和同源四倍體倍性；Chen 等[61]提出了一種水平分割原球莖或類(lèi)原球莖誘導(dǎo)蝴蝶蘭多倍體的方法，無(wú)需藥劑處理，通過(guò)FCM 驗(yàn)證了該方法是獲得多倍體的有效途徑；Grosso等[62]用秋水仙素和甲基胺草磷處理石斛屬(Dendrobium)雜交種子形成的PLB，F(xiàn)CM 鑒定處理后的PLBs和幼苗倍性，根據(jù)前人的研究[63-64](略作修改)采用一種綜合指數(shù)Cycle Value 作為倍性評(píng)價(jià)指標(biāo)，證明Cycle Value 與倍性呈正相關(guān)，可有效用于多倍體的篩選。同時(shí)提出，當(dāng)Cycle Value ≥1 ± 0.1時(shí)能夠高效誘導(dǎo)四倍體的產(chǎn)生(Cycle Value=0×np1+1×np2+2×np3+3×np4…/np1+np2+np3+np4…，式中np1、np2、np3和np4代表流式細(xì)胞圖相應(yīng)峰值的細(xì)胞核數(shù)量)；FCM 亦可鑒別單性結(jié)實(shí)產(chǎn)生的單倍體，從白及柱頭注入萘乙酸鈉使其單性生殖，蒴果種胚播種后即可形成單倍體植株[22]。

此外，F(xiàn)CM 還用于蘭科其他種屬的倍性分析，如掌裂蘭屬[17，65]、手參屬[18，66]和香莢蘭屬(Vanilla)[67]等。

2.3 內(nèi)多倍化水平檢測(cè)

內(nèi)多倍性(endopolyploidy)是指同一個(gè)體、組織或器官相鄰體細(xì)胞中多種倍性細(xì)胞核同時(shí)存在的現(xiàn)象，是細(xì)胞核進(jìn)行正常的DNA 復(fù)制卻不發(fā)生細(xì)胞分裂引起的[68-69]，最早由Levan[70]在洋蔥(Allium cepa)根部成熟區(qū)報(bào)道，這種核內(nèi)再?gòu)?fù)制現(xiàn)象在高等植物中廣泛存在，普遍發(fā)生在被子植物和蘚綱中[7，63，71]，在特定細(xì)胞或組織中能夠觀察到。FCM是基于細(xì)胞核DNA含量差異來(lái)區(qū)分不同倍體細(xì)胞，可以準(zhǔn)確地識(shí)別內(nèi)多倍體的存在和內(nèi)多倍化水平。蘭科的核內(nèi)再?gòu)?fù)制現(xiàn)象普遍發(fā)生，如掌裂蘭屬和蜂蘭屬[29]、萬(wàn)代蘭屬[30，72]、紫苞舌蘭[31]、原沼蘭屬[41]、蝴蝶蘭屬和五唇蘭屬(Doritis pulcherrima)[48]、石斛屬[73]、蘭屬[8]、兜蘭屬[74]、文心蘭屬[75]等均存在內(nèi)多倍化現(xiàn)象。

植物體內(nèi)多倍化水平因組織器官和發(fā)育階段而異，這在蕓薹屬(Brassica)[76-77]、紫薇(Lagerstroemia indicaL.)[78]、大麥和小麥(Triticum)[79]等中已有報(bào)道。在蘭科植物中，F(xiàn)CM 可檢測(cè)到萬(wàn)代蘭葉片、根和柱頭中的多倍性細(xì)胞，但在花被、花梗等部位并未發(fā)現(xiàn)。同時(shí)，隨著體胚的不斷發(fā)育，內(nèi)多倍性水平也在不斷升高，激素[如萘乙酸(naphthalene acetic acid，NAA)]處理可以提高體胚的多倍化進(jìn)程[30]；在熱帶蘭科植物紫苞舌蘭(Spathoglottis plicata)中也發(fā)現(xiàn)了類(lèi)似的現(xiàn)象，不同器官的內(nèi)多倍化水平不一，其中，處于發(fā)育階段的花梗在流式DNA含量直方圖顯示出2C、4C、8C和16C 4個(gè)峰值，內(nèi)多倍化水平較高，但在花萼、花瓣、子房中未發(fā)現(xiàn)內(nèi)多倍化現(xiàn)象[31]；小蘭嶼蝴蝶蘭(Phalaenopsis equestris)不同組織內(nèi)多倍性細(xì)胞存在2C、4C、8C、16C和32C 水平，多倍化程度在葉、花、根中呈極顯著差異[48]。此外，內(nèi)多倍化現(xiàn)象在蘭科植物賴(lài)以繁殖的類(lèi)PLB和根狀莖中依然存在。Fukai 等[8]利用FCM 分析了蘭屬中以PLB 繁殖的附生蘭和以根狀莖繁殖的地生蘭(Cymbidium kanran)的體細(xì)胞多倍性，發(fā)現(xiàn)PLB 上產(chǎn)生的芽存在2C和4C 兩個(gè)峰值，而PLB 本身則檢測(cè)到2C、4C、8C和16C的多倍性細(xì)胞，花器官(不包括子房)、根、根狀莖中均呈現(xiàn)出高度多倍性，之后，在對(duì)不同PLB 內(nèi)部結(jié)構(gòu)及幼苗細(xì)胞倍性的研究表明，盡管不同途徑產(chǎn)生的PLB 內(nèi)多倍性水平存在差異，但在成苗后細(xì)胞倍性將趨于穩(wěn)定[50-51]。

