農(nóng)桿菌介導高粱成熟胚遺傳轉(zhuǎn)化獲得耐草甘膦植株

郝曜山 王曉清 張歡歡 王亦學 孫 毅 段永紅 杜建中 周福平

(1山西省農(nóng)業(yè)科學院高粱研究所高粱遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新山西省重點實驗室，山西 晉中 030600；2山西省農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究中心，山西 太原 030031；3山西農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，山西 太谷 030801)

高粱[Sorghum bicolor(L.) Moench]是世界上重要的糧食、飼料和釀酒原料，因其本身具有抗旱耐澇、耐鹽堿、耐貧瘠等特性，一直是旱作農(nóng)田的先鋒作物[1]。長久以來，草害一直是造成高粱產(chǎn)量、品質(zhì)下降的重要因素之一[2]。由于高粱是一種對除草劑敏感性較強的作物，除草劑使用不當，極易對高梁產(chǎn)生藥害[3]。因此，要解決現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的規(guī)?；?、機械化快速發(fā)展及粱農(nóng)村勞動力縮減等問題的矛盾，必須選育抗除草劑高粱，并配合田間化學防治雜草的技術[2]?，F(xiàn)代植物基因工程可以直接將抗除草劑的功能基因?qū)敫吡?，有效克服高粱傳統(tǒng)育種中有性雜交不親和及抗除草劑種質(zhì)資源匱乏等弊端，為高粱抗除草劑遺傳改良提供新的途徑[4]。

目前，常用的高粱基因轉(zhuǎn)化方法有5種:農(nóng)桿菌介導法、基因槍法、PEG 法、電激法和花粉管通道法[5]。其中，前4種方法均依賴于植物高頻率組織培養(yǎng)再生體系或原生質(zhì)體培養(yǎng)體系的建立。近些年通過組織培養(yǎng)進行高粱遺傳轉(zhuǎn)化的報道逐漸增多，Zhao 等[6]首次利用農(nóng)桿菌介導法，以高粱幼胚作為受體材料，導入外源基因bar獲得了轉(zhuǎn)基因植株；朱莉等[7]以甜高粱幼穗愈傷組織為轉(zhuǎn)化受體，通過農(nóng)桿菌介導法將Bt cry1Ah基因成功導入到2個甜高粱品種BABUSH和MN-3025 中；Lu 等[8]和Wu 等[9]分別建立了高粱高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系并分別獲得了高達20.7%和33%的遺傳轉(zhuǎn)化率。但這些成果仍然集中在少數(shù)模式材料(Tx430、P898012[10]及一些甜高粱品種)中。與其他重要禾本科作物相比，高粱依然被認為是再生體系最難建立、基因轉(zhuǎn)化最困難的作物之一。此外，采用花粉管通道法進行高粱轉(zhuǎn)基因，雖然不經(jīng)過組織培養(yǎng)，但其存在操作難度大、轉(zhuǎn)化率低、可重復性差等缺點，較前4種方法應用較少。

本研究擬對萌動的高粱種子進行農(nóng)桿菌侵染、愈傷組織誘導，以及基因轉(zhuǎn)化因素的優(yōu)化與分析。將中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所玉米分子遺傳改良實驗室保存構(gòu)建的土壤農(nóng)桿菌CP4株系攜帶抗除草劑目的基因5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合酶基因(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase，CP4-EPSPS)的載體pM3301UbiSpCP4 導入高粱Is-623 中，以期獲得耐草甘膦高粱新品系，豐富轉(zhuǎn)基因高粱耐除草劑材料，嘗試建立以高粱萌動的成熟種子為外植體的基因轉(zhuǎn)化體系。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 受體材料 選用高粱材料Is-623 成熟種子為待處理轉(zhuǎn)化材料(由山西省農(nóng)業(yè)科學院高粱研究所保存)。

