西維來司鈉對(duì)創(chuàng)傷失血性休克復(fù)蘇后大鼠的保護(hù)作用及可能機(jī)制▲

王 艷 宗 媛 牛 丹 董道然 王會(huì)東

(1 陜西省人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，西安市 710068，電子郵箱annie1999@qq.com；2 陜西省西安市第一醫(yī)院麻醉科，西安市 710002)

創(chuàng)傷失血性休克(traumatic hemorrhagic shock,THS)是臨床上常見的具有高死亡率的疾病，仍是重癥醫(yī)學(xué)領(lǐng)域急需攻克的難題之一。THS的病理生理變化是由創(chuàng)傷及失血造成機(jī)體有效循環(huán)血量減少、微循環(huán)障礙、細(xì)胞氧代謝紊亂、凝血障礙及繼發(fā)性器官功能損害引起[1]。其中，中性粒細(xì)胞直接參與形成毛細(xì)血管“無復(fù)流”現(xiàn)象、失控的“瀑布樣”級(jí)聯(lián)性炎性反應(yīng)、凝血功能障礙，以及細(xì)胞氧代謝失衡[1]。中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(neutrophil elastase，NE) 是中性粒細(xì)胞釋放的一種蛋白酶，在機(jī)體炎性反應(yīng)的病理過程中起到重要作用，中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶抑制劑(neutrophil elastase inhibitor，NEI)已被證實(shí)可通過對(duì)彈性蛋白酶的選擇性抑制作用，在急性呼吸窘迫綜合征、急性胰腺炎、創(chuàng)傷性腦病、心肌缺血再灌注損傷、膿毒癥、爆震傷等疾病中起到保護(hù)作用[2-7]。本研究觀察NEI西維來司鈉對(duì)THS大鼠復(fù)蘇后器官功能及炎性因子水平的影響，探討其對(duì)THS個(gè)體的保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 清潔級(jí)、健康、雄性成年SD大鼠30只[原第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號(hào)：SCXK(軍)2012-0007]，8～10周，體重 250～300 g。飼養(yǎng)于溫度20℃～25℃，相對(duì)濕度55%～65%，陰暗、安靜環(huán)境中，12 h白晝交替，常規(guī)喂養(yǎng)，自由攝食進(jìn)水。采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為假手術(shù)組(sham 組)、THS模型組、西維來司鈉處理組(S組)，每組10只。

1.2 主要藥品、試劑及設(shè)備 10%水合氯醛購自國藥集團(tuán)試劑有限公司(批號(hào)：20170912)，西維來司鈉購自上海匯倫生命科技有限公司(批號(hào)：HLA0048)，大鼠腫瘤壞死因子α (tumor necrosis factor α,TNF-α)購自上海西唐生物有限公司(貨號(hào)：F16960)、白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-6、高遷移率族蛋白B1(high mobility group protein B1,HMGB1)酶聯(lián)免疫吸附 (enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測試劑盒均購自上海西唐生物有限公司(貨號(hào)：F15870、F15640)。SpectraMax M5酶標(biāo)儀購自美國Molecular Devices公司，RM-6200型智能多導(dǎo)生理監(jiān)護(hù)儀相連購自成都儀器廠，PowerLab 生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)購自澳大利亞ADInstruments 公司， COBAS Integra 400 Plus全自動(dòng)生化檢測儀購自瑞士羅氏公司 。

