正交試驗(yàn)優(yōu)選十味參歸灌腸液的乙醇提取工藝

何艷春，莫秋瑜，黃瑞松

（1.南寧市婦幼保健院，廣西 南寧 530011；2.廣西民族醫(yī)藥研究院，廣西 南寧 530001）

盆腔炎為婦科常見疾病，包括盆腔結(jié)締組織炎、盆腔腹膜炎、子宮炎及輸卵管卵巢炎等，發(fā)病率高。盆腔炎相當(dāng)于中醫(yī)學(xué)“帶下”“痛經(jīng)”“癥瘕”等范疇，因熱伏胞中，毒邪感染，影響氣血運(yùn)行，致使氣血瘀滯、沖任受損而發(fā)病。十味參歸灌腸液為南寧市婦幼保健院治療盆腔炎的驗(yàn)方，臨床療效確切。為進(jìn)一步促進(jìn)該驗(yàn)方的臨床應(yīng)用，該院擬將其開發(fā)為醫(yī)院制劑，對(duì)其制備工藝進(jìn)行研究。十味參歸灌腸液處方由丹參、延胡索、當(dāng)歸等10味中藥組成，其中當(dāng)歸等8味藥材適合使用水提醇沉工藝，而丹參、延胡索2味藥水提取效果不佳。丹參主要有效成分為含二萜類酯溶性及酚酸類水溶性化合物，包括丹參酮ⅡA、丹酚酸B等［1］，延胡索主要有效成分為延胡索乙素，這2味藥材所含有效成分均溶于乙醇，故應(yīng)選用乙醇回流法進(jìn)行提取?，F(xiàn)本文對(duì)十味參歸灌腸液的醇提工藝進(jìn)行研究，以丹酚酸B和延胡索乙素得率作為考核指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)法對(duì)可能影響丹酚酸B、延胡索乙素得率的藥材粉碎度、乙醇濃度、乙醇用量、回流次數(shù)、回流時(shí)間等5個(gè)因素進(jìn)行考察。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 儀器和材料

1.1 儀器 LC-20AT高效液相色譜儀（島津公司）；XS205電子分析天平（梅特勒公司）；SB3200DTS雙頻超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 材料 丹參、延胡索由南寧生源中藥飲片有限責(zé)任公司提供；丹酚酸B（批號(hào)：ES-12020104）由上海億欣生物科技有限公司提供；延胡索乙素（批號(hào)：110726-201112）由中國藥品生物制品檢定所提供；甲醇、乙腈為色譜純；水為超純水；其他所用化學(xué)試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 因素水平 選擇藥材粉碎度、乙醇濃度、乙醇用量、回流次數(shù)、回流時(shí)間作為影響因素，每個(gè)因素取兩個(gè)水平，選用L8（2）7正交表進(jìn)行試驗(yàn)，考核指標(biāo)為丹酚酸B和延胡索乙素的得率。因素水平見表1。

表1 因素水平表

2.2 樣品溶液的制備 分別稱取延胡索、丹參各1.5 g，精密稱定，參照正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案（表2）進(jìn)行乙醇回流提取，濾過，合并濾液，各加入相應(yīng)濃度乙醇定容至50m l，作為樣品溶液。

2.3 丹酚酸B的含量測定

2.3.1 溶液制備 供試品溶液的制備：精密吸取2.2項(xiàng)下樣品溶液1.5ml，加相應(yīng)濃度的乙醇定容至10m l，即得。對(duì)照品溶液的制備：取丹酚酸B對(duì)照品適量，加75%甲醇制成濃度為0.162mg/ml的溶液，即得。陰性溶液的制備：取缺丹參的樣品1.5 g，精密穩(wěn)定，照2.2項(xiàng)下方法制備成陰性溶液。

2.3.2 測定方法 采用《中華人民共和國藥典》2010年版丹參項(xiàng)下的HPLC法［2］70-71測定。色譜條件：色譜柱為菲羅門GeminiC18（4.6mm×250mm，5μm），流動(dòng)相為甲醇∶乙腈∶甲酸∶水（30∶10∶1∶59），流速為1.0m l/min，檢測波長為286 nm，柱溫為室溫，進(jìn)樣量為10μl。分別精密吸取供試品溶液、對(duì)照品溶液和陰性溶液各10μl進(jìn)樣測定，色譜圖見圖1。結(jié)果顯示，陰性溶液對(duì)測定無干擾。