1.1.2 菌株與質(zhì)粒 農(nóng)桿菌菌株為LBA4404，由中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所玉米分子遺傳改良實驗室構(gòu)建保存，內(nèi)含pM3301UbiSpCP4 質(zhì)粒，攜帶目的基因CP4-EPSPS，全長10 293 bp，該菌株產(chǎn)物對除草劑草甘膦具有很強抗性(圖1)。質(zhì)粒目的基因CP4-EPSPS受組成型強啟動子——玉米泛素啟動子pZmUbi-1 啟動表達和NOS 終止子調(diào)控，該基因既可作為目的基因，又可作為篩選標記。

圖1 pM3301UbiSpCP4質(zhì)粒載體Fig.1 The structure of the pM3301UbiSpCP4 plasmid

1.1.3 培養(yǎng)基配方 1)侵染培養(yǎng)基:MS+1 g·L-1水解酪蛋白氨基酸、5 mg·L-1麥草畏(dicamba)[11]、65 g·L-1蔗糖、30 g·L-1葡萄糖；

2)共培養(yǎng)基:MS+5 mg·L-1麥草畏、20 g·L-1蔗糖、10 g·L-1葡萄糖、500 mg·L-12-(N-嗎非啉)乙磺酸[2-(n-murphyline) ethanesulfonic acid，MES]、8 g·L-1瓊脂(agar)，100 μmol·L-1高壓滅菌后加入乙酰丁香酮(acetosyringone)；

3)愈傷組織誘導培養(yǎng)基:MS+5 m·L-1麥草畏、20 g·L-1蔗糖、1.53 g·L-1磷酸二氫鉀(KH2PO4)、2.4 g·L-1植物凝膠(gelrite)、5 mg·L-1硝酸銀(AgNO3)、100 mg·L-1酸水解酪蛋白氨基酸(N-Z-Amine)、10 mg·L-1草甘膦(glyphosate)、250 mg·L-1頭孢噻肟鈉(cefotaxime)；

4)篩選培養(yǎng)基:MS+5 m·L-1麥草畏、20 g·L-1蔗糖、1.53 g·L-1KH2PO4、2.4 g·L-1植物凝膠(gelrite)、5 mg·L-1硝酸銀、100 mg·L-1N-Z-Amine、10 mg·L-1草甘膦、250 mg·L-1cefotaxime；

5)再生培養(yǎng)基:MS+0.5 mg·L-1KT、20 g·L-1蔗糖、1.53 g·L-1KH2PO4、2.4 g·L-1gelrite、25 mg·L-1草甘膦、250 mg·L-1cefotaxime；

6)生根培養(yǎng)基:1/2MS+20 g·L-1蔗糖、2.4 g·L-1Gelrite、250 mg·L-1cefotaxime。

以上所有培養(yǎng)基pH值均為5.8，121℃高壓滅菌20 min，備用，其中乙酰丁香酮、AgNO3、頭孢噻肟鈉和酸水解酪蛋白氨基酸在滅菌后溫度降至60℃左右時于超凈工作臺加入。以上試劑均購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

培養(yǎng)室溫度為27±3℃，光周期條件為光16 h/暗8 h，光照強度為2 000～5 000 lx[12]，其中共培養(yǎng)為暗培養(yǎng)。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體的準備 挑選成熟飽滿高粱種子，用自來水沖洗除去表面雜質(zhì)，無菌條件下75%酒精消毒1 min，然后用30%雙氧水消毒1.5～3.0 h。處理后的種子用無菌水沖洗6 遍，然后置于裝有無菌水的組培瓶中，置于25℃條件下培養(yǎng)24 h，待其萌動露白后備用。

1.2.2 農(nóng)桿菌的活化與外植體的侵染、轉(zhuǎn)化、篩選、再生 將含有質(zhì)粒pM3301UbiSpCP4的農(nóng)桿菌菌株LBA4404 在冰中融化，接種于YEP 液體培養(yǎng)基中[含100 mg·L-1利福平和50 mg·L-1卡那霉素(kanamycin)]，調(diào)節(jié)搖床于28℃、220 r·min-1培養(yǎng)過夜。菌液OD600值為0.6～0.8時，將菌液離心(8 000 r·min-1)，收集沉淀，用侵染培養(yǎng)基懸浮制作侵染液(OD600=0.8)，加入乙酰丁香酮后于28℃混勻，待用。