1.3 THS復(fù)蘇后大鼠模型的建立及干預(yù)方法 參照文獻(xiàn)[8]建立THS復(fù)蘇后大鼠模型。各組大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，術(shù)前禁食過夜，自由攝水。10%水合氯醛(3.5 mL /kg，腹腔注射)麻醉各組大鼠后，腹正中行5 cm切口造成軟組織創(chuàng)傷后進(jìn)行縫合。雙側(cè)股動(dòng)脈插入聚乙烯導(dǎo)管(美國BD公司，24 G，批號(hào)：80430022)以監(jiān)測血壓同時(shí)進(jìn)行放血，右股靜脈插入聚乙烯導(dǎo)管備用以進(jìn)行液體復(fù)蘇，以上導(dǎo)管均通過皮下隧道埋置于背部皮下。除sham組外，其他兩組在10 min內(nèi)迅速放血使平均動(dòng)脈壓(mean arterial pressure,MAP)降至35～40 mmHg，若血壓不能維持則需要補(bǔ)充最大放血量 40%的林格氏液，以維持MAP在35～40 mmHg之間至出血90 min后，使用4倍最大放血容量的林格氏液進(jìn)行復(fù)蘇60 min。復(fù)蘇后拔除所有插管、縫合所有傷口。術(shù)后各組大鼠自由進(jìn)食飲水。S組在復(fù)蘇前即刻一次性給予腹腔注射200 mg/kg西維來司鈉，THS組在復(fù)蘇前即刻一次性腹腔注射等體積的生理鹽水。

1.4 觀察指標(biāo) (1)血流動(dòng)力學(xué)及心功能指標(biāo)： 記錄復(fù)蘇后即刻各組大鼠的MAP、心率。復(fù)蘇后24 h，各組大鼠經(jīng)再次麻醉后分離右頸總動(dòng)脈并置管于左心室，監(jiān)測左心室壓力最大上升速率(maximum of positive first derivative of left ventricular pressure,+dp/dtmax)和左心室壓力最大下降速率(maximum of negative first derivative of left ventricular pressure,-dp/dtmax)。(2)血?dú)夥治觯簭?fù)蘇后24 h采集各組大鼠動(dòng)脈血1 mL，行動(dòng)脈血?dú)夥治鰴z測乳酸、pH、PaO2、PaCO2、HCO3-水平。(3)肝腎功能：復(fù)蘇后24 h各組大鼠取靜脈血2 mL靜置30 min 后離心(4℃,3 000 r/min，20 min)，取上清液制備血清，放入全自動(dòng)生化檢測儀檢測AST、ALT、尿素氮及肌酐水平。(4)炎癥指標(biāo)：取各組大鼠(3)中的上清液，采用ELISA法檢測TNF-α、IL-6、HMGB1水平，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。Sham組大鼠記錄其他組大鼠復(fù)蘇時(shí)的即刻MAP、心率；(1)～(4)中的其余指標(biāo)在完成導(dǎo)管置入術(shù)后24 h進(jìn)行檢測，操作同上。

1.4.5 肺系數(shù)及肺濕/干重比：復(fù)蘇后24 h開胸取全肺稱重，計(jì)算肺系數(shù)，肺系數(shù)=肺質(zhì)量/體質(zhì)量×100%。取右肺下葉，稱濕重，然后置75°C 烤箱干燥，計(jì)算肺濕/干重比(ratio of wet weight to dry weight,W/D)，W/D=濕重/干重。

1.4.6 組織病理學(xué)觀察：復(fù)蘇后24 h取各組大鼠心、肺、肝、腎組織，磷酸緩沖鹽溶液清洗干凈后迅速置于4%多聚甲醛中固定24 h后，逐級(jí)酒精脫水，置二甲苯透明，浸蠟、石蠟包埋，切片，脫蠟，蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色，樹膠封固，置于光鏡下觀察組織形態(tài)學(xué)變化。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 3組大鼠復(fù)蘇后血流動(dòng)力學(xué)及心功能比較 復(fù)蘇后即刻，S組及THS組心率、MAP均較sham組下降(均P<0.05)，但S組及THS組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。復(fù)蘇24 h后，S組和THS組的+dp/dtmax及-dp/dtmax均低于sham組(均P<0.05)，而S組的+dp/dtmax及-dp/dtmax均高于THS組(均P<0.05)。見表1。

表1 3組大鼠復(fù)蘇后血流動(dòng)力學(xué)及心功能比較(x±s)

2.2 3組大鼠復(fù)蘇后24 h動(dòng)脈血?dú)庵笜?biāo)及肺系數(shù)、W/D比較 復(fù)蘇后24 h，與sham組比較，其他兩組的pH、PaO2、HCO3ˉ均降低，而PaCO2、乳酸、W/D及肺系數(shù)均升高(均P<0.05)；但與THS組比較，S組的pH、PaO2、HCO3ˉ均升高，而PaCO2、乳酸、W/D及肺系數(shù)均降低(均P<0.05)。見表2。

