超高液相色譜法測定三七中三七總皂苷的方法研究

鄧傳江+高鐵燕+楊勇+孫楠+洪梅+余壘柱

[摘 要]目的：建立用超高效液相色譜法測定三七中人參皂苷Rg1、Rb1、Rb3與三七皂苷R1的方法，以進一步探討超高效液相色譜法用于控制三七質(zhì)量的可行性。方法：色譜柱為UPLC BEHC18（2.1mm×50mm，1.7μm）；流動相為A相（乙腈）-B相（水溶液），梯度洗脫程序為：

0min（20：80）-0.4min（30：70）-1.0min（40：60）-1.5min（30：70）-2.5min（20：80）；流速為0.4 ml/min；檢測波長為203nm。結(jié)果：本法專屬性強、靈敏度高、準(zhǔn)確性好，四種皂苷的線性范圍寬，R值均大于0.999，方法學(xué)總回收率為99.88% ，RSD為0.44%（n=3）。結(jié)論：方法簡便，快速，準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，可用于三七藥材中三七總皂苷的含量測定。

[關(guān)鍵詞]超高效液相色譜法；三七；人參皂苷Rg1 、Rb1、Rb3；三七皂苷R1

中圖分類號：TS580 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：1009-914X（2016）25-0113-02

[Abstract]OBJECTIVE To determine total notoginseng glycosides in notoginseng by UPLC for quality contro1， further explore the quality control of notoginseng by ultra-high performance liquid chromatography. METHODS An UPLC BEH C18 （2.1mm×50mm，1.7μm） column was used with a mobile phase consisted of phase A（Acetonitrile）-phase B （Secondary ultrapure water） in gradient elution 0min（20：80）-0.4min（30：70）-1.0min（40：60）-1.5min（30：70）-2.5min（20：80）by flow rate of 0.4mL·min-1 in this method，and UV detector was set at 203nm. RESULTS The linear range of three glycosides were all wide（r>0.999）.The range of recovery of total notoginseng glycosides in notoginseng was 99.88% （RSD=0.44%）（n=3）.CONCLUSIONS The method developed is rate，simple，rapid and reproducible，Which can be applied for the quality control of notoginseng tablets.

[Key words]UPLC； notoginseng； ginsenosidesRg1， Rb1， Rb3； notoginsenoside R1。

三七是云南道地特產(chǎn)中藥材，來源于五加科人參屬植物Panax notoginseng-（Burk. ） F. H. Chen 的干燥根，有散瘀止血，消腫定痛之功效。用于咯血，吐血，便血，崩漏，外傷出血，胸腹刺痛，跌打腫痛等，主產(chǎn)于云南省文山州。三七主要含有皂苷、多糖、氨基酸等多種化學(xué)成分。三七總皂苷含有人參皂苷Rb1，Rb2，Rc，Rd，Re，Rf，Rg1，Rg2，Rh1 和三七皂苷R1，R2，R3，R4，R6 等20 余種皂苷成分。其中人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1，是三七總皂苷中含量最高的兩個成分，而三七皂苷R1則是三七總皂苷的特征化合物，但含量較低。三七總皂苷的測定方法主要有：HPLC法、比色法、薄層掃描法等。但目前采用超高液相測定三七中的三七總皂苷的方法尚未報道。本文重點就采用超高液相測定三七總皂苷的檢測和分析方法進行全面的綜述。

1 儀器與試劑

Waters Acquity型超高效液相色譜儀（配置：紫外檢測器、帶脫氣四元泵、自動進樣器）。色譜純乙腈，色譜純甲醇，超純水（自制）。三七皂苷R1，人參皂苷Rg1、Rb1、Rb3對照品（北京上立方聯(lián)合化工技術(shù)研究院），三七粉、三七主根粉、三七花粉、三七剪口粉、三七莖葉粉（自購）。

2 實驗方法

2.1 色譜分析條件：ACQUITY UPLC BEH Cl8 1.7μm（2.1×50 mm）；流動相：A相（乙腈）一B相（水溶液），梯度洗脫程序為：0min（20：80） -0.4min（30：70）- 1.0min（40：60）-1.5min（30：70）-2.5min（20：80）；流速為0.4 ml/min；檢測波長為203nm；進樣量：4μL，外標(biāo)法定量。

2.2 測定方法

2.2.1 對照品混合溶液的制備 分別精密稱取對照品人參皂苷Rg1、Rb1、Rb3 ，及三七皂苷R1各10.0mg置10mL量瓶中，加甲醇-水（70：30）溶液使溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成濃度為1mg/mL 的對照品混合儲備液；精密吸取2.0mL置100 mL容量瓶中，加甲醇-水（70：30）溶液稀釋至刻度，搖勻，制成對照品混合溶液，作為對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 三七除去泥土洗凈后，晾干，粉碎，過100目篩.取細粉。精密稱取本品細粉（三七粉、三七主根粉、三七剪口粉約2g，三七花粉約4g、三七莖葉粉約8g）置50 ml 具塞離心管中，加入甲醇15mL，密塞，搖勻，超聲30 min后；置于離心機上10000ran/min離心30min。上清液置于50.0 ml比色管中。按上述操作重復(fù)超聲、離心兩次后，用甲醇定容，搖勻，取樣液，經(jīng)O.2μm 濾頭過濾，取濾液，即得供試品溶液。

