復方扶芳藤合劑含藥血清對大鼠體外模擬“造血龕”中造血干細胞增殖的影響

周倍伊，萬 娟，周 圍，謝金玲，鐘衛(wèi)干，楊力強，羅 眈，黃鎧琴

（1.廣西中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院，廣西 南寧 530200；2.廣西中醫(yī)藥大學藥學院，廣西 南寧 530200；3.廣西中醫(yī)藥大學廣西中藥藥效研究重點實驗室，廣西 南寧 530200）

造血干細胞移植技術成為有效治療多種疑難血液病的方法，也為中醫(yī)藥現代化研究帶來新的切入點。單純的造血干細胞移植技術一方面給許多絕癥患者帶來了生存的希望，另一方面因移植所帶來的并發(fā)癥導致的移植失敗也給患者帶來巨大風險［1］。既往對移植失敗研究多側重在造血干細胞方面，而對造血干細胞賴以生存的造血微環(huán)境（造血龕，niche）缺乏足夠的重視［2］。實驗研究發(fā)現，間充質干細胞（MSCs）和造血干細胞（HSC）是造血龕的構成細胞，在“龕”內MSCs對HSC有促增殖作用。研究還發(fā)現MSCs與HSC通過細胞接觸產生多種可溶性的和膜結合的細胞因子，調節(jié)造血干細胞歸巢定位、增殖分化及凋亡［3］。臨床研究證明，HSC與MSCs共移植能盡快地恢復造血微環(huán)境（造血龕）的造血重建［4-5］。中醫(yī)藥副作用低，以及具有較好的調節(jié)造血微環(huán)境（造血龕）的作用［6-7］，有望成為配合治療血液病的方法之一。

復方扶芳藤合劑是廣西中醫(yī)藥大學制藥廠的產品，臨床用于心脾兩虛、氣血不足之證。該制劑由扶芳藤、黃芪、人參組成，有研究表明，黃芪的有效成分黃芪甲苷和人參的有效成分人參皂苷Rg1均可促進骨髓間充質干細胞（BMSCs）與HSC的體外增殖［8-9］。本課題前期的研究發(fā)現，復方扶芳藤合劑對大鼠BMSCs和HSC均有促增殖作用［10-11］，但對大鼠BMSCs和HSC共培養(yǎng)體外模擬的“造血龕”有何影響尚未明了。為探討不同培養(yǎng)模式體外模擬的“造血龕”中BMSCs對HSC增殖的作用，以及復方扶芳藤合劑含藥血清對“龕”內HSC增殖的影響，本文開展如下實驗，為研究復方中藥對造血微環(huán)境（造血龕）的調節(jié)作用提供參考。

1 實驗材料

1.1 動物 SPF級健康4周齡SD大鼠120只，體質量100±20 g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，許可證號為SCXK（湘）2016-0002，試驗過程中對動物的處置符合中華人民共和國科學技術部2006年頒布的《關于善待實驗動物的指導性意見》標準。

1.2 主要試劑與儀器 Attune NxT流式細胞儀（美國Invitrogen公司）；美天旎細胞手動分選儀Miltenyi MidiMACS?Starting Kit LS（德國Milteny公司）；Transwell共培養(yǎng)板（0.4μm，美國Corning公司）；GIBCO DMEM低糖液體培養(yǎng)基（美國Thermo Fisher公司，C11885500BT，LOT:8118190）；Phosphate Buffer Saline pH 7.4 basic磷酸緩沖鹽溶液（美國Thermo Fisher公司，C10010500BT，LOT:8117069）；Percoll?PLUS細胞分層液（美國Sigma公司，1002698877，LOT:#SLBX1265）；

CD90.1-APC（Thy-1.1）Monoclonal Antibody（HIS51）（美 國Thermo Fisher公 司，17-0900-82，LOT：4322557）；0.25%Trypsin-EDTA胰蛋白酶溶液（美國Thermo Fisher公司，25200-056，LOT：1859509）。