表2 3組大鼠復(fù)蘇后24 h動(dòng)脈血?dú)庵笜?biāo)及肺系數(shù)、W/D比較(x±s)

2.3 3組大鼠復(fù)蘇后24 h肝、腎功能指標(biāo)比較 復(fù)蘇后24 h，與sham組比較，其他兩組ALT、AST、尿素氮、肌酐水平均升高，但S組上述指標(biāo)均低于THS組(均P<0.05)，見表3。

表3 3組大鼠復(fù)蘇后24 h肝腎功能指標(biāo)比較(x±s)

2.4 3組大鼠復(fù)蘇后24 h心、肺、肝、腎形態(tài)學(xué)改變 (1)心肌：sham組光鏡下可見心肌細(xì)胞排列整齊，未見明顯水腫及炎性細(xì)胞浸潤；THS組可見心肌細(xì)胞水腫，心肌纖維紊亂，毛細(xì)血管充血，有核細(xì)胞浸潤增多；而S組可見心肌細(xì)胞走形基本整齊，仍有輕微水腫，肌間隙有核細(xì)胞浸潤情況較THS組明顯減少。(2)肝臟：sham 組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞排列整齊，呈放射狀，肝竇間隙正常；THS組可見肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，肝竇擴(kuò)張伴淤血，肝細(xì)胞腫脹，并伴有不同程度的點(diǎn)狀壞死，胞核濃縮；而S組損傷較THS組輕微，肝小葉結(jié)構(gòu)尚完整，肝細(xì)胞水腫減輕，變形壞死少見，肝竇擴(kuò)張輕微，其間淤血不明顯。(3)肺臟：sham組大鼠肺泡形態(tài)正常，肺泡壁完整； THS組可見肺泡壁完整性破壞，肺泡腔內(nèi)有大量炎性細(xì)胞浸潤滲出及片狀出血，肺毛細(xì)血管充血；S組肺毛細(xì)血管充血、出血均較THS組明顯減輕，肺泡腔內(nèi)炎細(xì)胞浸潤減少。(4)腎組織： sham組腎單位結(jié)構(gòu)完整；THS組的腎小管上皮細(xì)胞及間質(zhì)水腫，部分腎小管可見細(xì)胞管型；S組上述表現(xiàn)減輕。見圖1。

sham組 THS組 S組

2.5 3組大鼠復(fù)蘇后24 h炎癥因子及HMGB1水平比較 THS組與S組血清TNF-α、IL-6、HMGB1水平均高于sham組，而S組以上指標(biāo)水平均低于THS組(均P<0.05)，見表4。

表4 3組大鼠復(fù)蘇后24 h炎癥因子及HMGB1水平比較(x±s)

3 討 論

THS具有高發(fā)病率、高死亡率的特點(diǎn)。盡管經(jīng)過損傷控制及液體復(fù)蘇后，仍有近30%的THS患者因合并多臟器功能障礙綜合征而死亡[9-10]。炎癥反應(yīng)在THS中具有重要作用，貫穿在THS的整個(gè)病理生理過程：首先，創(chuàng)傷后中性粒細(xì)胞通過與內(nèi)皮細(xì)胞相互作用損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，增加血管通透性，并穿越內(nèi)皮向缺血組織聚集，堵塞毛細(xì)血管，加劇血流動(dòng)力學(xué)紊亂及組織細(xì)胞缺血、缺氧；其次，再灌注后中性粒細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞黏附增加，刺激促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生和釋放，并促進(jìn)大量活性氧、自由基釋放造成氧化應(yīng)激損傷。內(nèi)源性蛋白酶抑制劑在活性氧作用下失活，導(dǎo)致蛋白酶及其抑制劑失衡，產(chǎn)生“瀑布樣”級(jí)聯(lián)放大炎癥效應(yīng)，誘導(dǎo)全身炎癥反應(yīng)綜合征。機(jī)體這種不斷自我放大的失控炎癥反應(yīng)，在創(chuàng)傷后的感染因素作用下直接導(dǎo)致膿毒癥，甚至誘導(dǎo)多臟器功能衰竭，使病死率大幅度提升[1]。TNF-α是炎癥早期的促炎反應(yīng)因子，能激活內(nèi)皮產(chǎn)生IL-6、IL-8等炎癥因子；同時(shí)通過抑制纖溶系統(tǒng)活性，導(dǎo)致微血管舒縮異常及微血栓形成，加重凝血功能障礙[7]。HMGB1是晚期促炎細(xì)胞因子，能夠進(jìn)一步放大炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，建模后大鼠的心率、MAP、+dp/dtmax及-dp/dtmax下降，pH、HCO3ˉ均降低，而乳酸、W/D、肺系數(shù)、肝腎功能指標(biāo)均升高(均P<0.05)，即大鼠出現(xiàn)了心臟收縮功能下降、肺水腫、乳酸堆積、肝腎功能損傷，提示成功建立模型。而復(fù)蘇后的THS大鼠血清TNF-α、IL-6、HMGB1仍高于sham組(P<0.05)，提示HMGB1作為促炎細(xì)胞因子，在THS發(fā)揮了重要作用。

