壯藥龍鉆通痹方對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠成骨轉(zhuǎn)錄因子BMP2和Smad1的影響

龐宇舟，田 照，方 剛，張 曼，唐秀松

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)壯醫(yī)藥學(xué)院，廣西 南寧 530001；2.湖北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)部，湖北 恩施 445000）

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種慢性炎癥性疾病，以滑膜襯里細(xì)胞顯著增生、關(guān)節(jié)軟骨及軟骨下骨進(jìn)行性破壞為其主要特征［1-2］。其病程主要分為三個階段，一是環(huán)境因素作用于具有遺傳背景的個體，打破免疫耐受，啟動適應(yīng)性免疫應(yīng)答；二是關(guān)節(jié)滑膜襯里細(xì)胞異常增殖，關(guān)節(jié)腔血管翳形成；三是軟骨和骨組織遭受破壞，骨質(zhì)重構(gòu)，關(guān)節(jié)畸形［3-4］。RA有高度的致殘風(fēng)險，探索此病的有效治療措施仍是當(dāng)今急需解決的醫(yī)學(xué)難題之一。龍鉆通痹方（LZTB）由飛龍掌血、大鉆、兩面針等八味藥構(gòu)成，前期研究證實，龍鉆通痹方可明顯降低腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、干擾素（Interferon-γ，IFN-γ），上調(diào)白介素6（Interleukin-6，IL-6）、白介素10（Interleukin-10，IL-10）的表達(dá)水平，從而發(fā)揮抗炎鎮(zhèn)痛的作用，同時可延緩骨質(zhì)破壞，有效保護(hù)患者關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)，對RA患者的有效率達(dá)到85%［5-7］，但本方在治療RA中發(fā)揮骨保護(hù)的作用機(jī)制尚不清晰。

成骨細(xì)胞形成新骨受到多條通路和多個轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，其中骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（bone morphogeneticprotein 2，BMP2）和Smad同源物1（Smad1）轉(zhuǎn)錄因子在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化過程中起著重要的作用［8-9］。BMP2作為上游的轉(zhuǎn)錄因子，可磷酸化Smad1來刺激靶基因的表達(dá)，從而促進(jìn)成骨細(xì)胞分化與成熟［10］。鑒于此，本研究建立佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠模型，通過觀察LZTB對成骨細(xì)胞分化BMP2、Smad1轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)影響，探討其有效性及干預(yù)機(jī)制，以期為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎臨床防治提供理論依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 動物 SPF級雄性SD大鼠48只，體質(zhì)量約180～220 g，購自湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司，合格證號：SCXK（湘）2016-002。

1.2 試藥與試劑 LZTB（顆粒劑，每克干粉相當(dāng)于含生藥9.266 g），由廣西中醫(yī)藥大學(xué)制藥廠生產(chǎn)，批號：20180508；BMP2抗體（英國abcam公司，批號：ab6285）；Smad1抗體（英國abcam公司，批號：ab108965）；弗氏完全佐劑（美國Sigma公司）；逆轉(zhuǎn)錄盒（北京TIANGEN，批號：KR180123）；擴(kuò)增盒（北京TIANGEN，批號：FP171206）等。

1.3 儀器 足跖容積檢測儀（成都泰盟，PV-200）；熒光萬能顯微鏡（日本尼康，尼康80iD-FUW-PA）；高速冷凍離心機(jī)（德國Sigma，3K15）；電泳槽（Bio-Rad，MIni-SubCellGT）；全自動實時熒光定量PCR儀（瑞士羅氏，LightCycler96）等。

2 方法

2.1 模型制備 將48只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)分為正常組（Normal）、模型組（Model）、甲氨蝶呤對照組（Control）、壯藥高劑量組（Experimental-H）、中劑量組（Experimental-M）、低劑量組（Experimental-L），每組8只。除正常組外，余組按文獻(xiàn)［11］所述方法制備佐劑性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠模型，即在大鼠右后足底注射完全弗氏佐劑0.15m l，3 d后再次免疫，即尾根部注射完全弗氏佐劑0.1m l。壯藥組灌胃龍鉆通痹顆粒高、中、低劑量分別是5.4 g/（kg·d）、2.7 g/（kg·d）、1.35 g/（kg·d），稀釋濃度為0.54 g/ml，甲氨蝶呤對照組灌胃甲氨蝶呤（MTX）2.7mg/kg，正常組、模型組分別灌胃等體積蒸餾水。

