甲狀腺乳頭狀癌Ki-67、BRAF、Galectin-3的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關系

許健 張頌 章遠江 金科

[摘要] 目的 探討甲狀腺乳頭狀癌Ki-67、BRAF、Galectin-3的表達與中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關系。 方法 將168例甲狀腺乳頭狀癌根據(jù)中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況分為淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移組（n=76）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移1個組（n=40）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移≥2個組（n=52），采用免疫組化法檢測Ki-67、BRAF、Galectin-3在各組中的表達，并進行比較。 結(jié)果 Ki-67在淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移組中陽性率為51.3%，在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移1個組中為72.5%，在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移≥2個組中為90.4%。Ki-67陽性率在各組間均有統(tǒng)計學差異（χ2=4.8485、21.3767、5.0336，P均<0.05），且隨著淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)的增加，陽性率升高（P<0.05）。BRAF在淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移組中陽性率為42.1%，在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移1個組中為62.5%，在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移≥2個組中為82.7%。BRAF陽性率在各組間均有統(tǒng)計學差異（χ2=4.3616、20.9635、4.7808，P均<0.05），且隨著淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)的增加，陽性率升高（P<0.05）。Galectin-3在淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移組中陽性率為73.7%，在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移1個組中為90.0%，在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移≥2個組中為94.2%。Galectin-3陽性率在淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移各組中均較淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移組中為高（χ2=4.2516、8.8428，P均<0.05），但在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)不同的兩組中無統(tǒng)計學差異（χ2=0.5757，P>0.05）。 結(jié)論 甲狀腺乳頭狀癌Ki-67、BRAF、Galectin-3的表達與中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關，Ki-67、BRAF、Galectin-3高表達者更易出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。故Ki-67、BRAF、Galectin-3可作為預測甲狀腺乳頭狀癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的重要腫瘤標志物。

[關鍵詞] 甲狀腺乳頭狀癌;Ki-67;BRAF;Galectin-3;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移

[中圖分類號] R736.1? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2020）02-0027-04

Relationship between expression of Ki-67，BRAF and Galectin-3 in papillary thyroid carcinoma and lymph node metastasis

XU Jian1? ?ZHANG Song2? ?ZHANG Yuanjiang1? ?JIN Ke1

1.Department of Breast and Thyroid Surgery，No.2 People's Hospital of Changshu City in Jiangsu Province，Changshu 215500，China;2.Changshu Medicine Examination Institute in Jiangsu Province，Changshu? ?215500，China

[Abstract] Objective To investigate the relationship between the expression of Ki-67， BRAF and Galectin-3 in papillary thyroid carcinoma and lymph node metastasis in central region. Methods One hundred and sixty-eight cases of thyroid papillary carcinoma were divided into the lymph node metastasis=0 group（n=76），lymph node metastasis=1 group（n=40） and lymph node metastasis≥2 group（n=52）according to status of central lymph node metastasis. Immunohistochemistry was applied to determine and compare the expression of Ki-67，BRAF， and Galectin-3 in three groups. Results The positive rates of Ki-67 were 51.3% in the lymph node metastasis=0 group，72.5% in the lymph node metastasis=1 group，and 90.4% in the lymph node metastasis≥2 group. The positive rates of Ki-67 were statistically different among the groups（χ2=4.8485，21.3767，5.0336，P<0.05），and the positive rate was increased with the increase of lymph node metastasis（P<0.05）. The positive rates of BRAF were 42.1% in the lymph node metastasis=0 group，62.5% in the lymph node metastasis=1 group， and 82.7% in the lymph node metastasis≥2 group. The positive rates of BRAF were statistically different among the groups（χ2=4.3616，20.9635，4.7808，P<0.05），and the positive rate was increased with the increase of lymph node metastasis（P<0.05）. The positive rates of Galectin-3 were 73.7% in the lymph node metastasis=0 group，90.0% in the lymph node metastasis=1 group，and 94.2% in the lymph node metastasis≥2 group. The positive rates of Galectin-3 were higher in the groups with lymph node metastasis than in the lymph node metastasis=0 group（χ2=4.2516，8.8428，both P<0.05），but there was no statistical difference in the two groups with different number of lymph node metastasis（χ2=0.5757，P>0.05）. Conclusion The expression of Ki-67， BRAF and Galectin-3 in papillary thyroid carcinoma is closely related with lymph node metastasis in central region. Lymph node metastasis is more likely to occur in patients with high expression of Ki-67，BRAF and Galectin-3. Therefore，Ki-67，BRAF，and Galectin-3 can be used as important tumor markers for predicting lymph node metastasis of papillary thyroid carcinoma.