研究證明，細(xì)胞內(nèi)多倍性在蘭科不同組織器官中有一定的差異，這種差異可能與形態(tài)建成及增強(qiáng)植物逆境脅迫的適應(yīng)性有關(guān)[63]。內(nèi)多倍性可在多種類(lèi)型細(xì)胞中存在，尤其是那些正處于分化和增殖的細(xì)胞[69]，在調(diào)節(jié)植物組織、器官生長(zhǎng)發(fā)育和增強(qiáng)對(duì)環(huán)境脅迫的適應(yīng)性方面具有積極作用。早期在對(duì)玉米內(nèi)多倍化現(xiàn)象的研究中也發(fā)現(xiàn)，核內(nèi)再?gòu)?fù)制能夠增強(qiáng)玉米幼苗的耐冷性[80]，提高玉米胚乳細(xì)胞的活性，快速積累儲(chǔ)藏物質(zhì)[81]。此外，植物的內(nèi)多倍性還與一些形態(tài)發(fā)育相關(guān)，生物體通過(guò)核內(nèi)再?gòu)?fù)制方式使細(xì)胞增大來(lái)影響其表型性狀，如蝴蝶蘭屬花的大小和發(fā)育與內(nèi)多倍性水平呈緊密的正相關(guān)關(guān)系[38，82]；細(xì)胞再?gòu)?fù)制能力及內(nèi)多倍性水平不僅與細(xì)胞周期、倍性水平、所處器官和細(xì)胞發(fā)育狀態(tài)有關(guān)[51]，而且還受溫度[83]、光質(zhì)[84]、聲波處理[85]等外界條件的影響。因此，深入了解內(nèi)多倍性的特點(diǎn)和發(fā)生規(guī)律，在蘭花選育種中，可能通過(guò)調(diào)整內(nèi)多倍性水平來(lái)調(diào)控植物抗逆性和表型特征，從而輔助育種研究。

3 結(jié)論與展望

FCM 以其分析簡(jiǎn)便、快速，靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，在植物基因組大小測(cè)定、DNA倍性分析、堿基組成分析、植物性別鑒定、細(xì)胞周期、細(xì)胞計(jì)數(shù)等方面有著明顯的優(yōu)勢(shì)[7，86-87]?；诤薉NA 總量分析，F(xiàn)CM 能獲取物種基礎(chǔ)遺傳信息，為基因組測(cè)序、分子生物學(xué)等相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)，還能進(jìn)一步了解植物的分布規(guī)律、進(jìn)化演變和基因組多樣性對(duì)物種產(chǎn)生的影響，在細(xì)胞分類(lèi)學(xué)和進(jìn)化研究中具有重要地位[54]。此外，F(xiàn)CM 還可分析不同基因型的同源關(guān)系和減數(shù)分裂行為[25]、區(qū)分具有相同染色體數(shù)的不同種[88-90]、分析雜合子的基因構(gòu)成[91-92]以及評(píng)估植物細(xì)胞的脅迫損傷程度[93-95]等。隨著FCM技術(shù)的不斷發(fā)展和新型流式細(xì)胞儀的開(kāi)發(fā)研制，F(xiàn)CM技術(shù)將在蘭科基因組學(xué)、分類(lèi)進(jìn)化、染色體結(jié)構(gòu)等相關(guān)領(lǐng)域具有更加廣泛的應(yīng)用潛力。