鹽酸地巴唑原料藥和片劑中有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定及最大未知雜質(zhì)結(jié)構(gòu)的推測(cè)

陳宇堃 梁蔚陽

摘 要 目的：建立測(cè)定鹽酸地巴唑原料藥及片劑中有關(guān)物質(zhì)的方法，并對(duì)其最大未知雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行推測(cè)。方法：采用高效液相色譜法測(cè)定鹽酸地巴唑原料藥及片劑中的有關(guān)物質(zhì)（鄰苯二胺、苯乙酸），色譜柱為KromasilC18，流動(dòng)相為水-甲醇-冰醋酸-三乙胺（45 ∶ 55 ∶ 0.5 ∶ 0.5，V/V/V/V），流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。采用超高效液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜法、氫譜、碳譜推測(cè)最大未知雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)，色譜柱為Waters Acquity UPLC BEH C18，流動(dòng)相為水-甲醇（45 ∶ 55，V/V），流速為0.2 mL/min，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為1 μL，離子源為電噴霧離子源（ESI），掃描模式為負(fù)離子掃描模式，一級(jí)質(zhì)譜掃描范圍為m/z 100～800，毛細(xì)管電壓為3 000 V，離子源溫度為100 ℃，去溶劑氣體為氮?dú)猓ト軇怏w流速為600 L/h，錐孔流速為50 L/h。結(jié)果：鄰苯二胺、苯乙酸、鹽酸地巴唑檢測(cè)質(zhì)量濃度的線性范圍為0.427～4.27 μg/mL（r=0.998 9）、0.403～4.03 μg/mL（r=0.998 9）、0.82～8.20 μg/mL（r=0.999 9）;定量限分別為0.042 7、0.134 3、0.088 7 μg/mL，檢測(cè)限分別為0.021 4、0.067 1、0.044 3 μg/mL;精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、耐用性試驗(yàn)的RSD均小于2%;鄰苯二胺的加樣回收率為98.31%～102.81%（RSD=1.60%，n=9）、苯乙酸為99.78%～102.23%（RSD=0.70%，n=9）。6批鹽酸地巴唑原料藥中均未檢出鄰苯二胺，苯乙酸含量為0～0.04%，最大未知雜質(zhì)含量為0.05%～0.25%，未知雜質(zhì)總量為0.05%～0.31%;77批鹽酸地巴唑片劑中，鄰苯二胺含量為0～0.11%，苯乙酸含量為0～0.03%，最大未知雜質(zhì)含量為0.06%～0.51%，未知雜質(zhì)總量為0.10%～0.62%。推測(cè)最大未知雜質(zhì)為2-（羥苯基甲基）苯并咪唑（羥芐唑）。結(jié)論：所建方法快速、準(zhǔn)確、專屬性好，可用于測(cè)定鹽酸地巴唑原料藥及片劑中的有關(guān)物質(zhì)。最大未知雜質(zhì)可能為苯并咪唑類化合物。

關(guān)鍵詞 鹽酸地巴唑原料藥;鹽酸地巴唑片劑;高效液相色譜法;有關(guān)物質(zhì);超高效液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜法;雜質(zhì);結(jié)構(gòu)鑒定