2.2 實驗取材 灌胃21 d后處死大鼠取材，抽取全血，取左右膝關(guān)節(jié)滑膜、軟骨（備用）及踝關(guān)節(jié)以下骨組織。造模期間未見動物死亡，全部納入數(shù)據(jù)分析。

2.3 觀察指標(biāo)

2.3.1 RA模型大鼠足跖容積測量 為保證測量準(zhǔn)確性，每只大鼠在測量前在踝關(guān)節(jié)相同處做標(biāo)記，以足跖容積檢測儀每4 d測量1次，比較各組大鼠的足跖容積動態(tài)變化情況。

2.3.2 Westert blot檢測RA大鼠滑膜BMP2、Smad1蛋白的表達(dá)影響 從-80℃冰箱取出滑膜，冰上低溫勻漿，提取蛋白，用試劑盒檢測蛋白濃度。分別進(jìn)行電泳，洗膜3次后轉(zhuǎn)膜，以5%脫脂牛奶溶解液封閉2 h，洗膜后孵育一抗搖晃過夜，第二天洗膜孵育二抗，最后化學(xué)發(fā)光顯影。

2.3.3 RT-PCR檢測RA大鼠滑膜BMP2 mRNA、Smad1mRNA的表達(dá)影響 用滑膜提取總RNA，測定總RNA濃度，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，反應(yīng)條件為42℃15min，95℃3min。目的與內(nèi)參正反引物委托生工公司合成，按擴(kuò)增試劑盒配制擴(kuò)增體系（20μl），采用兩步法擴(kuò)增，共40個循環(huán)。

表1 引物序列信息

2.3.4 大鼠踝關(guān)節(jié)形態(tài)學(xué)檢測 踝關(guān)節(jié)組織以4%多聚甲醛固定，室溫24 h以后轉(zhuǎn)移至脫鈣中，制備石蠟，包埋切片，HE染色，光鏡下觀察滑膜組織形態(tài)學(xué)改變。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較以單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 各組大鼠足跖容積的測定結(jié)果 見表2。與正常組比較，模型組大鼠足跖容積明顯增大（P＜0.05），與模型組比較，壯藥高劑量組與甲氨蝶呤對照組足跖容積明顯減?。≒＜0.05）。

表2 各組大鼠足跖容積比較（unit/m l，）

表2 各組大鼠足跖容積比較（unit/m l，）

注：與正常組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05

組 別模型組甲氨蝶呤對照組壯藥高劑量組壯藥中劑量組壯藥低劑量組正常組n 8 8 8 8 8 8第1 d 1.68±0.20①1.71±0.15 1.65±0.19 1.55±0.26 1.60±0.12 1.30±0.22第4 d 3.32±0.29①3.31±0.30 3.32±0.17 3.31±0.29 3.30±0.36 1.35±0.25第7 d 3.35±0.21①2.99±0.16 3.10±0.38 2.29±0.30 3.28±0.21 1.38±0.25第10 d 3.45±0.28①2.68±0.21②2.89±0.21②3.01±0.26 3.28±0.28 1.38±0.21第13 d 3.60±0.26①2.30±0.18②2.67±0.26②2.92±0.29 3.26±0.25 1.41±0.25第16 d 3.79±0.30①2.09±0.25②2.35±0.30②2.75±0.24 3.23±0.21 1.42±0.25第19 d 3.86±0.25①1.98±0.19②2.28±0.20②2.72±0.21 3.21±0.23 1.44±0.24第21 d 3.86±0.30①1.97±0.20②2.25±0.19②2.72±0.28 3.20±0.20 1.44±0.20

