miRNA表達(dá)水平對缺血性腦卒中作用機(jī)制的研究進(jìn)展

張欽政 鄭洋洋 李琪 陳宏娟 閆本純 馬潤瑤 張晗 閆海潤

[摘要] 缺血性腦卒中（IS）發(fā)病率具有增高的趨勢，目前缺乏診斷IS敏感的特異性生物學(xué)標(biāo)志物。miRNA因其組織特異性強(qiáng)、易于放大信號通路、平均半衰期較長、能夠反復(fù)凍融等優(yōu)點，故其作為生物標(biāo)志物已成為診斷IS的研究熱點。本文綜述了在IS中對細(xì)胞具有保護(hù)與損傷作用的miRNA及其作用機(jī)制，并且討論了對于IS具有潛在診斷價值的miRNA，以及有助于確定IS分期的miRNA，以期為IS的研究、臨床診斷及治療提供新思路、新靶點。

[關(guān)鍵詞] miRNA;缺血性腦卒中;生物標(biāo)志物;分子機(jī)制

[中圖分類號] R743.3? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2020）02-0189-04

Research progress on action mechanism of miRNA expression levels on ischemic stroke

ZHANG Qinzheng1? ZHENG Yangyang1? ?LI Qi1? ?CHEN Hongjuan1? ?YAN Benchun2? ?MA Runyao1? ?ZHANG Han1? YAN Hairun1

1.Department of Laboratory， Hongqi Hospital Affiliated to Mudanjiang Medical College， Mudanjiang? ?157011， China; 2.Department of Urinary Surgery， Hongqi Hospital Affiliated to Mudanjiang Medical College， Mudanjiang? ?157011， China

[Abstract] The incidence of ischemic stroke （IS） is increasing， but currently there is no sensitive specific biomarkers for the diagnosis of IS. MiRNAs have become a research hotspot in the diagnosis of IS because of their strong tissue specificity， easy amplification of signal pathways， long average half-life， and ability of repeated freezing and thawing. This article reviews the miRNAs that protect and damage cells in IS and their mechanism of action， discusses the miRNAs with potential diagnostic value for IS as well as the miRNAs that help determine the IS stage in order to provide new ideas and new targets for the study， clinical diagnosis and treatment of IS.

[Key words] MiRNA; Ischemic stroke; Biomarker; Molecular mechanism

腦卒中（Stroke）又稱中風(fēng)，已成為世界范圍的第二死亡疾病和第三致殘疾病[1]。其中，缺血性腦卒中（Ischemic stroke，IS）約占其80%。臨床上，診斷IS主要依賴于臨床癥狀表現(xiàn)和影像學(xué)檢查。目前尚無準(zhǔn)確診斷急性缺血性腦卒中（Acute ischemic stroke，AIS）的生物標(biāo)志物。因此，從分子生物學(xué)角度對IS的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行深入研究，積極探索有效的生物標(biāo)志物具有重大的臨床價值。

miRNA（micro RNA）是一類由20～25個核苷酸組成的內(nèi)源性非編碼單鏈小RNA分子，通過完全或不完全堿基互補配對原則與特定靶基因信使RNA（mRNA）的3-非翻譯區(qū)（3-UTR）或5-UTR，抑制mRNA翻譯或直接降解其特定mRNA，在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控和生物體正常發(fā)育中發(fā)揮重要作用。miRNA作為蛋白表達(dá)過程中的調(diào)節(jié)物質(zhì)，可較早反映IS患者的生理病理變化。據(jù)研究報道，miRNA是神經(jīng)細(xì)胞生長的調(diào)節(jié)因子，并參與神經(jīng)功能調(diào)節(jié)。部分miRNA對于IS患者或小鼠的神經(jīng)細(xì)胞等存在保護(hù)或損傷作用，探索其保護(hù)或損傷作用機(jī)制對于IS診斷和評估預(yù)后具有重要意義，甚至可以根據(jù)不同機(jī)制而確定不同治療靶點，為IS的治療提供新方向。