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To establish a method for the determination of related substances in dibasol hydrochloride raw materials and tablets， and to predict the maximum unknown impuritys structure. METHODS： The related substances （o-phenylenediamine， phenylacetic acid）in dibasol hydrochloride raw materials and tablets were determined by HPLC. The determination was performed on Kromasil C18 column with mobile phase consisted of mobile phase-methanol-glacial acetic acid-triethylamine （45 ∶ 55 ∶ 0.5 ∶ 0.5， V/V/V/V） at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 220 nm， and column temperature was 30 ℃. Sample size was 10 μL. UPLC-TOF-MS， 1H-NMR and 13C-NMR were used for structure prediction. The determination was performed on Waters Acquity UPLC BEH C18 column with mobile phase consisted of water-methanol （45 ∶ 55， V/V） at the flow rate of 0.2 mL/min. The column temperature was 30 ℃， and sample size was 1 μL. The ion source was electrospray ion source. The scanning mode was negative ion scanning mode. The first-order mass spectrum scanning range was m/z 100-800， the capillary voltage was 3 000 V， the source temperature was 100 ℃， the desolvent gas was nitrogen， and the solvent free gas flow rate was 600 L/h. The flow rate of the conical orifice was 50 L/h. RESULTS： The linear range of o-phenylenediamine， phenylacetic acid and dibasol hydrochlo- ride were 0.427-4.27 μg/mL（r=0.998 9）， 0.403-4.03 μg/mL（r=0.998 9） and 0.82-8.20 μg/mL（r=0.999 9）， respec-tively. The limits of quantitation were 0.042 7， 0.134 3， 0.088 7 μg/mL. The limits of detection were 0.021 4， 0.067 1， 0.044 3 μg/mL. RSDs of precision， stability， reproducibility and durability tests were all less than 2%. The average recoveries were 98.31%- 102.81% for o-phenylenediamine（RSD=1.60%，n=9）， and? 99.78%-102.23% for phenylacetic acid（RSD=0.70%，n=9）. No o-phenylenediamine was detected in 6 batches of dibazol hydrochloride raw materials; the contents of phenylacetic acid were 0-0.04%; the contents of maximum unknown impurity were 0.05%-0.25%; total contents of unknown impurity were 0.05%-0.31%. In 77 batches of Dibasol hydrochloride tablets， the contents of o-phenylenediamine were 0-0.11%， the contents of phenylacetic acid were 0-0.03%; the contents of maximum unknown impurity were 0.06%-0.51%; total contents of unknown impurity were 0.10%-0.62%. It was speculated that maximum unknown impurity was 2-（hydroxyphenylmethyl） benzimidazole （hydrobenzde）. CONCLUSIONS： Established method is rapid， accurate and specific， and can be used for the determination of related substances in dibasol hydrochloride raw materials and tablets. The maximum unknown impurity may be benzimidazoles.

KEYWORDS? ?Dibasol hydrochloride raw materials; Dibasol hydrochloride tablets; HPLC; Related substance; UPLC-TOF-MS; Impurity; Structure identification

地巴唑?yàn)檠軘U(kuò)張降壓藥，具有直接松弛血管平滑肌的作用，可通過降低外周阻力而降低血壓，緩解胃腸平滑肌痙攣，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)有輕度興奮作用[1]。該藥主要用于治療輕度高血壓、腦血管痙攣、胃腸平滑肌痙攣、脊髓灰質(zhì)炎后遺癥、外周顏面神經(jīng)麻痹和妊娠后高血壓綜合征[2]。有研究發(fā)現(xiàn)，地巴唑的血管舒張作用可能與其可通過非活化鈣通道而阻斷鈣離子進(jìn)入平滑肌細(xì)胞有關(guān)[3]。近年來，臨床發(fā)現(xiàn)其在預(yù)防腦缺血疾病方面具有積極作用[4]。也有研究發(fā)現(xiàn)，地巴唑聯(lián)合養(yǎng)血清腦顆粒可用于治療血管性頭痛[5]。

鄰苯二胺與苯乙酸是鹽酸地巴唑的合成原料，兩者在氮?dú)獗Ｗo(hù)下于160～240 ℃加熱數(shù)小時(shí)后可得到地巴唑，再加入適量稀鹽酸，經(jīng)重結(jié)晶后即可得鹽酸地巴唑，也是其有關(guān)物質(zhì)的來源[6]。雖然，鹽酸地巴唑原料藥收載于《國家藥品標(biāo)準(zhǔn)修訂件》[7]中，但僅涉及干燥失重、熾灼殘?jiān)?、重金屬與砷鹽檢查項(xiàng);鹽酸地巴唑片收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)—化學(xué)藥品及標(biāo)準(zhǔn)》[8]中，但僅有重量差異與崩解時(shí)限檢查項(xiàng);此外，上述兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)制定時(shí)間久遠(yuǎn)，一直未有更新，且均缺乏有關(guān)物質(zhì)、雜質(zhì)檢查項(xiàng)。基于此，本研究采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定了鹽酸地巴唑原料藥及片劑中的有關(guān)物質(zhì)，并以超高效液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜法（UPLC-TOF-MS）、氫譜（1H-NMR）和碳譜（13C-NMR）對(duì)其中峰面積最大的未知雜質(zhì)（以下簡(jiǎn)稱“最大未知雜質(zhì)”）的結(jié)構(gòu)進(jìn)行推測(cè)，旨為其質(zhì)量控制的完善提供參考。