將萌動露白的高粱種子放到含侵染液的試管中，最大速度渦旋10 s，然后室溫靜止5 min，棄去侵染液，用無菌濾紙吸干殘留的侵染液后接于共培養(yǎng)基中，25℃條件下暗培養(yǎng)3 d。

將萌動種胚轉(zhuǎn)到愈傷組織誘導培養(yǎng)基上，28℃暗培養(yǎng)10～12 d；將愈傷轉(zhuǎn)到篩選培養(yǎng)基上，28℃暗培養(yǎng)14 d，可繼代培養(yǎng)；將篩選后存活的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)移到再生培養(yǎng)基上，26℃光照條件下培養(yǎng)10～12 d。轉(zhuǎn)移全部的已分化的植株到生根培養(yǎng)基上，26～28℃光照條件下培養(yǎng)至生根。

1.2.3 麥草畏對高粱成熟萌動胚愈傷組織誘導的影響 采用麥草畏作為高粱愈傷組織誘導激素。將萌動露白的高粱種子分別放入含有1.0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0 mg·L-1麥草畏的愈傷組織誘導培養(yǎng)基上，28℃暗培養(yǎng)10～12 d 后統(tǒng)計愈傷組織誘導率:

愈傷組織誘導率=誘導出愈傷組織的外植體/接種外植體(萌動露白的高粱種子)總數(shù)×100%。

1.2.4 侵染時間對高粱愈傷組織轉(zhuǎn)化效率的影響 預備試驗中將滅菌處理后萌動露白的高粱種子放在OD600值為0.6～0.8的侵染液中分別侵染0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 h 后，共培養(yǎng)3 d，然后轉(zhuǎn)至愈傷組織誘導培養(yǎng)基上，28℃暗培養(yǎng)10～12 d。每個處理挑選健康生長的愈傷組織30 塊，重復3次，轉(zhuǎn)到篩選培養(yǎng)基上，28℃暗培養(yǎng)14 d，統(tǒng)計抗性愈傷的比率。

1.2.5 轉(zhuǎn)化株的PCR檢測 取愈傷組織再生的高粱抗性植株(T0)與對照(CK)葉片0.2 g，CTAB 法提取總DNA。用引物CP4-F:5′-CGCGATCATACGGAAAAG AT -3′，CP4-R:5′-GTGACAGGGTTTTCCGACAC-3′擴增導入的目的基因CP4-EPSPS，該引物擴增片段條帶大小為668 bp。擴增程序:94℃預變性5 min；94℃變性30 s，60℃退火45 s，72℃延伸60 s，32個循環(huán)；72℃再延伸5 min。PCR 擴增產(chǎn)物用1.0%電泳分離，并觀察拍照[13]。

1.2.6 轉(zhuǎn)化植株的Southern blotting 分析 取PCR 陽性的轉(zhuǎn)化株(T0)葉片1 g，CTAB 法提取高粱總基因組DNA，用HindⅢ與EcoRⅠ限制性內(nèi)切酶雙酶切后，將酶切產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠上電泳分離。DNA 探針選用CP4-EPSPS基因大小為668 bp片段，Southern blot試劑盒為瑞士Roche 公司的DIG DNALabling and Detection Kit。具體試驗方法參照《分子克隆實驗指南》[14]，雜交后用X-光片顯影曝光。

1.2.7 轉(zhuǎn)基因高粱CP4-EPSPS基因表達產(chǎn)物的測定 取Southern blotting 分析陽性轉(zhuǎn)化株(T0)和對照葉片約0.2 g，采用CP4 快速檢測試紙條(北京奧創(chuàng)金標生物技術公司)檢測目標基因蛋白表達。

1.2.8 轉(zhuǎn)基因高粱耐草甘膦性能的鑒定 T0經(jīng)分子檢測的轉(zhuǎn)基因高粱株系于6月初移栽，待葉片長至四至五葉期，采用20 mmol·L-1草甘膦溶液進行噴施，10 d 后進行草甘膦抗性鑒定并統(tǒng)計分析。根據(jù)具體情況參考GB/T 17980.42-2000[15]對T0高粱抗草甘膦性能進行分級，分級標準如下:

等級1:施藥后植株無任何藥害，生長健壯正常；

等級2:施藥后輕微藥害，葉片藥害少于10%，生長健壯正常；

等級3:施藥后植株萎焉、藥害后可恢復，中等藥害，基本不影響產(chǎn)量；

等級4:施藥后藥害較重，難以恢復，造成減產(chǎn)；

等級5:被施藥后藥害嚴重，萎焉枯萎，絕產(chǎn)或死亡。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)CP4-EPSPS基因高粱植株的獲得

生長良好的高粱成熟種子萌動胚經(jīng)農(nóng)桿菌侵染共培養(yǎng)后誘導愈傷組織，轉(zhuǎn)移到愈傷組織誘導培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)10～12 d 后轉(zhuǎn)入含25 mg·L-1草甘膦篩選培養(yǎng)基，28℃暗培養(yǎng)14 d，進行3 輪繼代篩選，大部分愈傷組織生長緩慢，褐變腐死，少部分生長旺盛、顏色鮮嫩。經(jīng)篩選共獲得301 塊抗性愈傷組織，經(jīng)過再生培養(yǎng)、生根培養(yǎng)、緩苗狀苗后，移栽到溫室(圖2)。最終共獲得75株成活苗、19株PCR 陽性植株及17株Southern blotting 檢測陽性植株。以獲得的抗性愈傷組織為分母，計算得到平均轉(zhuǎn)化率為5.6%。

2.2 麥草畏對高粱成熟萌動胚愈傷組織誘導的影響

由圖3可知，隨著培養(yǎng)基中麥草畏濃度的升高，外植體愈傷誘導率快速升高，當麥草畏濃度為5 mg·L-1時，外植體愈傷誘導率達到最高；麥草畏濃度超過7.5 mg·L-1時，外植體愈傷誘導率明顯下降；當麥草畏濃度為15 mg·L-1時，外植體愈傷誘誘導率幾乎為零，且麥草畏對高粱萌動種子達到半致死劑量。綜上，麥草畏對高粱成熟萌動胚愈傷組織適宜誘導濃度約為5 mg·L-1。

2.3 農(nóng)桿菌侵染時間對高粱遺傳轉(zhuǎn)化效率的影響

由圖4可知，隨著侵染時間的逐漸延長，高粱遺傳轉(zhuǎn)化效率先升高后趨于穩(wěn)定。當侵染時間為2 h時，高粱遺傳轉(zhuǎn)化效率達到最高?？紤]試驗效率，選擇2 h作為農(nóng)桿菌適宜的侵染時間。

2.4 轉(zhuǎn)基因植株的PCR 分析

PCR檢測結(jié)果表明，有19株再生高粱和陽性對照(質(zhì)粒DNA)均擴增出大小相同，長度為668 bp的目標條帶，水空白對照(CK2)和非轉(zhuǎn)基因原受體高粱的負對照(CK1)均未擴增出目標條帶(圖5)，初步證明外源基因CP4-EPSPS已導入受體高粱的基因組DNA 中。在75株成活苗中，僅有19株PCR檢測成陽性，說明經(jīng)篩選培養(yǎng)基篩選并再生的植株中有74%為假陽性苗。

圖2 轉(zhuǎn)CP4-EPSPS基因高粱植株的獲得Fig.2 Acquirement of transgenic CP4-EPSPS sorghum

2.5 轉(zhuǎn)基因植株Southern blotting 分析

為了進一步研究CP4-EPSPS基因是否整合到高粱基因組DNA 中，對19株PCR檢測呈陽性的植株進行Southern blotting 雜交分子檢測。轉(zhuǎn)化株基因組DNA 經(jīng)Hind Ⅲ與Sal 酶雙切后，質(zhì)粒CK+和目的基因探針雜交后有17株顯示了特異的陽性條帶(圖6)，而未轉(zhuǎn)化的陰性對照植株(圖6，泳道N)無雜交信號，結(jié)果初步證實CP4-EPSPS基因已整合到高粱基因組DNA 中。其中轉(zhuǎn)化材料10 出現(xiàn)了雙條或多條雜交帶，證明部分材料外源基因以多拷貝的形式整合到了受體高粱材料的基因組中。