1 miRNA參與細(xì)胞保護(hù)作用

1.1 通過調(diào)控靶基因Caspase 3

Ni J等[2]研究發(fā)現(xiàn)，在IS患者和實驗動物的血漿及大腦中，miR-let-7c-5p的含量顯著降低。Caspase 3是受miR-let-7c-5p調(diào)控的靶基因，誘導(dǎo)miR-let-7c-5p過度表達(dá)通過抑制中風(fēng)后小膠質(zhì)細(xì)胞激活以保護(hù)大腦免受缺血損傷，這一過程可能是通過參與Caspase 3表達(dá)調(diào)控機(jī)制實現(xiàn)的。誘導(dǎo)miR-let-7c-5p過度表達(dá)可能是治療IS的一個新方法，值得進(jìn)一步探討。miR-let-7c-5p是miRNA let-7c家族成員。但有研究表明，miRNA let-7c可促進(jìn)ox-LDL誘導(dǎo)的人內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，提示miRNA let-7c具有促進(jìn)動脈硬化作用[3]。

1.2 通過調(diào)控腦血管內(nèi)皮細(xì)胞整合素αvβ3

梁國安等[4]研究發(fā)現(xiàn)，缺血缺氧性腦損傷可誘導(dǎo)miR-210表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)腦組織血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）表達(dá)和血管再生，從而發(fā)揮內(nèi)源性腦保護(hù)機(jī)制。Zhang H等[5]研究表明，以RGD-exo作為靶向載體，通過NIRF成像和免疫熒光證實RGD-exo：miR-210的靶向性，短暫大腦中動脈閉塞（MCAO）小鼠模型靜脈給藥后，RGD-exo：miR-210與缺血區(qū)反應(yīng)性腦血管內(nèi)皮細(xì)胞整合素αvβ3 結(jié)合，致使缺血部位miR-210增加，從而減弱中風(fēng)癥狀。關(guān)于miR-210的機(jī)制尚不完全明確，仍存在爭議。Huang L等[6]研究認(rèn)為，miR-210的抑制顯著降低TNF-α，IL-1β，IL-6，CCL2和CCL3的表達(dá)，而對TGF-β和IL-10沒有顯著影響，因此可以抑制IS急性期的促炎反應(yīng)和減少腦損傷。已報道m(xù)iR-210有20多種直接靶標(biāo)，而miR-210對IS調(diào)節(jié)的最終結(jié)果可能取決于多種靶基因作用的平衡和整合。

1.3 通過調(diào)控炎性因子TNF-α、IL-1β及AKT和ERK信號通路

脂肪干細(xì)胞（ADSCs）療法是治療中風(fēng)有前景的方法，ADSCs是外泌體的重要來源，且外泌體中多為miRNA。Geng W等[7]首次證實miR-126在AIS患者血漿和缺血后大鼠血漿以及腦組織中下調(diào)。為了明確miR-126的作用，通過過表達(dá)或敲低技術(shù)來上調(diào)或下調(diào)ADSCs中miR-126的表達(dá)，從而分別獲得miR-126+和miR-126-。ADSCs衍生外泌體可導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡減低和細(xì)胞增殖，miR-126+進(jìn)一步增強(qiáng)這一結(jié)果，而miR-126-則相反。通過免疫熒光分析Bv2細(xì)胞的活化，揭示miR-126+ 在治療MCAO大鼠中的潛在功能。相比miR-126-，miR-126+更能抑制Bv2細(xì)胞活化。采用ELISA法監(jiān)測腦組織中TNF-α和IL-1β表達(dá)，顯示miR-126+相比miR-126-更顯著抑制TNF-α和IL-1β產(chǎn)生，表明miR-126在MCAO大鼠外源性調(diào)節(jié)的神經(jīng)炎癥中起重要作用。為進(jìn)一步驗證miR-126+對TNF-α和IL-1β分泌的影響，研究者構(gòu)建了氧和葡萄糖剝奪（OGD）模型，miR-126+和miR-126-處理Bv2細(xì)胞，結(jié)果與上述相同。Pan Q等[8]研究發(fā)現(xiàn)，miR-126在內(nèi)皮細(xì)胞（ECs）和內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）中高表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞增殖和遷移，保證血管完整。

Luo Q等[9]研究表明，來自ADSCs的miR-126過表達(dá)在緩解急性心肌缺血性損傷中具有治療意義。Qu M等[10]研究發(fā)現(xiàn)，miR-126可通過抑制其靶標(biāo)酪氨酸磷酸酶非受體9型（PTPN9）以及激活A(yù)KT和ERK信號通路減少腦萎縮體積并改善缺血小鼠神經(jīng)功能。miR-126具有兩條鏈：miR-126-3p和miR-126-5p，兩者過表達(dá)均促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）增殖、缺血性小鼠腦血管生成及神經(jīng)生長，并進(jìn)一步改善神經(jīng)功能。Zheng T等[11]研究發(fā)現(xiàn)，miR-130a可通過PTEN/PI3K/AKT途徑對IS發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