1 材料

1.1 儀器

2695型HPLC儀（包括2478型紫外檢測(cè)器、Empower 2色譜工作站）、E2695型HPLC儀（包括2998型二極管陣列檢測(cè)器、Empower 2色譜工作站）均購自美國Waters公司;Acquity H Class UPLC/ G2 QTof型UPLC-TOF- MS儀（美國Waters公司）;AVANCE Ⅲ HD 600型超導(dǎo)脈沖傅里葉變換核磁共振譜儀（瑞士Bruker公司）;CAP225D型十萬分之一電子天平（德國Sartorius公司）;ED53型干燥箱（德國Binder公司）。

1.2 藥品與試劑

鹽酸地巴唑?qū)φ掌罚ㄖ袊称匪幤窓z定研究院，批號(hào)：100420-201002，純度：98.9%）;鄰苯二胺對(duì)照品（江陰市華亞化工有限公司，批號(hào)：10511140401，純度：99.3%）;苯乙酸對(duì)照品（河北誠信有限責(zé)任公司，批號(hào)：12011140501，純度：99.5%）;鹽酸地巴唑原料藥6批（企業(yè)A，批號(hào)：A1～A3;企業(yè)B，批號(hào)：B01～ B03）、鹽酸地巴唑片77批（企業(yè)B，批號(hào)：B1～B7;企業(yè)C，批號(hào)：C1～ C7;企業(yè)D，批號(hào)：D1～ D8;企業(yè)E，批號(hào)：E1;企業(yè)F，批號(hào)：F1;企業(yè)G，批號(hào)：G1～ G6;企業(yè)H，批號(hào)：H1～ H12;企業(yè)I，批號(hào)：I1;企業(yè)J，批號(hào)：J1～J8;企業(yè)K，批號(hào)：K1～K10;企業(yè)L，批號(hào)：L1～L16），規(guī)格均為每片含鹽酸地巴唑10 mg;最大未知雜質(zhì)（企業(yè)A，批號(hào)：A01）;亮氨酸腦啡肽溶液（美國Waters公司，批號(hào)：W27011702）;甲醇、冰醋酸、三乙胺均為色譜純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 有關(guān)物質(zhì)測(cè)定的HPLC色譜條件

色譜柱：Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動(dòng)相：水-甲醇-冰醋酸-三乙胺（45 ∶ 55 ∶ 0.5 ∶ 0.5，V/V/V/V）;流速：1.0 mL/min;柱溫：30 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng)：220 nm;進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 系統(tǒng)適用性混合對(duì)照品溶液 取鄰苯二胺、苯乙酸、鹽酸地巴唑?qū)φ掌愤m量，加流動(dòng)相溶解，制成鄰苯二胺、苯乙酸、鹽酸地巴唑質(zhì)量濃度分別為1.5、1.5、1 000 μg/mL的系統(tǒng)適用性混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 混合對(duì)照品貯備液 分別精密稱取鄰苯二胺、苯乙酸對(duì)照品適量，加流動(dòng)相溶解，制成鄰苯二胺、苯乙酸質(zhì)量濃度均為0.15 mg/mL的混合對(duì)照品貯備液。