2.6 轉(zhuǎn)基因高粱CP4-EPSPS基因表達產(chǎn)物的測定

將Southern blotting 雜交分子檢測篩選鑒定后的轉(zhuǎn)基因陽性植株17株及陰性對照植株，分別利用北京奧創(chuàng)金標生物技術公司生產(chǎn)的CP4-EPSPS 蛋白檢測試紙條檢測，其中試紙條檢測為陽性(兩條帶)的有12株，有5株轉(zhuǎn)化株和陰性對照植株(CK-1)同表現(xiàn)為陰性。部分抗草甘膦蛋白免疫試紙條檢測結(jié)果見圖7，3、6、7、8、10、11、13、16、18、20、25 轉(zhuǎn)化株CP4-EPSPS基因表達蛋白檢測為陽性，19 轉(zhuǎn)化株Southern blotting檢測結(jié)果為陽性，但其基因表達蛋白檢測結(jié)果與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ諜z測結(jié)果均為陰性。

圖3 麥草畏濃度對高粱成熟萌動胚愈傷組織誘導率的影響Fig.3 Effect of dicamba concentration on callus induction rate of sorghum mature germinating embryos

圖4 不同侵染時間對高粱遺傳轉(zhuǎn)化效率的影響Fig.4 Effect of different infection time on transformation efficiency of sorghum

圖5 轉(zhuǎn)基因高粱CP4-EPSPS基因PCR檢測Fig.5 PCR analysis of transformed sorghum plants(CP4-EPSPS gene)

2.7 轉(zhuǎn)基因高粱耐草甘膦性能的鑒定

T0轉(zhuǎn)基因植株(成苗75株)和對照植株噴霧除草劑的初步調(diào)查顯示，抗性等級1級株系有6株，抗性等級2級株系有3株，抗性等級3級株系有2株，抗性等級4級株系有1株，抗性等級5級株系有63株(表1)，其田間表現(xiàn)狀況與CP4-EPSPS 蛋白檢測試紙條檢測結(jié)果一致。其余分子檢測為陰性的株系與對照植株在草甘膦噴霧25 d 后全部死亡，抗性等級也為5級，田間抗性檢測結(jié)果與分子檢測結(jié)果一致，證明導入和表達CP4-EPSPS基因可以提高轉(zhuǎn)基因植株的草甘膦耐性。

3 討論

眾所周知，高粱是外源基因?qū)胱铍y的禾本科作物之一，其愈傷組織誘導和再生受諸多因素影響，如外植體的選擇、激素配比、基因型等都是決定遺傳轉(zhuǎn)化再生成功的重要因素[16-18]。林鳳等[19]、張明洲等[20]及石太淵等[21]在使用高粱莖尖、幼穗和幼胚等作為外植體培養(yǎng)誘導再生高粱的試驗中，都得出幼穗和幼胚作為外植體是誘導率和分化率最高的結(jié)論。而王棟等[22]和趙利銘等[23]研究表明，使用高粱成熟種子作外植體，加以相關培養(yǎng)基配方調(diào)整也可以獲得較高的愈傷誘導率和組織分化率。本研究以剛露白的成熟高粱種子為外植體，首次以麥草畏取代常用的2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-dichlorophenoxyacetic acid，2，4-D)、6-芐氨基嘌呤[N-(phenylmethyl)-9H-purin-6-amine，6-BA]等激素，同樣獲得了較高的愈傷誘導率(85%以上)，達到甚至超過了以高粱幼胚為外植體的愈傷誘導率，但組織分化率水平一般，褐化較嚴重，這可能與試驗所用材料的基因型有關，具體原因有待進一步探究。盡管如此，利用萌動后的高粱種子作為外植體，避免了幼胚及幼穗作外植體取材受季節(jié)限制的缺點，也避免了成熟胚作外植體要剝胚[24]的繁瑣操作，極大地提高了高粱遺傳轉(zhuǎn)化的效率。

