高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測綠茶中硝苯地平

劉超，景贊，呂雪梅

（樂山市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，四川樂山 614000）

茶葉作為中華民族的傳統(tǒng)保健飲料，已經(jīng)有四五千年的歷史[1]。綠茶作為茶葉的一種，具有降血脂、抗衰老、瘦身降脂等功效，尤其是在夏季，更是除熱解暑之良品，因而受到人們的喜愛。流行病學(xué)研究、臨床干預(yù)試驗(yàn)和動(dòng)物試驗(yàn)均證實(shí)，綠茶還有降血壓的作用[2-4]。

高血壓是心腦血管病最重要的危險(xiǎn)因素[5]，硝苯地平作為一種治療高血壓的高效藥物，被廣泛應(yīng)用在高血壓等的臨床治療中。近兩年，風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測顯示市面上陸續(xù)出現(xiàn)了添加硝苯地平等二氫吡啶類降血壓藥物的綠茶。目前，硝苯地平的檢測方法研究主要集中在中藥或保健品方面，主要有薄層色譜法[6]、高效液相色譜法[7]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[8]等方法，目前還未發(fā)現(xiàn)綠茶中硝苯地平的權(quán)威檢測方法。本試驗(yàn)建立了綠茶中硝苯地平的檢測方法，為制定綠茶中硝苯地平檢測的國家標(biāo)準(zhǔn)或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)等提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇，色譜純，CAEQ-4-003302-4000，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；乙酸，色譜純，CAEQ-4-014048-4000，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；硝苯地平，50 mg、99.50%，Lot：SM180412，Stanford Analytical Chemicals InC 生產(chǎn)。丙酮，色譜純，CAS 編號為67-64-1，成都市科隆化學(xué)品有限公司；二氯甲烷，色譜純，CAS 編號為75-09-2，成都市科隆化學(xué)品有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

CARB-NH2固相萃取柱（500 mg/6 mL），WGCN6550，深圳普分科技有限公司；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，AB公司API3200；電子天平（精確度0.01 mg），德國賽多利斯集團(tuán)BT25S；電子天平（精確度0.1 mg），德國賽多利斯集團(tuán)BSA224S；固相萃取儀（ZGCQ-12D），上海梓桂儀器有限責(zé)任公司；高速離心機(jī)（TGL-16M），湖南湘儀集團(tuán)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（EV331），萊博泰克科技有限公司；氮吹儀（WD-12），杭州奧盛儀器有限公司。

1.3 色譜條件

色譜柱：Inertsil ODS-3（150 mm×2.1 mm，5.0 μm）；流動(dòng)相：A-乙腈，B-0.2%乙酸水溶液；梯度洗脫條件如表1 所示。流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣體積：5 μL。

表1 梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution condition

1.4 質(zhì)譜條件

DGU20A-API3200 質(zhì)譜儀。掃描方式：ESI 正離子模式；毛細(xì)管電壓：4.5 kV；離子源溫度：450 ℃；氣簾氣：30 psi；碰撞氣：5 psi；霧化氣：30 psi；輔助氣：3 psi。硝苯地平的質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 硝苯地平的質(zhì)譜參數(shù)Table 2 Mass spectrum parameters of nifedipine

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制

1.5.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備液的制備（0.4 mg/mL）

精密稱取10 mg 硝苯地平至25 mL 棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，冷藏保存。