2.2.3 混合對(duì)照品溶液 精密量取“2.2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品貯備液適量，另取鹽酸地巴唑?qū)φ掌愤m量，置于100 mL量瓶中，加流動(dòng)相溶解，制成鄰苯二胺、苯乙酸、鹽酸地巴唑質(zhì)量濃度分別為1.5、1.5、5 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.2.4 原料藥供試品溶液 精密稱取鹽酸地巴唑原料藥適量，加流動(dòng)相溶解，制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的原料藥供試品溶液。

2.2.5 片劑供試品溶液 取鹽酸地巴唑片50片，精密稱定，置于研缽中研磨，取適量，加流動(dòng)相溶解，制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的片劑供試品溶液。

2.2.6 陰性對(duì)照溶液 按企業(yè)J的處方工藝，制備缺鹽酸地巴唑的陰性樣品，按“2.2.5”項(xiàng)下方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

取“2.2.1”項(xiàng)下系統(tǒng)適用性混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，于200～300 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描。結(jié)果，鄰苯二胺于212.6 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，苯乙酸與單個(gè)最大未知雜質(zhì)均于219.6 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，鹽酸地巴唑于222.8 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，故選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm，詳見圖1。

2.4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

分別取“2.2”項(xiàng)下系統(tǒng)適用性混合對(duì)照品溶液、混合對(duì)照品溶液、原料藥供試品溶液、片劑供試品溶液、陰性對(duì)照溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，詳見圖2。由圖2可知，鄰苯二胺峰、苯乙酸峰、最大未知雜質(zhì)峰與鹽酸地巴唑峰的分離度均大于5.52，理論板數(shù)均大于6 800，陰性對(duì)照對(duì)測(cè)定無干擾。

2.5 破壞性試驗(yàn)

2.5.1 酸破壞樣品溶液的制備 取鹽酸地巴唑原料藥（批號(hào)：A1）適量，加入1 mol/L鹽酸溶液1 mL，放置1 h后，加入1 mol/L氫氧化鈉溶液中和，加流動(dòng)相稀釋，制成鹽酸地巴唑質(zhì)量濃度為1 mg/mL的酸破壞樣品溶液。

2.5.2 堿破壞樣品溶液的制備 取鹽酸地巴唑原料藥（批號(hào)：A1）適量，加入1 mol/L氫氧化鈉溶液1 mL，放置1 h后，加入1 mol/L鹽酸溶液中和，加流動(dòng)相稀釋，制成鹽酸地巴唑質(zhì)量濃度為1 mg/mL的堿破壞樣品溶液。

2.5.3 氧化破壞樣品溶液的制備 取鹽酸地巴唑原料藥（批號(hào)：A1）適量，加入30%過氧化氫溶液1 mL，放置1 h后，加流動(dòng)相稀釋，制成鹽酸地巴唑質(zhì)量濃度為1 mg/mL的氧化破壞樣品溶液。

2.5.4 高溫破壞（固體）樣品溶液的制備 取鹽酸地巴唑原料藥（批號(hào)：A1）適量，于105 ℃干燥箱中放置24 h后，加流動(dòng)相稀釋，制成鹽酸地巴唑質(zhì)量濃度為1 mg/mL的高溫破壞（固體）樣品溶液。

2.5.5 高溫破壞（液體）樣品溶液的制備 取鹽酸地巴唑原料藥（批號(hào)：A1）適量，加入流動(dòng)相5 mL，置于100 ℃水浴中加熱1 h，加流動(dòng)相稀釋，制成鹽酸地巴唑質(zhì)量濃度為1 mg/mL的高溫破壞（液體）樣品溶液。

2.5.6 光照破壞樣品溶液的制備 取鹽酸地巴唑原料藥（批號(hào)：A1）適量，于4 000 lx光照下放置1 d，加流動(dòng)相稀釋，制成鹽酸地巴唑質(zhì)量濃度為1 mg/mL的光照破壞樣品溶液。

2.5.7 未破壞樣品溶液的制備 取鹽酸地巴唑原料（批號(hào)：A1）適量，加流動(dòng)相稀釋，制成鹽酸地巴唑質(zhì)量濃度為1 mg/mL的未破壞樣品溶液。