目前關于受體材料選擇、預培養(yǎng)時間、乙酰丁香酮濃度、侵染時間和侵染液濃度、共培養(yǎng)時間等轉(zhuǎn)化條件對高粱基因轉(zhuǎn)化的影響均已有詳細的研究報道[4，6，25]。本研究以高粱萌動胚作為侵染對象，結(jié)果表明，侵染時間為0.5～2 h時，侵染時間越長，所獲得的抗性愈傷組織率越多，但侵染時間繼續(xù)延長至5 h，所獲得的抗性愈傷組織率保持在穩(wěn)定水平，這與彭亞博等[12]和張微等[4]的研究結(jié)果不同，可能與采用的外植體不同有關，與幼胚相比，露白的種子被農(nóng)桿菌菌液侵染時具有更強的耐受力，具體原因有待進一步研究。

表1 轉(zhuǎn)基因高粱耐草甘膦性能的鑒定及計數(shù)Table1 Identification and counting of glyphosate tolerance of transgenic sorghum

圖6 部分轉(zhuǎn)基因高粱植株Southern blotting 分析結(jié)果Fig.6 Part of transformed sorghum plants identified by Southern blotting

圖7 部分轉(zhuǎn)基因高粱植株抗草甘膦蛋白免疫試紙條檢測結(jié)果Fig.7 Detection results about part of transformed sorghum plants by glyphosate protein immunoassay strip

CP4-EPSPS基因能否整合到轉(zhuǎn)化受體DNA，能否正確表達及表達水平的高低決定著所獲得的轉(zhuǎn)基因高粱對草甘膦的耐性程度[26-28]，也決定著轉(zhuǎn)基因高粱遺傳轉(zhuǎn)化成功與否及其應用價值。楊慧珍等[29]在轉(zhuǎn)草甘膦玉米的ELISA 檢測和田間抗性鑒定時發(fā)現(xiàn)，所獲得的10個轉(zhuǎn)化事件中，高耐株系有4個，耐性株系有5個，低耐株系有1個，不同轉(zhuǎn)化事件中目的基因的拷貝數(shù)、表達量與其植株的除草劑耐性值的差異有關。本研究也發(fā)現(xiàn)了類似現(xiàn)象，轉(zhuǎn)CP4-EPSPS基因高粱植株的草甘膦耐性在不同轉(zhuǎn)化事件中存在差異[30]。如抗性等級4級的株苗(編號為10的轉(zhuǎn)化材料)的Southern blotting 雜交分析結(jié)果為多拷貝陽性苗，田間草甘膦耐性較低，未能完成正常的生長周期。編號為18的轉(zhuǎn)化材料雖經(jīng)Southern blotting 雜交分析檢測與編號7 等材料同為單拷貝，但田間草甘膦耐性僅為3級，試紙條基因表達顯示條帶較弱，顯示外源基因在受體中表達，不僅與轉(zhuǎn)化拷貝數(shù)有關，也與插入植物DNA位點的表達調(diào)控有關[28，31]。此外，轉(zhuǎn)基因高粱的遺傳穩(wěn)定性對轉(zhuǎn)基因高粱品種的選育至關重要，繼續(xù)對所獲轉(zhuǎn)化材料的后代進行田間鑒定和分子檢測，直至獲得外源基因純合穩(wěn)定遺傳的高代轉(zhuǎn)基因系，將是下一步深入開展的工作。

4 結(jié)論

本研究利用農(nóng)桿菌介導高粱萌動種子誘導愈傷進行遺傳轉(zhuǎn)化，初步建立了一套以高粱萌動露白種子為外植體的農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化體系，證明麥草畏(dicamba)可以誘導高粱成熟胚愈傷組織的發(fā)生，且有較高的愈傷誘導率。此外，農(nóng)桿菌介導高粱成熟胚轉(zhuǎn)化時，隨著侵染時間的延長，高粱遺傳轉(zhuǎn)化率呈先升高后穩(wěn)定的規(guī)律，獲得了耐草甘膦轉(zhuǎn)基因高粱新材料。本研究結(jié)果為高粱萌動種胚遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立和遺傳改良提供了參考和技術途徑。