1.4 通過調(diào)控MAPK途徑

研究表明，MAPK信號傳導(dǎo)可影響血腦屏障（BBB）的完整性[12]，增強(qiáng)IS后神經(jīng)細(xì)胞炎癥小體活化，對神經(jīng)細(xì)胞增殖、適應(yīng)和分化具有重要作用，對于腦缺血期間炎癥和細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)至關(guān)重要。盡管有許多關(guān)于miR-145和MAPK途徑在腦血管疾病或中風(fēng)中的作用研究，但尚未研究在IS中miR-145與MAPK信號傳導(dǎo)途徑之間的關(guān)聯(lián)。Xue WS等[13]研究，通過靶向MAPK途徑治療IS，探索miR-145在神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs）功能中的作用。miR-145的過表達(dá)促進(jìn)了NSCs中MAPK通路的相關(guān)mRNA和蛋白的表達(dá)，而miR-145的表達(dá)下調(diào)抑制了MAPK通路。miR-145在NSCs中的過表達(dá)促進(jìn)了G1/S-特異性周期蛋白-D1（Cyclin D1）、巢蛋白（Nestin）、神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）和膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）蛋白上調(diào)，增強(qiáng)了NSCs活性，促進(jìn)細(xì)胞增殖和分化，同時抑制Cleaved-caspase 3表達(dá)和細(xì)胞凋亡。miR-145通過靶向MAPK途徑在大鼠IS治療中保護(hù)NSCs的功能，對IS治療進(jìn)展具有重要意義。侯麗淳等[14-15]預(yù)測miR-145為編碼CD40的靶基因，miR-145在IS患者血清中表達(dá)水平上調(diào)，其過表達(dá)將抑制CD40基因表達(dá)從而減少血管內(nèi)炎癥因子釋放。Dong H等[16]研究發(fā)現(xiàn)，miR-22也可通過MAPK途徑減輕IS大鼠炎癥。

1.5 通過調(diào)控AMPK活性

AMP依賴蛋白激酶（AMPK）在IS中的作用仍然存在爭議，對于神經(jīng)元新生可能具有雙重作用。Wang Z等[17]研究認(rèn)為，miR-27b直接靶向AMPK，影響其表達(dá)。在小鼠模型中，miR-27b抑制劑（miR-27b antagomir）顯著增強(qiáng)行為功能恢復(fù)和空間記憶能力，并通過調(diào)節(jié)AMPK活性促進(jìn)IS恢復(fù)。

2 miRNA參與細(xì)胞損傷作用

2.1 通過調(diào)控Bcl-2和Bcl-w

Yin KJ等[18]研究表明，miR-497是一種促凋亡調(diào)節(jié)因子，在缺血性神經(jīng)細(xì)胞死亡調(diào)控中起關(guān)鍵作用。在Bcl-2和Bcl-w的3-UTR上有miR-497的結(jié)合位點，miR-497過表達(dá)通過抑制抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-w促進(jìn)缺血性神經(jīng)細(xì)胞死亡。Chen X等[19]研究發(fā)現(xiàn)miR-497通過抑制Bcl-2和微管相關(guān)蛋白1A/1B-輕鏈3（LC3）加劇梗死面積和神經(jīng)功能損傷，且LC3在神經(jīng)元自噬過程中至關(guān)重要。miR-497激動劑（miR-497 agomir）僅抑制線粒體靶向Bcl-2表達(dá)，而不是ER靶向的Bcl-2。在大腦缺血發(fā)生后，miR-497明顯增加，對神經(jīng)細(xì)胞死亡調(diào)控具有關(guān)鍵作用。

另有研究認(rèn)為[20]，在IS小鼠模型中，miR-15a/16-1表達(dá)增加，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-w，促進(jìn)炎癥反應(yīng)加重腦損傷。小鼠尾靜脈注射miR-15a/16-1 antagomir抑制miR-15a/16-1活性，顯著降低IL-6、MCP-1、VCAM-1、TNF-α的表達(dá)，增加Bcl-2和Bcl-w的表達(dá)，從而減小腦梗死體積，并改善IS小鼠神經(jīng)功能。之前研究發(fā)現(xiàn)，OGD誘導(dǎo)的miR-15a表達(dá)上調(diào)可升高小鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞（CEC）。在體外，miR-15a功能喪失可導(dǎo)致Caspase-3活性增強(qiáng)，高爾基體片段減少。提示miR-15a的高表達(dá)抑制Bcl-2，并在OGD誘導(dǎo)的CEC凋亡中起負(fù)作用。