2 方法

2.1 BMSCs的原代分離培養(yǎng) 取4周齡雄性SPF級健康SD大鼠，頸椎脫臼處死，75%乙醇全身浸泡1min，無菌條件下快速去除肌肉等軟組織，取出股骨及脛骨，以75%乙醇浸泡清洗1次，磷酸緩沖鹽溶液（PBS）浸泡清洗2次。無菌條件下剪去長骨的骨骺端，露出骨髓腔，用含有10%胎牛血清（FBS）的低糖液體培養(yǎng)基（L-DMEM）沖洗骨髓腔，直至骨質發(fā)白；將沖出的骨髓內容物制成單細胞懸液，靜置后，移取上清液至新離心管中，沉淀物用完全培養(yǎng)基重懸后種瓶，置于37°C、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2 BMSCs的培養(yǎng)、純化及傳代 在原代細胞培養(yǎng)過程中，24 h后換液更換半數培養(yǎng)基，48 h后換液更換全量培養(yǎng)基。此后每2～3天全量更換1次完全培養(yǎng)基，待細胞鋪滿培養(yǎng)瓶底約90%時，使用胰酶-EDTA（乙二胺四乙酸）溶液消化，按1∶2的比例進行傳代培養(yǎng)。

2.3 BMSCs的形態(tài)學觀察 細胞培養(yǎng)中，每日用倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化及生長狀況［10］。

2.4 BMSCs表面標記物的表達鑒定 收集P3代生長良好的細胞，0.25%胰酶消化，4℃離心，1 000 r/min，3 min，PBS清洗細胞3次，細胞計數，調整濃度為1×106cells/ml，各管加入100μl細胞懸液，各管依次加入單克隆抗體CD29、CD34、CD44、CD45和四染管，同時每管單染管設立陰性對照組，避光孵育15min，每管加入2m l流式緩沖液清洗3次，除去未結合抗體，300 r/min離心5min，棄上清，500μl流式緩沖液重懸細胞，流式細胞儀進行檢測分析。

2.5 HSC體外分選與生物學性狀鑒定 頸椎脫臼法處死4周齡SD大鼠，75%乙醇浸泡，超凈工作臺內無菌取脛骨和股骨，剪開兩端骨骺，培養(yǎng)基L-DMEM反復沖洗骨髓腔，40μm篩網過濾，離心收集細胞。配制密度為1.087 g/m l的細胞分層液（Percoll），將骨髓細胞小心覆加于Percoll上，室溫密度梯度離心，1 000 r/min，25 min，收集中間白膜層細胞，分選緩沖液（MACS Buffer）清洗2次，離心，300 r/min，10min，細胞計數。按1×107cells/90μl MACS Buffer進行重懸，再按1×107cells/10μl加入磁珠CD90.1，混勻，4℃孵育15min；MACSBuffer清洗2次，加入0.3μl CD90.1（Thy-1.1）Monoclonal Antibody（HIS51），4℃孵育5 min；按照1×107cells/2m l加入MACSBuffer清洗2次，300 r/min離心10 min，去上清；按照1×108cells/500μl加入MACSBuffer重懸。置LS柱于MACS（細胞手動分選儀）系統(tǒng)，加MACSBuffer 3m l潤濕LS柱，再加入前述經Thy-1.1單抗和磁珠CD90.1標記的細胞懸液，待其自然流下，即為Thy-1.1-細胞。使用3m lMACSBuffer清洗LS柱3次，收集所有流出液體，仍為Thy-1.1-細胞。將LS柱撤離MACS系統(tǒng)，加入5mlMACSBuffer，用配套針芯推出所有液體，收集至另一干凈試管，即為Thy-1.1+細胞。使用流式細胞儀檢測分選后細胞中Thy-1.1+細胞的百分比。分別取離心分選前后的細胞懸液10μl，加入0.4%臺盼藍染液10μl，混勻，靜置3min，取10μl細胞懸液進行活性檢測，在熒光顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。