2.2.3 測定方法 分別取對照品混合溶液及供試品溶液于樣品瓶中經(jīng)自動進樣器吸取4μL樣液注入超高液相色譜儀，記錄色譜圖，以對照品混合溶液色譜圖中三七皂苷R1 、人參皂苷Rg1 、Rb1、Rb3 的峰面積外標(biāo)法計算三七中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Rb1、Rb3的含量。

2.3 穩(wěn)定性試驗 日內(nèi)精密度取同一批供試樣品，在同一天時間里，分別于2、4、6、8、10、24h進行含量測定，計算三七總皂苷含量，進行精密度分析，結(jié)果顯示平均含量為100.57%，RSD為1.26%。表明該方法測定含量日內(nèi)精密度良好。中間精密度取供試樣品，在連續(xù)5d時間里，分別每天取樣進行含量測定，計算三七總皂苷含量，進行精密度分析，結(jié)果顯示平均含量為100.8% ，RSD為1.35%。表明該方法測定含量精密度良好。

2.4 線性關(guān)系考察 分別精密稱取對照品人參皂苷Rg1、Rb1、Rb3 ，及三七皂苷R1各10.0mg置10mL量瓶中，加甲醇-水（70：30）溶液使溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成濃度為1mg/mL 的對照品溶液。用移液器分別吸取上述對照品溶液10.0、20.0、50.0、100.0、200.0μL加甲醇-水（70：30）溶液稀釋至1.0mL，搖勻；制成人參皂苷Rg1、Rb1、Rb3 ，及三七皂苷R1的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ號系列濃度溶液；分別?、瘛ⅱ?、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ號溶液于樣品瓶中經(jīng)自動進樣器吸取4μL樣液注入超液相色譜儀測定；記錄峰面積，并以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），濃度為橫坐標(biāo)（X）進行線性回歸，結(jié)果見表l。

2.5 回收率試驗 精密稱取已知含量的樣品，精密加入三七皂苷R1和人參皂苷Rg1、Rbl、Rb3對照品各2mg，按照“2.2.2”供試品溶液的制備方法進行處理得供試品溶液，測定每份樣品的含量，分別計算回收率，結(jié)果見表2。

2.6 重復(fù)性試驗 取同一批次樣品共6份按照供試品溶液的制備方法制備三七樣品溶液，上機測定并分別計算人參皂苷及三七皂苷的含量，結(jié)果顯示人參皂苷Rg1、Rb1、Rb3和三七皂苷R1含量的RSD分別為0.84%、0.92%、0.87%、0.58% ，三七中各皂苷峰面積積分值變化不大。表明該方法測定含量重現(xiàn)性良好。

3 結(jié)果與討論

3.1 結(jié)果 通過對三七中4種主要有效成分三七皂苷Rl以及人參皂苷Rg1、Rbl、Rb3含量的測定，發(fā)現(xiàn)不同規(guī)格的三七上述4種皂苷的含量相差較大，相同規(guī)格三七的不同部位上述4種皂苷的含量也存在差異，采用超高效液相色譜法同時測定上述4種皂苷的含量，分離效能高、重現(xiàn)性好、精密度良好、結(jié)果準(zhǔn)確可靠、分析時間短。

3.2 討論 本文對提取方法進行了優(yōu)化選擇并與GB/T 19086-2008《地理標(biāo)志產(chǎn)品 文山三七》中的提取方法進行比較，結(jié)果表明本實驗采用的方法，操作過程中三七樣液的三七總皂苷損失更少；同時本實驗采用梯度洗脫，整個分析過程在2min內(nèi)完成，進樣間隔2-3min即可達到平衡，大大的縮短了檢測分析時間。

4 結(jié)論

本文所建立的梯度洗脫超高液相色譜法，分離效能高、重現(xiàn)性好、精密度良好、結(jié)果準(zhǔn)確可靠、分析時間短為檢測三七及其三七制品中的三七總皂苷的含量提供了一定的依據(jù)和參考。

參考文獻：

[1] GB/T 19086-2008《地理標(biāo)志產(chǎn)品 文山三七》

[2] 中華人民共和國國家藥典委員會.中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·中藥成方制劑（第十九冊）[S].北京：人民衛(wèi)生出版社.2003.98—99.

[3] 沈國芳，吳永江，程翼宇，等.RP—HPLC測定血栓通注射液中4種皂苷的含量.中國藥學(xué)雜志，2003，38（9）

[4] 周迎春，趙懷清，梁寧，等.高效液相色譜法同時測定三七總皂苷中人參皂苷Rg1，Re，Rb1與三七皂苷R1含量[J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報，2003，20（1）：2727.

[5] 王梅，范亞剛.RP—HPLC梯度洗脫法同時測定三七總皂苷及血塞通注射液中三種皂苷含量[J].藥物分析雜志，2000，20

[6] 楊雪梅， 劉旭 ，劉艷山， 荀旦 ，徐江平等. 高效液相色譜法測定三七中三七皂苷R1及人參皂苷Rg1、Rb3的含量.首席醫(yī)學(xué)網(wǎng)

[7]張小平，徐世杰. 梯度洗脫高效液相色譜法測定三七片中三七總皂苷的含量. 中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)雜志2006年6月第23卷第3期

[8]馮亮，蔣學(xué)華 ，葉利民. 三七總皂苷中各組分含量測定方法的改進. 華西藥學(xué)雜志2006，21（2）：187—18.