圖1 丹酚酸B含量測定色譜圖

2.4 延胡索乙素的含量測定

2.4.1 溶液制備 供試品溶液的制備：取2.2項(xiàng)下樣品溶液，即為供試品溶液。對(duì)照品溶液的制備：取延胡索乙素對(duì)照品適量，加甲醇制成濃度為44μg/ml的溶液，即得。陰性溶液的制備：取不含延胡索的樣品1.5 g，精密穩(wěn)定，照2.2項(xiàng)下方法制備成陰性溶液。

2.4.2 測定方法 按照《中華人民共和國藥典》2010年版延胡索項(xiàng)下的HPLC法［2］130進(jìn)行測定。色譜條件：色譜柱為菲羅門GeminiC18（4.6mm×250mm，5μm），流動(dòng)相為甲醇∶0.1%磷酸溶液（60∶40），流速為1.0m l/min，檢測波長為280 nm，柱溫為室溫，進(jìn)樣量為20μl。分別精密吸取供試品溶液、對(duì)照品溶液和陰性溶液各20μl進(jìn)樣測定，色譜圖見圖2。結(jié)果顯示，陰性溶液對(duì)測定無干擾。

圖2 延胡索乙素含量測定色譜圖

2.5 正交試驗(yàn)方案與結(jié)果 見表2。

結(jié)果顯示：正交表中各試驗(yàn)序列溶液中，丹酚酸B得率在3.099 8%～3.690 0%之間，影響提取效果的因素順序?yàn)镈（回流次數(shù)）＞E（回流時(shí)間）＞C（乙醇用量）＞A（藥材粉碎度）＞B（乙醇濃度），主要的影響因素為提取次數(shù)，次要因素為提取時(shí)間，5個(gè)影響因素之間無顯著差異，故可任意組合工藝條件。延胡索乙素得率在0.063 8%～0.082 1%之間，影響提取效果的因素順序?yàn)锳（藥材粉碎度）＞B（乙醇濃度）＞C（乙醇用量）＞E（回流時(shí)間）＞D（回流次數(shù)），粉碎度對(duì)提取效果影響顯著，其次為乙醇濃度。除了D（回流次數(shù)）因素以外，其他因素對(duì)乙醇回流提取工藝均有顯著性差異，最佳組合條件為A2B1C2D1（或D2）E2。經(jīng)綜合分析，乙醇回流提取條件只對(duì)延胡索乙素的得率有影響（除回流次數(shù)外），而對(duì)丹酚酸B的得率無顯著影響。故確定最佳提取工藝條件為A2B1C2D1E2，即延胡索粉碎過10目篩、丹參切片為2mm，乙醇濃度為70%，加入乙醇量第一次為藥材量的6倍，第二次為5倍，回流提取2次，每次1.5 h。

表2 正交試驗(yàn)方案與結(jié)果

2.6 驗(yàn)證試驗(yàn) 按處方的3/10比例取丹參、延胡索各1.5 g藥材，精密稱定，按正交試驗(yàn)所優(yōu)選的最佳工藝條件制備成樣品溶液，并照相應(yīng)的方法分別測定丹酚酸B和延胡索乙素的得率。結(jié)果見表3。驗(yàn)證試驗(yàn)制備的供試品溶液丹酚酸B的得率為3.663 0%，延胡索乙素的得率為0.089 7%，結(jié)果與正交試驗(yàn)的最大得率接近。表明正交試驗(yàn)篩選的最佳乙醇回流提取工藝條件是科學(xué)可行的。

表3 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

3 討 論

十味參歸灌腸液處方中，丹參為君藥，具有活血祛瘀、涼血消癰、安神寧心、排膿、止痛等功效［3］，其有效成分丹參酮ⅡA具有改善血液循環(huán)、抗凝抗血栓等藥理作用，為活血化瘀的主要有效成分。水提法對(duì)丹參酮ⅡA等脂溶性成分的提取效果不佳，醇提法可兼顧丹參脂溶性成分和水溶性成分的提取效果，同時(shí)降低生產(chǎn)成本［4-5］。謝靜［6］研究表明，以低濃度醇作為溶劑的丹參提取物，丹酚酸B的提取率明顯高于以水為溶劑的提取物。延胡索具有活血行氣、止痛等功效，其有效成分延胡索乙素具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛作用［7］，延胡索乙素水提效果極差，使用乙醇回流提取效果好。

本研究以丹酚酸B和延胡索乙素作為考核指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)方法，考察了藥材粉碎度、乙醇濃度、乙醇用量、回流次數(shù)、回流時(shí)間5個(gè)因素對(duì)十味參歸灌腸液乙醇回流提取工藝的影響，并經(jīng)過驗(yàn)證試驗(yàn)證明，篩選出的最佳工藝條件科學(xué)合理，可作為十味參歸灌腸液乙醇回流提取的制備工藝條件。