2.6 BMSCs與HSC共培養(yǎng) 取24孔板和Transwell用于共培養(yǎng)，在90%DMEM-F12+10%胎牛血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d。從第1天起每48 h收集各組HSC細胞，進行熒光拍照，使用CCK-8法檢測細胞增殖情況。設置分組如下。①HSC單獨培養(yǎng)組：24孔板內單獨接種HSC；②Transwell共培養(yǎng)組：24孔板對應規(guī)格Transwell內單獨接種HSC于上室，接種BMSCs于下室；③2D接觸共培養(yǎng)組：24孔板內共同接種HSC與BMSCs。每組設4個復孔，其中間充質干細胞5×105cells/孔；HSC為1×105cells/孔。各組細胞培養(yǎng)1～7 d后，收集HSC單獨培養(yǎng)組全部細胞；收集實驗組（Transwell共培養(yǎng)組）上室全部細胞并用PBS洗滌3次；2D接觸共培養(yǎng)組吸出懸浮于細胞培養(yǎng)液中的熒光細胞，在熒光顯微鏡下觀察細胞形態(tài)和增殖情況，每孔樣本單獨離心并重懸至100μl后添加至96孔培養(yǎng)板中，每孔加入CCK-8試劑10μl，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h，使用酶標儀在450 nm處檢測吸光度值，以培養(yǎng)時間為橫軸，吸光度為縱軸繪制細胞生長曲線。

2.7 復方扶芳藤合劑含藥血清干預 同2.6項方法，分組如下。①空白血清HSC單獨培養(yǎng)組：24孔板內單獨接種HSC，使用空白血清干預；②空白血清Transwell共培養(yǎng)組：24孔板對應規(guī)格Transwell內單獨接種HSC于上室，接種BMSCs于下室，使用空白血清干預；③空白血清2D接觸共培養(yǎng)組：24孔板內共同接種HSC與BMSCs，使用空白血清干預；④含藥血清HSC單獨培養(yǎng)組：24孔板內單獨接種HSC，使用含藥血清干預；⑤含藥血清Transwell共培養(yǎng)組：24孔板對應規(guī)格Transwell內單獨接種HSC于上室，接種BMSCs于下室，使用含藥血清干預；⑥含藥血清2D接觸共培養(yǎng)組：24孔板內共同接種HSC與BMSCs，使用含藥血清干預。每組設4個復孔，其中間充質干細胞5×105cells/孔；HSC為1×105cells/孔。各組細胞培養(yǎng)1～7 d后，收集HSC單獨培養(yǎng)組全部細胞；收集實驗組（Transwell共培養(yǎng)組）上室全部細胞并用PBS洗滌3次；2D接觸共培養(yǎng)組吸出懸浮于細胞培養(yǎng)液中的熒光細胞，在熒光顯微鏡下觀察細胞形態(tài)和增殖情況，每孔樣本單獨離心并重懸至100μl后添加至96孔培養(yǎng)板中，每孔加入CCK-8試劑10μl，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h，使用酶標儀在450 nm處檢測吸光度值，以培養(yǎng)時間為橫軸，吸光度為縱軸繪制細胞生長曲線。

3 結 果

3.1 BMSCs形態(tài)學觀察結果 使用全骨髓貼壁培養(yǎng)法接種骨髓細胞于培養(yǎng)瓶后觀察發(fā)現，鏡下檢查細胞數量多，種類雜，圓形透亮的為紅細胞且占大多數。24 h后觀察發(fā)現存在部分細胞已經貼壁分散生長，通過半換液去除未貼壁的細胞。48 h后觀察發(fā)現，培養(yǎng)瓶底出現多個細胞集落，呈放射狀，伸出長短不一、粗細不均的突起，未出現融合生長，單個細胞形態(tài)呈梭形（圖1A）。繼續(xù)培養(yǎng)，細胞集落面積不斷增大，且與周邊集落逐漸融合生長，培養(yǎng)7 d后長梭形細胞集落呈漩渦狀或放射狀，同向排列（圖1B）。傳代前記錄發(fā)現，細胞排列緊密，均勻鋪滿培養(yǎng)瓶底，約占據90%瓶底空間，部分細胞沒有生長空間，出現重疊或漂浮情況（圖1C）。傳代培養(yǎng)：1∶2消化傳代后，傳代細胞24 h即完全貼壁生長。細胞形態(tài)均一，呈典型梭形，旋渦狀或放射狀排列生長，細胞生長旺盛，每5 d即可傳代1次。