3.2 Westert blot檢測各組大鼠滑膜BMP2、Smad1蛋白的表達(dá)結(jié)果 見圖1與表3。與正常組比較，模型組BMP2和Smad1均明顯下調(diào)（P＜0.05）；與模型組比較，甲氨蝶呤對照組與壯藥高劑量組BMP2和Smad1表達(dá)均顯著提高（P＜0.05），壯藥中、低劑量組未見明顯性差異；與甲氨蝶呤對照組比較，壯藥高劑量組差異不明顯。

圖1 各組大鼠BMP2和Smad1蛋白的表達(dá)

表3 各組大鼠BMP2和Smad1蛋白的表達(dá)（）

表3 各組大鼠BMP2和Smad1蛋白的表達(dá)（）

注：與正常組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05；與甲氨蝶呤對照組比較，③P＞0.05

蛋白名稱BMP2 Smad1正常組1.01±0.19 1.19±0.21模型組0.26±0.0①0.28±0.11①甲氨蝶呤對照組0.81±0.11②0.80±0.19②壯藥高劑量組0.76±0.10②③0.72±0.15②③壯藥中劑量組0.49±0.14 0.47±0.12壯藥低劑量組0.28±0.05 0.31±0.16

3.3 RT-PCR檢測各組大鼠滑膜BMP2 mRNA、Smad1mRNA的表達(dá)結(jié)果 結(jié)果見表4與圖2。與正常組比較，模型組BMP2mRNA、Smad1mRNA表達(dá)均明顯下調(diào)（P＜0.05）；與模型組比較，甲氨蝶呤對照組與壯藥高劑量組BMP2mRNA和Smad1mRNA均表達(dá)上調(diào)（P＜0.05），壯藥中、低劑量組差異不顯著。

表4 各組大鼠BMP2mRNA/Smad1mRNA相對性表達(dá)（）

表4 各組大鼠BMP2mRNA/Smad1mRNA相對性表達(dá)（）

注：與正常組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05；與甲氨蝶呤對照組比較，③P＞0.05

基因名稱BMP2mRNA Smad1mRNA正常組1.00±0.29 1.10±0.25模型組0.28±0.10①0.23±0.07①甲氨蝶呤對照組0.88±0.20②0.84±0.16②壯藥高劑量組0.76±0.16②③0.79±0.12②③壯藥中劑量組0.60±0.20 0.47±0.14壯藥低劑量組0.38±0.09 0.29±0.11

圖2 各組大鼠BMP2mRNA/Smad1mRNA相對性表達(dá)

3.4 各組大鼠踝關(guān)節(jié)病理形態(tài) 結(jié)果見圖3。正常組踝關(guān)節(jié)滑膜表面光滑，關(guān)節(jié)腔結(jié)構(gòu)清晰，未見炎癥細(xì)胞浸潤。模型組滑膜邊緣毛糙，層次不清，充滿炎性物質(zhì)，成骨細(xì)胞明顯減少。甲氨蝶呤對照組滑膜邊緣較清晰，有較多成骨細(xì)胞分布。壯藥低劑量組滑膜增厚（星號處），邊緣欠光滑，成骨細(xì)胞排列雜亂；壯藥高劑量組可見滑膜邊緣較為光滑，關(guān)節(jié)腔清晰，炎癥細(xì)胞較少，成骨細(xì)胞排列相對整齊。