[Key words] Papillary thyroid carcinoma; Ki-67; BRAF; Galectin-3; Lymph node metastasis

甲狀腺癌是臨床常見的惡性腫瘤，乳頭狀癌是甲狀腺癌中最常見的類型，惡性程度不高，但易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，常首先轉(zhuǎn)移至中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)，因此中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況是影響甲狀腺乳頭狀癌預后的重要指標[1]。Ki-67是目前較為肯定的核增殖標志物，與腫瘤細胞的異常增殖關系密切[2]。BRAF與Galectin-3的高表達均預示著腫瘤有較強的侵襲性，與腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移密切相關[3，4]。但甲狀腺乳頭狀癌中Ki-67、BRAF、Galectin-3的表達與淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移是否有關尚未明確。本研究擬通過免疫組化方法，探討甲狀腺乳頭狀癌Ki-67、BRAF、Galectin-3的表達情況與中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關性，從而為預測甲狀腺乳頭狀癌的淋巴轉(zhuǎn)移及預后分析等提供依據(jù)?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年2月～2018年2月我院行中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)清掃的甲狀腺乳頭狀癌患者共168例，其中男52例，女116例，年齡21～82歲，平均（42.1±17.8）歲，病程1 d～12年，術前FT3、FT4、TSH、甲狀腺過氧化物酶抗體（TPOAb）均在正常范圍，術前常規(guī)檢查排除腫瘤有遠處轉(zhuǎn)移或頸側(cè)區(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，手術方式為甲狀腺癌根治術（甲狀腺腺葉切除+中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)清掃），術后病理證實均為甲狀腺乳頭狀癌。腫瘤病灶術后常規(guī)進行免疫組化檢測Ki-67、BRAF、Galectin-3的表達情況，中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)術后常規(guī)病理檢測腫瘤轉(zhuǎn)移情況。所有168例甲狀腺乳頭狀癌病例根據(jù)術后中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)病理檢測腫瘤轉(zhuǎn)移情況分為淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移組（共76例）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移1個組（共40例）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移≥2個組（共52例）。本研究獲得我院倫理委員會批準及患者知情同意。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化主要試劑? 鼠抗人單克隆抗體Ki-67（產(chǎn)品編號：MAB-0672）、兔抗人單克隆抗體BRAF （產(chǎn)品編號：RMA-0839）、鼠抗人單克隆抗體Galectin-3（產(chǎn)品編號：MAB-0783）均購自福州邁新生物技術開發(fā)有限公司。SP檢測試劑盒購自福州邁新生物技術開發(fā)有限公司，產(chǎn)品編號：KIT-9720。DAB顯色試劑盒購自福州邁新生物技術開發(fā)有限公司，產(chǎn)品編號：DAB-4032。

1.2.2 免疫組化檢測方法? 用10%甲醛溶液固定甲狀腺癌標本24 h，然后石蠟包埋，制作4 μm厚連續(xù)切片。免疫組化操作步驟：①石蠟切片60℃烤片60 min，脫蠟、水化，PBS浸泡5 min;②3% H2O2室溫孵育10 min，蒸餾水沖洗，PBS浸泡;③檸檬酸緩沖液微波抗原修復;④正常山羊血清（PBS稀釋至5%）封閉，室溫孵育10 min;⑤分別滴加一抗Ki-67、BRAF、Galectin-3， 37℃孵育1 h，然后PBS沖洗3次;⑥滴加適當比例稀釋的生物素標記的二抗，37℃孵育10 min，PBS沖洗3次;⑦滴加適當比例稀釋的辣根酶標記的鏈霉卵白素工作液，37℃孵育10 min，PBS沖洗3次;⑧顯色劑顯色（DAB），20 min;⑨自來水充分沖洗，蘇木素復染，梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封片。用已知陽性的組織切片作陽性對照，用PBS液代替一抗作陰性對照。

1.3 免疫組化結(jié)果陽性判斷

參考Beesley分級[5]方法，按照陽性細胞所占百分比確定免疫組化結(jié)果陰性或陽性。具體方法為：每張免疫組化切片隨機取4個高倍視野，當細胞質(zhì)和（或）細胞核見到棕黃色顆粒分布為陽性細胞，計算陽性細胞所占百分比，當陽性細胞數(shù)<10%時計為陰性（-），陽性細胞數(shù)≥10%時計為陽性（+）。