NE是活化中性粒細(xì)胞釋放的一種酶，過度釋放的NE會(huì)破壞器官富有彈性蛋白的結(jié)締組織。內(nèi)源性NEI與NE之間的動(dòng)態(tài)平衡為機(jī)體提供保護(hù)屏障。西維來司鈉是目前唯一上市的人NEI，主要用于治療急性肺損傷。越來越多的實(shí)驗(yàn)表明，西維來司鈉在肺外其他疾病中，如心肺流轉(zhuǎn)術(shù)后炎癥反應(yīng)、創(chuàng)傷后膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎、膿毒癥相關(guān)肺及腎損傷、缺血再灌注損傷等，也發(fā)揮重要保護(hù)作用[3，6，11-14]。研究結(jié)果顯示，創(chuàng)傷活化中性粒細(xì)胞能夠阻止內(nèi)源性NEI對(duì)NE的抑制作用，引起兩者之間的平衡失調(diào)；創(chuàng)傷后NE水平明顯升高，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮損傷，組織通透性增強(qiáng)，組織水腫增加；NE促進(jìn)機(jī)體內(nèi)凝血因子形成，誘發(fā)凝血功能障礙，同時(shí)促進(jìn)炎性因子IL-6、IL-8、TNF-α等大量釋放，趨化中性粒細(xì)胞滲出血管并向炎癥部位集中，加重細(xì)胞膜的損傷[7，15-16]。本研究結(jié)果表明，給予外源性西維來司鈉后， S組的TNF-α、IL-6、HMGB1水平較THS組分別下降29.51%、36.32%以及34.46%(均P<0.05)，提示西維來司鈉可以通過抑制NE從而抑制THS后過度釋放的炎性因子。既往實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，西維來司鈉可有效抑制NE、拮抗中性粒細(xì)胞的組織浸潤及聚集，減少 TNF-α、IL-6、HMGB1上調(diào)，減輕炎癥反應(yīng)，治療性地逆轉(zhuǎn)組織水腫、炎性滲出，從而改善器官功能[6，13-14]。本研究結(jié)果也顯示，與THS組比較， S組大鼠心功能指標(biāo)、血?dú)庵笜?biāo)、W/D及肺系數(shù)、肝腎功能指標(biāo)均有所改善，心、肺、肝、腎組織水腫均有所減輕(均P<0.05)，這可能是因?yàn)槲骶S來司鈉能夠通過有效地降低對(duì)周圍蛋白質(zhì)降解和破壞，從而減輕組織水腫及炎性滲出，改善血管充血、出血，減輕細(xì)胞壞死，進(jìn)而改善臟器功能。

綜上所述，西維來司鈉能夠改善THS復(fù)蘇后大鼠的心肝腎等臟器功能以及動(dòng)脈血?dú)夥治鲋笜?biāo)，減輕肺損傷及損傷后乳酸堆積，其具體機(jī)制可能與其特異性抑制NE活性、減少損傷后組織炎性細(xì)胞浸潤及炎性因子過度釋放有關(guān)。