4 討 論

圖3 各組大鼠踝關(guān)節(jié)病理切片（HE×100）

RA以滑膜炎、血管炎和骨質(zhì)破壞為其主要病理基礎(chǔ)，具有患病率高、致殘率高、治療費(fèi)用高的特點(diǎn)［12］，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)主要在非甾體抗炎藥或改善病情的抗風(fēng)濕藥基礎(chǔ)上聯(lián)用糖皮質(zhì)激素、生物制劑等予以治療，可有效緩解患者疼痛、晨僵麻木等癥狀，有助于延緩病情進(jìn)展，降低致殘風(fēng)險。但由于本病需要長期服藥，糖皮質(zhì)激素帶來的一系列副作用如青光眼、骨質(zhì)疏松、高血壓等風(fēng)險亦隨之加大。故探尋療效可靠且費(fèi)用較為低廉的治療方法已刻不容緩。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)內(nèi)外并調(diào)，標(biāo)本兼治，費(fèi)用相對較低，已逐漸得到患者的認(rèn)可［13］。民族醫(yī)藥如藏、蒙、壯、苗等對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎都有較深入的研究，特色方藥和技法普世濟(jì)仁，造福一方［14-15］。壯醫(yī)認(rèn)為“毒虛致百病”，風(fēng)毒、寒毒、濕毒等侵襲人體，阻滯經(jīng)絡(luò)，使三道兩路運(yùn)行不暢；久病體虛，素體不足，后天消耗過度等致使正氣虛損，正不勝邪，影響三氣同步，本虛復(fù)感毒邪共同導(dǎo)致了RA的發(fā)生［16-17］。

已有研究顯示：在RA關(guān)節(jié)中，正常的薄滑液關(guān)節(jié)襯里層被炎癥性、高血管化浸潤性纖維膠原酶組織所取代，刺激產(chǎn)生大量IL-1、IL-6、TNF-α等炎性因子，促使破骨細(xì)胞大量吸收，成骨細(xì)胞無法填補(bǔ)破骨細(xì)胞吸收遺留的蜂窩凹陷，導(dǎo)致關(guān)節(jié)骨的破壞和畸形［18］。成骨因子可由骨細(xì)胞分泌或在骨重建過程中釋放，這些因子在吸收后釋放包括TGF-β、BMP等在內(nèi)的多個成骨信號家族成員，細(xì)胞表面的BMP信號由Smad轉(zhuǎn)錄因子家族直接轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控，其下游BMP2靶基因Runx2、Osterix等均屬于成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子，更重要的是，BMPs在骨再生中的作用于動物模型和臨床應(yīng)用中皆是眾所周知，如骨折愈合、脊柱融合、顱面骨缺損等［19-20］。故BMP2與Smad1作為中上游轉(zhuǎn)錄因子對于成骨細(xì)胞的分化與骨重建是尤為關(guān)鍵的。

本研究發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，壯藥高劑量組與甲氨蝶呤對照組大鼠的足跖容積自給藥15 d后下降明顯，而壯藥中、低劑量組改善不明顯，說明甲氨蝶呤與高劑量龍鉆通痹方這兩種干預(yù)方法對RA模型大鼠均有一定治療效果且與給藥時間有一定關(guān)系。甲氨蝶呤對照組BMP2與Smad1滑膜蛋白表達(dá)均稍高于壯藥高劑量組，進(jìn)一步證明甲氨蝶呤片作為RA的基礎(chǔ)常用藥的可靠性，也驗證了本研究以甲氨蝶呤片作為對照藥物是科學(xué)可取的。RT-PCR檢測結(jié)果說明LZTB高劑量給藥更有利于RA大鼠滑膜分子層面的改變。HE染色提示正常組關(guān)節(jié)滑膜光滑無增生，軟骨細(xì)胞排列整齊，無炎癥細(xì)胞；模型組可見滑膜組織增生，關(guān)節(jié)腔狹窄，結(jié)構(gòu)模糊不清，軟骨及軟骨下骨遭受破壞，結(jié)合足跖容積的改變，驗證了模型制備成功。壯藥組病理改變與給藥劑量有一定依賴性，壯藥高劑量組的關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)及滑膜形態(tài)明顯好于壯藥中、低劑量組。綜上所述，壯藥高劑量治療活動期RA可顯著提高成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子BMP2與Smad1的蛋白和基因表達(dá)，可改善模型大鼠足跖容積，對軟骨及軟骨下骨有一定修復(fù)能力，其作用機(jī)制可能是上調(diào)成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子BMP2和Smad1的表達(dá)，從而發(fā)揮骨保護(hù)作用。由于沒有進(jìn)行更長時間的給藥觀察，RA患者在服藥21 d后是否在相應(yīng)研究指標(biāo)中有類似的改變還不得而知，后續(xù)研究將予以完善。