三七藥材中快速批量分離提取人參皂苷Rd的方法分析

喻錄容　何先元

【摘要】目的：探究三七藥材中快速批量分離提取人參皂苷Rd的方法。方法：先經(jīng)乙醇提取三七藥材中的總皂苷，再用大孔吸附樹(shù)脂乙醇水溶液能分離，用硅膠柱“氯仿、甲醇、水”溶劑進(jìn)行梯度洗脫進(jìn)行純化。結(jié)果：用大孔吸附樹(shù)脂乙醇水溶液能成功分離三七總皂苷中的人參二醇組皂苷與人參三醇組皂苷。硅膠柱“氯仿、甲醇、水”溶劑進(jìn)行梯度洗脫，可得到Rd單位。結(jié)論：大孔吸附樹(shù)脂分離法和硅膠柱溶劑洗脫法結(jié)合的方式，適用于三七藥材中快速批量分離提取人參皂苷Rd。

【關(guān)鍵詞】三七;分離提取;人參皂苷Rd

三七，五加科植物，人參屬，云南是我國(guó)的三七主產(chǎn)區(qū)。三七總皂苷（ Panax notoginseng saponins，PNS）是三七的主要活性成分。目前，已知的能從三七中分離出來(lái)的人參皂苷已經(jīng)超過(guò)70種。其中，三七中人參皂苷Rd的含量為0.5%-0.7%。已有的醫(yī)學(xué)研究表明，人參皂苷Rd對(duì)心腦血管、免疫系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)均具有一定的作用，可能成為腦中風(fēng)臨床治療的新型藥物。另有研究資料顯示，與其他的皂苷相比，人參皂苷Rd具有更強(qiáng)的活性，在保護(hù)神經(jīng)、陣痛等方面的作用更佳。但由于植物中的人參皂苷Rd含量較低，化學(xué)結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，現(xiàn)有的科技手段僅能通過(guò)原植物的根莖葉中進(jìn)行提取，并不能進(jìn)行化學(xué)合成。而植物提取人參皂苷Rd的效率低、成本高，導(dǎo)致人參皂苷Rd的利用也并不廣泛。本次研究選取云南文山的三七根莖為原材料，對(duì)其中含有的人參皂苷Rd進(jìn)行分離提取，探索了快速批量分離提取人參皂苷Rd的方法。

1材料與方法

1.1材料和試劑

三七根莖，產(chǎn)地為云南省文山縣，購(gòu)買(mǎi)自當(dāng)?shù)氐乃幉氖袌?chǎng)，60頭。AB-8型大孔吸附樹(shù)脂，20～40目，上海源葉生物科技有限公司提供。層析用硅膠H，100～200目，青島邦凱高新技術(shù)材料有限公司提供?；瘜W(xué)試劑為分析純。

1.2方法

1.2.1大孔吸附樹(shù)脂柱分離：取三七根莖樣品1000g，研碎成60目。加入90%乙醇2000ml，冷浸18h后過(guò)濾。藥渣再次加入90%乙醇1800ml，熱回流提取2次，每次2小時(shí)。冷卻至常溫。過(guò)濾，將三次所得的溶液進(jìn)行合并。用65℃水浴減壓回收溶劑，用甲醇溶解殘?jiān)?0×1200mm層析柱裝填A(yù)B-8型大孔吸附樹(shù)脂2000g，用25%乙醇平衡柱，放置樣液后，以此用25%，40%，80%，95%乙醇梯度洗脫，流速10ml/min，每500ml為1份，共80份。

洗脫液以硅膠H薄層色譜進(jìn)行分析，展開(kāi)劑比例：正丁醇：乙酸乙酯：水為4：1：5。10%硫酸乙醇溶液顯色，合并色譜斑點(diǎn)相同組分，減壓回收溶劑。

1.2.2分離和純化：60×1200mm層析柱裝填層析用硅膠2000g，用氯仿、甲醇平衡柱子，比例為84：16。將1.2.1分離出來(lái)的人參皂苷Rd組分濃縮液加入，依次用不同比例的氯仿、甲醇、水進(jìn)行溶劑洗脫，分別是83：16：1;76：22：2;68.5：27.5：4;65：30：5;61：33：6。流速設(shè)置10ml/min，每500ml為1份，共80份。

洗脫液用硅膠H薄層色譜分析，展開(kāi)劑正丁醇：乙酸乙酯：水=4：1：5。10%硫酸乙醇溶液顯色，合并色譜斑點(diǎn)相同組分，減壓回收溶劑。

2結(jié)果

幾種人參皂苷Rd在硅膠H板上的Rf值如表1所示。

表1 幾種人參皂苷Rd在硅膠H板上的Rf值

3討論

目前，三七根莖中已經(jīng)分離出來(lái)的有人參二醇組皂苷、人參三醇組皂苷、七葉膽皂苷和三七皂苷等H。其中，人參二醇組皂苷有Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、F2;人參三醇組皂苷有Re、Rg1、Rg2、Rh1;三七皂苷NR1、NR2、NR4、NR5、Fa、Fc、Fe;七葉膽皂苷GY-XⅧ。從粗皂苷中分離Rd主要應(yīng)用經(jīng)典逐層分析法和高效液相譜分析法，其中，經(jīng)典逐層分析法所需要的時(shí)間長(zhǎng)，操作復(fù)雜程度高，需要多次過(guò)柱才能獲得，而高效液相譜分析法往往需要耗費(fèi)大量的溶劑，成本也大幅度提高，且難以大量進(jìn)行制備，只是使用在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行少量制備。分組分離的方式是近幾年采用的一種Rd制備方式，具有分離步驟相對(duì)精簡(jiǎn)，制備的時(shí)間縮短，為Rd的批量制備提供了可能。

三七藥材中的Rbl、Rgl的含量比較高，而Re、NR1、GY-XⅦ均與Rd的含量和色譜行為十分接近。本次研究應(yīng)用了兩種不同的溶劑體系“氯仿、甲醇、乙酸乙酯、水”和“正丁醇、乙酸乙酯、水”，分離Re、NR1與Rd。而用反相C18柱進(jìn)行“甲醇、水”梯度洗脫，經(jīng)過(guò)1次過(guò)柱就能夠去除Re、NR1和Rg1，但是反相C18填料成本較高，因而選用了成本相對(duì)低的硅膠薄層板進(jìn)行，展開(kāi)劑為“氯仿、甲醇、水”和“正丁醇、乙酸乙酯、水”。研究其色譜行為。根據(jù)表1的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)展開(kāi)劑為“氯仿、甲醇、水”時(shí)，Rd與NR1的Rf值相同。展開(kāi)劑為“正丁醇、乙酸乙酯、水”時(shí)，Re與NR1的Rf值相同。采用“正丁醇、乙酸乙酯、水”為流動(dòng)相，能分離Rd和其他幾種皂苷，但該流動(dòng)相難易揮發(fā)，洗脫液的濃縮難度大。采用“氯仿、甲醇、水”為流動(dòng)相，可與Re分離，分組分離后應(yīng)用梯度分離，可讓Rd和NR1與其他皂苷分離出來(lái)。

總而言之，大孔吸附樹(shù)脂乙醇水溶液能成功分離三七總皂苷中的人參二醇組皂苷與人參三醇組皂苷，將人參二醇組皂苷用硅膠柱“氯仿、甲醇、水”溶劑進(jìn)行梯度洗脫，一次過(guò)柱可得到高純度的Rd單位。且操作簡(jiǎn)單，快捷，能夠批量分離提取。