圖1 BMSCs形態(tài)學特征

3.2 BMSCs表面標記物的表達 流式細胞儀檢測結果顯示，培養(yǎng)的第3代大鼠BMSCs均一表達CD29、CD44，陽性率分別為99.709%、99.734%，而CD34、CD45呈陰性，陽性率分別為0.114%、0.013%。見圖2。

圖2 BMSCs表面標志物的表達

3.3 大鼠CD90.1+細胞純度及鑒定 分選出的CD90.1+細胞呈球形，體積偏??；臺盼藍拒染得出細胞存活率為97%；熒光顯微鏡下可激發(fā)綠色熒光；流式檢測細胞純度，分選后細胞純度為為99.071%。見圖3。

圖3 HSC熒光圖像與表面標志物的表達

3.4 BMSCs與HSC共培養(yǎng)與生長曲線測定 對不同天數測得的吸光度值進行組間比較，見表1。結果顯示：各組HSC數量均隨著培養(yǎng)時間的增加而增加（P＜0.05）；自第5 d起，Transwell共培養(yǎng)組及2D接觸共培養(yǎng)組的HSC吸光度值均高于HSC單獨培養(yǎng)組（P＜0.05）。在應用不同共培養(yǎng)模式下，2D接觸共培養(yǎng)組細胞增殖數量最多，其對應熒光圖像也呈現相似趨勢。見圖4、圖5。

表1 各組HSC吸光度比較（）

表1 各組HSC吸光度比較（）

注：與同組d1比較，①P＜0.05；與HSC單獨培養(yǎng)組比較，②P＜0.05

組 別HSC單獨培養(yǎng)組Transwell組2D接觸共培養(yǎng)組d1 0.1428±0.002 0.1440±0.007 0.1461±0.012 d3 0.1633±0.008①0.1678±0.017①0.1785±0.019①d5 0.1900±0.022①0.2346±0.028①②0.2710±0.030①②d7 0.2468±0.029①0.3199±0.031①②0.3306±0.035①②

圖4 各組HSC吸光度值隨時間的變化情況

圖5 各組HSC熒光圖像變化

3.5 復方扶芳藤合劑含藥血清干預與生長曲線測定 對共培養(yǎng)1 d、3 d、5 d、7 d的HSC樣本進行CCK-8檢測，統(tǒng)計每一天的吸光度值并進行組間比較（見表2、圖6），各組熒光圖像見圖7。結果顯示：含藥血清HSC單獨培養(yǎng)組吸光度值高于空白血清HSC單獨培養(yǎng)組（P＜0.05）；含藥血清Transwell組的HSC吸光度值高于空白血清Transwell組（P＜0.05）；含藥血清2D接觸共培養(yǎng)組HSC吸光度值高于空白血清2D接觸共培養(yǎng)組（P＜0.05）。以上結果說明：復方扶芳藤合劑含藥血清能進一步增強各培養(yǎng)模式中HSC增殖能力。