1.4 觀察指標

甲狀腺乳頭狀癌術中常規(guī)行中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)清掃，觀察中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)腫瘤轉(zhuǎn)移情況，并根據(jù)淋巴結(jié)腫瘤轉(zhuǎn)移數(shù)目不同分為淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移組、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移1個組、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移≥2個組。采用免疫組化檢測方法觀察甲狀腺乳頭狀癌病灶中Ki-67、BRAF、Galectin-3的表達情況。觀察并分析Ki-67陽性率、BRAF陽性率、Galectin-3陽性率在三組中的高低。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用STATA12.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)處理，計數(shù)資料以[n（%）]表示，采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Ki-67在各組中的表達陽性率比較

Ki-67陽性表達部位位于細胞核，陽性細胞見棕黃色顆粒分布。Ki-67在本組甲狀腺乳頭狀癌中總的陽性率為68.5%，在淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移組中的陽性率為51.3%，在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移1個組中的陽性率為72.5%，在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移≥2個組中的陽性率為90.4%。Ki-67的陽性率在淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移各組中均較淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移組中為高（P<0.05），并且隨著淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目的增加，陽性率升高（P<0.05）。見表1。

2.2 BRAF在各組中的表達陽性率比較

BRAF陽性表達部位位于細胞質(zhì)，陽性細胞見棕黃色顆粒分布。BRAF在本組甲狀腺乳頭狀癌中總的陽性率為59.5%，在淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移組中的陽性率為42.1%，在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移1個組中的陽性率為62.5%，在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移≥2個組中的陽性率為82.7%。BRAF的陽性率在淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移各組中均較淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移各組中為高（P<0.05），并且隨著淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目的增加，陽性率升高（P<0.05）。見表2。

表2? ?BRAF在各組中的表達陽性率比較

注：1）淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移1個組BRAF陽性率與淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移組相比：χ2=4.3616，P=0.037;2）淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移≥2個組BRAF陽性率與淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移組相比：χ2=20.9635，P=0.000;3）淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移≥2個組BRAF陽性率與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移1個組相比：χ2=4.7808，P=0.029

2.3 Galectin-3在各組中的表達陽性率比較

Galectin-3陽性表達部位位于細胞質(zhì)，陽性細胞見棕黃色顆粒分布。Galectin-3在本組甲狀腺乳頭狀癌中總的陽性率為83.9%，在淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移組中的陽性率為73.7%，在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移1個組中的陽性率為90.0%，在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移≥2個組中的陽性率為94.2%。Galectin-3的陽性率在淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移各組中均較淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移組中為高（P<0.05），但在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目不同的兩組中無統(tǒng)計學差異（P>0.05）。見表3。

表3? ?Galectin-3在各組中的表達陽性率比較

注：1）淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移1個組Galectin-3陽性率與淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移組相比：χ2=4.2516，P=0.039;2）淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移≥2個組Galectin-3陽性率與淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移組相比：χ2=8.8428，P=0.003;3）淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移≥2個組Galectin-3陽性率與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移1個組相比：χ2=0.5757，P=0.448

3 討論

異常增殖與轉(zhuǎn)移復發(fā)是惡性腫瘤的特征，甲狀腺乳頭狀癌是臨床常見腫瘤，一般預后較好，但易出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。甲狀腺乳頭狀癌的成功治療主要依賴早期診斷、合適的手術和術后相關治療。研究表明，明確腫瘤的生物學信息，對于惡性腫瘤的診斷、治療和預后判斷有著極為重要的意義[6，7]。

Ki-67抗原最早是1983年由德國學者Gerdes在霍奇金淋巴瘤源性細胞系中使用鼠單克隆抗體抗核抗原的研究中發(fā)現(xiàn)，隨后以Gerdes所在學校名稱Kiel University命名，其在細胞周期的G1期開始表達，在S期和G2期表達增加，在M期達到高峰，有絲分裂結(jié)束后迅速降解，且不表達于DNA修復狀態(tài)的細胞，是目前較為肯定的核增殖標記物，被認為是較理想的代表細胞增殖活性的抗原[8，9]。Ki-67蛋白的表達可反映腫瘤細胞活性，與惡性腫瘤的發(fā)展、轉(zhuǎn)移和預后高度相關[10]。中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)是甲狀腺淋巴引流的第一站，是甲狀腺乳頭狀癌最易轉(zhuǎn)移的部位，甲狀腺癌根治術一般都要清掃中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)，因此中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況便成為甲狀腺乳頭狀癌治療及預后判斷最重要的指標之一，但甲狀腺乳頭狀癌中Ki-67的表達與中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是否有關尚未明確。本研究結(jié)果顯示，甲狀腺乳頭狀癌Ki-67表達水平與中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況密切相關（P<0.05），Ki-67的陽性率隨著淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目的增加而升高（P<0.05）。分析其中原因，認為腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是與腫瘤細胞的增殖活性密切相關的，Ki-67是與細胞增殖相關的核抗原，故Ki-67高表達者腫瘤細胞增殖快，惡性度高，更易出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