2.2 通過調(diào)控Nrf2和HO-1表達(dá)

Ma Q等[21]采用實時PCR技術(shù)檢測在發(fā)病6 h內(nèi)AIS患者血漿和中性粒細(xì)胞中的miR-93水平降低，在體外治療中miR-93 agomir通過誘導(dǎo)Bv2細(xì)胞周期G1期停滯抑制OGD誘導(dǎo)的Bv2細(xì)胞增殖。Wang P等[22]研究認(rèn)為，miR-93可直接結(jié)合在核因子紅細(xì)胞相關(guān)因子2（Nrf2）的3-UTR靶點，然后減弱Nrf2和血紅素加氧酶-1（HO-1）表達(dá)。Nrf2/HO-1通路是一種重要防御機(jī)制，可抵抗缺血/再灌注后有誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而miR-93可加重腦缺血損傷。

2.3 通過調(diào)控靶基因Mcl-1

miR-106b-5p對IS神經(jīng)功能影響等具有負(fù)相關(guān)關(guān)系。Li P等[23]認(rèn)為miR-106b-5p上調(diào)是腦缺血損傷的重要原因，繼續(xù)探索了miR-106b-5p中風(fēng)的分子機(jī)制，在MCAO大鼠腦內(nèi)Bax表達(dá)上調(diào)，Bcl-2表達(dá)下調(diào)。采用熒光素酶報告基因?qū)嶒灉y定證明Mcl-1是miR-106b-5p的靶基因，Mcl-1是Bcl-2家族的抗凋亡成員。miR-106b-5p antagomir顯著降低丙二醛（MDA），恢復(fù)超氧化物歧化酶（SOD）活性，增加Mcl-1表達(dá)，并減少Bax表達(dá)，從而減少梗死體積，降低神經(jīng)細(xì)胞損傷，改善神經(jīng)功能。miR-106b-5p antagomir的研究對于未來治療IS具有臨床意義。

3 展望

miRNA具有組織特異性強(qiáng)，信號通路易放大，平均半衰期較長，可反復(fù)凍融等優(yōu)點，已成為多種疾病的新型生物標(biāo)志物。但尚無miRNA作為IS診斷標(biāo)志物應(yīng)用于臨床，需進(jìn)一步研究。Ma Q等[21]評估m(xù)iR-93在IS發(fā)病后6 h內(nèi)診斷和預(yù)測潛力，發(fā)現(xiàn)血漿和中性粒細(xì)胞中的miR-93是診斷AIS潛在生物標(biāo)志物，首次為miR-93在AIS中的診斷價值提供證據(jù)，且中性粒細(xì)胞中的miR-93水平為AIS患者潛在預(yù)后生物標(biāo)志物。李東斌等[24]研究顯示，血漿外泌體源性miR-422a對于IS早期（發(fā)病1-3d）具有極高的診斷價值。Li DB等[25]研究認(rèn)為，聯(lián)合檢測miR-422a和miR-125b-2-3p表達(dá)水平有利于確定IS的進(jìn)展階段。

近年來，對于IS的研究進(jìn)展已取得較大進(jìn)步，IS發(fā)生后短時間內(nèi)可以在體液中檢測到miRNA表達(dá)水平上調(diào)或下調(diào)，檢測其表達(dá)水平變化對神經(jīng)細(xì)胞及功能的影響，有助于對IS進(jìn)行診斷和預(yù)后監(jiān)測。但目前部分miRNA對于IS的發(fā)病意義還存在爭議，這可能與發(fā)病機(jī)制不同、檢測樣本量小等原因有關(guān)，需要進(jìn)一步研究。隨著對miRNA研究的深入，檢測miRNA對IS的分期、分類具有指導(dǎo)作用，對于早期干預(yù)IS進(jìn)展也具有重要臨床價值，且有望成為IS早期診斷和評估預(yù)后的新型標(biāo)志物和治療新靶點，發(fā)展前景廣闊。

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（收稿日期：2019-07-17）