益肺宣肺降濁方對血管性癡呆大鼠VEGF基因表達及線粒體凋亡通路的影響

雷裕君，吳 鵬，黃立武，唐 農(nóng)，林 飛

（1.廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530023；2.廣西中醫(yī)藥大學，廣西 南寧 530200）

血管性癡呆（Vascular Dementia，VD）是指由各種腦血管因素所致的以記憶和認知功能障礙為主要特征的綜合征，目前是導致老年人致殘的三大疾病之一［1］。隨著人口老齡化，腦血管疾病發(fā)生率逐年上升，VD的發(fā)病率也在逐漸增長，給社會和家庭帶來沉重的經(jīng)濟負擔［2］。由于血管性癡呆發(fā)病原因及病理機制十分復(fù)雜，目前其發(fā)病機制尚不清楚。我們在前期的研究中發(fā)現(xiàn)［3］，缺血后腦細胞的損傷與自由基代謝的紊亂密切相關(guān)，是缺血性腦損傷的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。VEGF表達在缺血性腦損傷的血管反應(yīng)中可促進新生血管，改善腦損傷。同時線粒體作為細胞能量代謝重要的器管，是生成能量的主要場所，發(fā)生缺血改變時線粒體氧化分解功能障礙，可使學習記憶的關(guān)鍵區(qū)域（海馬、皮層）區(qū)域受損，出現(xiàn)記憶力和認知功能下降。益肺宣肺降濁方是廣西名中醫(yī)唐農(nóng)教授臨床治療癡呆的經(jīng)驗方，本研究通過觀察益肺宣肺降濁方對血管性癡呆模型大鼠腦內(nèi)血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）基因表達及大腦皮層線粒體功能的影響，探討該方治療血管性癡呆的作用機制。

1 實驗材料

1.1 動物 健康雄性大鼠，SPF級，100只，體質(zhì)量200±20 g，購于廣西醫(yī)科大學實驗動物中心，動物合格證號：SCXK（桂）2005－0003。大鼠行為測試無異常，給予自由飲水與攝食，日光輔助照明，至少每日維持在12 h以上。濕度適中，按時通風，更換墊料。

1.2 藥物 益肺宣肺降濁方（由桔梗、杏仁、人參、麥冬、黃芪、三七、蘇子、石菖蒲、酒大黃組成），以上藥材由我院藥劑科統(tǒng)一采購，并在醫(yī)院制劑室制備成濃縮液，濃度為0.15 g/ml。安理申口服制劑[衛(wèi)材（中國）藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，國藥準字H20070181，批號：130635A]。

1.3 主要試劑及儀器 兔抗大鼠VEGF多克隆抗體、即用SABC免疫組化染色試劑盒和VEGFmRNA原位雜交試劑盒，均為武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品；三磷酸腺苷（ATP）和線粒體呼吸鏈復(fù)合物測定試劑盒，為上海酶聯(lián)生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，批號：20170220；Morris水迷宮由廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院提供。

2 方法

2.1 動物模型的制備 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，參照經(jīng)典的2-VO法（雙側(cè)頸動脈結(jié)扎方法）［4］建立模型。采用10%水合氯醛（0.35 g/kg）腹腔注射麻醉實驗大鼠，仰臥位固定，將頸前部的毛發(fā)剃除干凈、消毒、切開皮膚，鈍性分離雙側(cè)頸總動脈，分別結(jié)扎近心端與遠心端，剪斷其中間阻斷血流，縫合皮膚、消毒。假手術(shù)組只進行上述相應(yīng)的手術(shù)步驟，不進行結(jié)扎，只分離暴露雙側(cè)頸總動脈阻斷其血流供應(yīng)。

2.2 分組 造模成功后將實驗大鼠隨機分為4組：模型對照組、假手術(shù)組、益肺宣肺降濁方組、安理申組，每組25只。益肺宣肺降濁方組:劑量為1.5 g/（kg·d），每天灌胃1次，灌胃容量為10ml/kg；安理申組：劑量為0.4mg/（kg·d），分2次灌胃，灌胃容量為10m l/kg；模型對照組及假手術(shù)組:給予等容量的生理鹽水灌胃，1次/天。各組均連續(xù)灌胃28 d。

2.3 標本采集及指標檢測 末次灌胃24 h后，麻醉并處死大鼠，斷頭取腦組織，去除嗅球和小腦，取大鼠缺血側(cè)大腦作VEGF測定，主要取大鼠大腦的海馬區(qū)的組織，常規(guī)切片脫蠟、染色、封片，在光鏡下觀察30個視野，運用陽性細胞計數(shù)法，取每個視野的陽性細胞均值作為計數(shù)。按線粒體提取試劑盒說明書提取各組海馬和大腦皮層部位的線粒體，按試劑盒說明書采用比色法檢測線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ的活性和ATP的含量。

2.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料采用均數(shù)±標準差（）表示，所有的統(tǒng)計檢驗均采用雙側(cè)檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié) 果