圖6 經干預后各組HSC吸光度值隨時間的變化情況

4 討 論

國內外研究證明，HSC與MSCs共培養(yǎng)的二維（2D）和三維培養(yǎng)體系均可以體外模擬造血龕，在一定程度上都可反映造血龕的功能。三維模擬造血龕在空間上更與體內造血龕相近，但是不利于細胞回收作進一步分析。二維模擬造血龕體系，MSCs屬貼壁細胞，HSC屬非貼壁細胞，所以容易分離細胞作進一步研究［12-15］。目前國內外公認的，研究最多的造血龕有三種：HSC與MSCs組成的造血龕、HSC與成骨細胞組成的造血龕以及由HSC與內皮細胞組成的造血龕。無論從臨床運用，還是體外二維、三維模擬造血龕都以HSC與MSCs最多。臨床研究發(fā)現，HSC與MSCs共移植治療惡性血液病，可以加快骨髓造血干細胞微環(huán)境（造血龕）造血功能的重建，能促進機體免疫調節(jié)功能，降低最主要的并發(fā)癥——移植物抗宿主?。℅VHD）的發(fā)生，提高造血干細胞移植成功率［2］。實驗研究證明，是間充質干細胞（MSCs）和造血干細胞（HSC）構成造血龕，“龕”內細胞MSCs數量增多時HSC數量增多，MSCs對HSC有促增殖作用。MSCs與HSC通過細胞接觸產生多種可溶性的和膜結合的細胞因子，調節(jié)造血干細胞歸巢定位、增殖分化及凋亡［3］。本實驗中HSC+BMSCs Transwell共培養(yǎng)組HSC吸光度值高于HSC單獨培養(yǎng)組HSC吸光度值（P＜0.05）；HSC+BMSCs 2D接觸共培養(yǎng)組HSC吸光度值高于Transwell共培養(yǎng)組（P＜0.05）。實驗證明BMSCs+HSC共培養(yǎng)組均能促進HSC增殖，BMSCs+HSC接觸共培養(yǎng)促HSC增殖效果最明顯。

表2 經干預后各組HSC吸光度值的變化情況（）

表2 經干預后各組HSC吸光度值的變化情況（）

注：與空白血清HSC單獨培養(yǎng)組比較，①P＜0.05；與空白血清Transwell組比較，②P＜0.05；與空白血清2D接觸共培養(yǎng)組比較，③P＜0.05

組 別空白血清HSC單獨培養(yǎng)組含藥血清HSC單獨培養(yǎng)組空白血清Transwell組含藥血清Transwell組空白血清2D接觸共培養(yǎng)組含藥血清2D接觸共培養(yǎng)組d1 0.1397±0.004 0.2014±0.019①0.1414±0.006 0.2163±0.020②0.1421±0.011 0.2208±0.023③d3 0.1685±0.007 0.2644±0.021①0.1738±0.015 0.3113±0.025②0.2201±0.021 0.4346±0.034③d5 0.2054±0.011 0.3147±0.029①0.2430±0.019 0.4744±0.039②0.2781±0.032 0.6317±0.047③d7 0.2547±0.016 0.3878±0.033①0.3314±0.029 0.6125±0.041②0.3392±0.035 0.7287±0.052③

中醫(yī)推測認為，BMSCs是“脾腎相關”細胞層次的表達形式，但究其實質仍屬于“先天之精”范疇［16］。唐宗海在《血證論·藏府病機論》中提出：“心之能事，又主生血，而心竅中數點血液，則又血中之最精微者，乃生血之源泉，亦出神之淵海?！保?7］其對“血中之最精微者”“生血之源泉”的描述與現在的外周血HSC極為相似。中醫(yī)認為，“脾為氣血生化之源，為后天之本”“后天濟先天”“精氣互化”“精血相生”［18］，所以中醫(yī)在臨床上對血液病的治療多以補腎填精、益氣健脾的扶正固本方法為主。本實驗中，復方扶芳藤合劑含藥血清干預的Transwell共培養(yǎng)組HSC吸光度值高于空白血清干預的Transwell共培養(yǎng)組（P＜0.05）；復方扶芳藤合劑含藥血清干預的2D接觸共培養(yǎng)組HSC吸光度值高于Transwell共培養(yǎng)組（P＜0.05），說明BMSCs與HSC共培養(yǎng)使BMSCs對HSC有促增殖作用，復方扶芳藤合劑含藥血清的干預加強了這種促增殖作用，為我們進一步研究復方中藥對造血微環(huán)境（造血龕）的調節(jié)作用提供參考。

圖7 經干預后各組1、3、5、7 d的HSC熒光圖像