BRAF又名鼠類肉瘤濾過性毒菌致癌同源體B1，是RAF基因家族的成員之一，位于人染色體7q34，BRAF是RET和RAS的下游蛋白激酶。BRAF是目前研究較熱的癌基因，BRAF在甲狀腺乳頭狀癌中表達率達50%，但在甲狀腺良性腫瘤中不表達[11，12]，這與本實驗結(jié)果BRAF陽性率59.5%相比稍低。有研究報道在腸癌中BRAF高表達的腫瘤細胞侵襲力強，容易浸潤周圍組織，臨床病理分期高[13]。與之相似，BRAF在甲狀腺乳頭狀癌的生長、浸潤和轉(zhuǎn)移過程中也可能發(fā)揮著重要作用。由本研究可知，BRAF陽性率在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移1個組、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移≥2個組中分別為42.1%、62.5%、82.7%，隨著淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)的增加，BRAF陽性率升高（P<0.05）。因此，BRAF高表達的甲狀腺乳頭狀癌確實預示著更高的侵襲性，更易出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

腫瘤細胞的黏附性在侵襲和轉(zhuǎn)移中起著極為重要的作用。分子水平的研究顯示，Galectin-3與腫瘤分化、侵襲能力密切相關[14]。Galectin-3中文名半乳糖凝素3，是一個31 kD的β半乳糖蛋白，屬于植物血凝素家族，位于染色體1p13，是一種細胞凝集素，主要與細胞內(nèi)的糖蛋白、細胞表面分子和胞外基質(zhì)蛋白作用，可調(diào)節(jié)腫瘤細胞增殖、黏附、侵襲和凋亡[15]。有報道甲狀腺乳頭狀癌中存在強且彌漫性的Galectin-3免疫組化染色，良性甲狀腺結(jié)節(jié)Galectin-3表達很低，而正常甲狀腺組織未檢測到Galectin-3的表達[16，17]，這與本研究中甲狀腺乳頭狀癌Galectin-3總的陽性率高達83.9%是一致的。Galectin-3高表達的腫瘤細胞往往預示著更高的侵襲性，易發(fā)生轉(zhuǎn)移。由本研究可知，Galectin-3的陽性率在淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移的兩組中均較淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移組中為高（P<0.05），但在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目不同的兩組中并無統(tǒng)計學差異（P>0.05）。分析產(chǎn)生這一結(jié)果的原因可能是：①甲狀腺乳頭狀癌中Galectin-3的表達增多，分布于整個細胞表面，增強了腫瘤細胞與基底膜和基質(zhì)的黏附，促進腫瘤細胞向基底膜和基質(zhì)浸潤，使腫瘤細胞的遷徙能力增強，故更易出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移;②本研究中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目不同的兩組中Galectin-3的陽性率并無統(tǒng)計學差異（P>0.05），這可能與樣本量較少有關，需進一步擴大樣本量并從基因水平進行研究。

綜上所述，甲狀腺乳頭狀癌Ki-67、BRAF、Galectin-3的表達情況與中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關。甲狀腺乳頭狀癌Ki-67、BRAF、Galectin-3高表達者更易出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，腫瘤細胞惡性程度更高，術后更易出現(xiàn)復發(fā)轉(zhuǎn)移，因此這類甲狀腺乳頭狀癌患者在術后的激素抑制治療中TSH應該控制在更低的水平，從而降低腫瘤的復發(fā)幾率，且應該更加密切的隨訪復查，一旦發(fā)現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移復發(fā)可及時治療。因此，在甲狀腺乳頭狀癌的臨床診治中，檢測Ki-67、BRAF、Galectin-3有助于了解腫瘤的轉(zhuǎn)移傾向，評估腫瘤的生物學行為及預后，對指導治療和提高療效有重要意義。

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（收稿日期：2019-09-19）