1.5.2 標(biāo)準(zhǔn)中間溶液的制備（100 ng/mL）

吸取12.5 μL 的儲備液至50 mL 棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度。

1.5.3 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的制備

精密稱取6 份不含硝苯地平的綠茶1 g，置于50 mL塑料離心管中，分別加入10、20、40、80、100、200 μL 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，加入甲醇溶液10 mL，振蕩5 min，超聲提取15 min 后，以4 000 r/min 離心5 min，上清液轉(zhuǎn)移至雞心瓶中，殘?jiān)?0 mL 甲醇再提取1 次，上清液轉(zhuǎn)移至上述雞心瓶中，將上述上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至5 mL 左右。用10 mL 丙酮-二氯甲烷（3：1）以3 mL/min 速度活化CARB-NH2固相萃取柱（500 mg/3 mL），將上述5 mL 旋蒸液以1 mL/min 的速度過柱，用6 mL 丙酮-二氯甲烷洗脫小柱，接收全部洗脫液，氮吹儀吹干，用甲醇定容至1 mL，過0.22 μm 的有機(jī)相微孔濾膜，濾液待上機(jī)分析，配成1、2、4、8、10、20 ng/mL 的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6 樣品制備

1.6.1 超聲提取

精密稱取粉碎的綠茶1 g 至50 mL 塑料離心管中，加入甲醇溶液10 mL，振蕩5 min，超聲（700 W）15 min后，以4 000 r/min 離心5 min，上清液轉(zhuǎn)移至雞心瓶中，殘?jiān)?0 mL 甲醇再提取1 次，上清液轉(zhuǎn)移至上述雞心瓶中，將上述上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至5 mL 左右。

1.6.2 凈化

試驗(yàn)采用CARB-NH2作為去除色素的固相萃取柱[9]。用10 mL 丙酮-二氯甲烷（3：1）以3 mL/min 速度活化CARB-NH2固相萃取柱（500 mg/3 mL），將上述5 mL旋蒸液以1 mL/min 的速度過柱，用6 mL 丙酮-二氯甲烷洗脫小柱，接收全部洗脫液，氮吹儀吹干，甲醇定容至1 mL，過0.22 μm 的有機(jī)相微孔濾膜，濾液待上機(jī)分析。

1.7 方法學(xué)考察

1.7.1 檢出限與定量限

用處理好的不含硝苯地平的空白樣品溶液將1 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液稀釋至產(chǎn)生3 倍信噪比（S/N）和10 倍信噪比（S/N）。此時(shí)所對應(yīng)的濃度分別為儀器檢出限和儀器定量限。

1.7.2 回收率與重復(fù)性

精密稱取6 份粉碎后的綠茶各1 g，置于6 個(gè)50 mL塑料離心管中，分別加入20 μL 的硝苯地平中間液，按照1.6 樣品制備的步驟，制成6 個(gè)2 ng/mL 的低水平質(zhì)控樣；按上述步驟分別制備成4 ng/mL 的中水平質(zhì)控樣、8 ng/mL 的高水平質(zhì)控樣[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性關(guān)系

由試驗(yàn)結(jié)果知，硝苯地平在1～20 ng/mL 的濃度范圍內(nèi)，回歸方程為y=2 570x+1 690，線性相關(guān)系數(shù)為0.999 6，可見硝苯地平在上述濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2 檢出限和定量限

按1.7.1 步驟進(jìn)行處理，結(jié)果顯示，硝苯地平的方法檢出限為13.8 μg/kg，定量限為46.0 μg/kg。

2.3 回收率

表3 不同濃度下的硝苯地平回收率結(jié)果（n=6）Table 3 Recoveries of nifedipine at different concentration levels（n=6）

由表3 可以看出，硝苯地平在3 個(gè)水平上的回收率均在83.5%～89.6%之間。而在80%～110%之間，說明試驗(yàn)方法準(zhǔn)確性滿足要求；同時(shí)，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.16%～3.98%，均小于5%，表明該方法重復(fù)性良好。

3 結(jié)論

本研究針對茶葉中硝苯地平的非法添加情況建立了特異性強(qiáng)的液質(zhì)聯(lián)用法。此方法的方法學(xué)考察均符合要求，完全能滿足綠茶中硝苯地平檢測要求，為綠茶中硝苯地平的質(zhì)量控制提供了理論參考，但綠茶中其它二氫吡啶類及復(fù)合二氫吡啶類降血壓藥物的檢測仍需進(jìn)一步研究。