3.1 各組大鼠海馬區(qū)域VEGF陽性細胞數(shù)比較 見表1。與模型對照組比較，安理申組和益肺宣肺降濁方組VEGF陽性細胞數(shù)明顯增多（P＜0.05）。

表1 各組大鼠海馬區(qū)域VEGF陽性細胞數(shù)（）

表1 各組大鼠海馬區(qū)域VEGF陽性細胞數(shù)（）

注：與模型對照組比較，①P＜0.05

組別假手術(shù)組模型對照組安理申組益肺宣肺降濁方組n 25 25 25 25 VEGF陽性細胞數(shù)7.820.63 25.340.86 45.674.59①42.384.26①

3.2 各組大鼠海馬組織ATP含量及線粒體復(fù)合物Ⅰ～Ⅴ活性比較 見表2。與假手術(shù)組比較，模型對照組大鼠海馬組織ATP含量及線粒體呼吸鏈各復(fù)合物的活性均明顯降低（P＜0.05）；與模型對照組比較，安理申組及益肺宣肺降濁方組大鼠海馬組織線粒體復(fù)合物Ⅰ～Ⅴ的活性及ATP含量明顯升高，有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表2 各組大鼠海馬組織ATP含量及線粒體復(fù)合物Ⅰ～Ⅴ活性比較（）

表2 各組大鼠海馬組織ATP含量及線粒體復(fù)合物Ⅰ～Ⅴ活性比較（）

注：與假手術(shù)組比較，①P＜0.05；與模型對照組比較，②P＜0.05

組 別假手術(shù)組模型對照組安理申組益肺宣肺降濁方組n 25 25 25 25線粒體復(fù)合物Ⅰ（U/g）56.98±14.86 35.25±7.96①49.65±3.84②45.92±10.36②線粒體復(fù)合物Ⅱ（U/g）12.96±2.39 4.59±2.03①8.59±0.88②13.63±3.65②線粒體復(fù)合物Ⅲ（U/g）10.21±2.01 5.57±1.89①10.94±3.24②9.25±3.82②線粒體復(fù)合物Ⅳ（U/g）11.68±2.50 5.96±1.59①13.05±0.96②13.11±4.26②線粒體復(fù)合物Ⅴ（U/g）389.26±25.75 96.38±16.35①625.63±148.36②1213.63±126.50②ATP（μmol/g）1.35±0.56 0.53±0.13①1.53±0.39②1.20±0.33②

4 討論

VD屬于中醫(yī)學“癡呆”范疇，唐農(nóng)教授從“肺主宣降”“肺朝百脈”的中醫(yī)理論觀點出發(fā)，認為肺氣虛損在VD的發(fā)生發(fā)展中起著非常重要的作用。肺主氣、司呼吸，肺的功能受損，宣發(fā)肅降失常，則清氣不升，濁氣不降，痰濁內(nèi)停，阻閉經(jīng)絡(luò)，導致臟腑的功能失調(diào)。肺失宣降，腦髓失養(yǎng)，痰濁內(nèi)停，易使神機受損而致癡呆?！鹅`樞·天年》有言：“肺氣衰，魄離，故言善誤”，而“言善誤”正是癡呆病的重要癥狀，故認為癡呆乃肺氣虛，腦海失養(yǎng)所致。

基于以上認識，近年來課題組以宣肺降濁法防治VD已取得了一定的研究成果［5］。益肺宣肺降濁方組成如下：桔梗10 g，杏仁10 g，人參15 g，麥冬15 g，黃芪15 g，三七15 g，蘇子15 g，石菖蒲15 g，酒大黃6 g。其中人參、黃芪為君，補益肺臟之氣陰，治其本虛；麥冬、桔梗、杏仁、蘇子為臣，宣降肺氣，調(diào)節(jié)氣機；酒大黃通腑導滯、解毒降濁，石菖蒲、三七調(diào)暢全身氣機，活血通滯，為佐使。全方辛開苦降，攻補兼施，氣血同治、臟腑同調(diào)，組方嚴謹，與“從肺論治癡呆”的理論絲絲相扣。

血管性癡呆主要是由于各種腦血管疾病引起，尤其對海馬部位的損害大，從而導致學習、行為能力下降。VEGF是一種刺激血管內(nèi)皮生長、促進血管生長的蛋白，是大腦缺血后重要調(diào)控因子之一，當血管中缺血缺氧發(fā)生后VEGF的表達會增多。線粒體是腦組織中細胞能量生成的主要場所，有研究指出［6］，缺血大鼠海馬組織中線粒體丙酮酸脫氫酶蛋白水平降低，氧化應(yīng)激水平增加。由于線粒體的氧化代謝障礙，導致線粒體動力學發(fā)生異常，直接影響神經(jīng)元凋亡和損害，從而致使VD發(fā)病。本研究結(jié)果表明，益肺宣肺降濁方能上調(diào)VEGF表達，顯著升高線粒體復(fù)合物Ⅰ～Ⅴ的活性及ATP含量，發(fā)揮抗VD的作用從而保護腦部神經(jīng)細胞，改善腦代謝，減輕氧化損傷，這可能是該方治療血管性癡呆的作用機制之一。