2.5.8 破壞性試驗(yàn) 取上述各樣品溶液10 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，詳見圖3。由圖3可知，鹽酸地巴唑原料藥在氧化破壞條件下未知雜質(zhì)數(shù)目及總量增加，其他破壞條件下均無明顯變化;保留時(shí)間8.1 min處對(duì)應(yīng)的色譜峰為鹽酸地巴唑原料藥中的最大未知雜質(zhì)峰，經(jīng)酸、堿、氧化、高溫、光照破壞后該峰的峰面積無明顯變化，推測(cè)該峰可能為鹽酸地巴唑在工藝過程中產(chǎn)生的雜質(zhì)。

2.6 線性關(guān)系考察

精密稱取鄰苯二胺、苯乙酸、鹽酸地巴唑?qū)φ掌愤m量，加流動(dòng)相溶解，制成鄰苯二胺、苯乙酸、鹽酸地巴唑質(zhì)量濃度分別為0.427～4.27、0.403～4.03、0.82～8.20 μg/mL的線性關(guān)系混合工作溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以各待測(cè)成分質(zhì)量濃度（C，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（A）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果，鄰苯二胺的回歸方程為A=41 382C-1 176（r=0.998 9）、苯乙酸的回歸方程為A=10 527C+24（r=0.998 9）、鹽酸地巴唑的回歸方程為A=27 422C+2 696（r=0.999 9），表明鄰苯二胺、苯乙酸、鹽酸地巴唑在質(zhì)量濃度分別為0.427～4.27、0.403～4.03、0.82～8.20 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積的線性關(guān)系良好。

2.7 定量限與檢測(cè)限考察

取“2.2.3”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，用流動(dòng)相逐級(jí)稀釋，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以信噪比10 ∶ 1、3 ∶ 1分別計(jì)算定量限、檢測(cè)限。結(jié)果，鄰苯二胺、苯乙酸、鹽酸地巴唑的定量限分別為0.042 7、0.134 3、0.088 7 μg/mL，檢測(cè)限分別為0.021 4、0.067 1、0.044 3 μg/mL。

2.8 精密度試驗(yàn)

取“2.2.3”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果，鄰苯二胺、苯乙酸、鹽酸地巴唑峰面積的RSD分別為0.4%、0.8%、0.2%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.4”項(xiàng)下原料藥供試品溶液（批號(hào)：A1）適量，分別于室溫下放置0、1、2、3、4 h時(shí)，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，鄰苯二胺、苯乙酸均未檢出，鹽酸地巴唑峰面積的RSD為1.4%（n=5），表明原料藥供試品溶液在室溫下放置4 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.10 重復(fù)性試驗(yàn)

取鹽酸地巴唑原料藥（批號(hào)：A1）約10 mg，共6份，按“2.2.4”項(xiàng)下方法制備原料藥供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并按外標(biāo)法計(jì)算樣品含量。結(jié)果，鄰苯二胺、苯乙酸均未檢出，鹽酸地巴唑含量的RSD為1.1%（n=6）;最大未知雜質(zhì)含量的RSD為1.3%（n=6），未知雜質(zhì)總量的RSD為1.3%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.11 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的鹽酸地巴唑原料藥（批號(hào)：A1）約10 mg，精密稱定，共9份，分別置于10 mL量瓶中，加入一定量的“2.2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品貯備液，加流動(dòng)相稀釋，按“2.2.4”項(xiàng)下方法制備原料藥供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1。

2.12 耐用性試驗(yàn)

取鹽酸地巴唑原料藥（批號(hào)：A1）約10 mg，按“2.2.4”項(xiàng)下方法制備原料藥供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件[以不同流速（0.9、1.0、1.1 mL/min）、不同流動(dòng)相中甲醇的比例（50%、55%、60%）、不同柱溫（20、30、40 ℃）、不同色譜柱（Ultimate C18、Waters Acquity UPLC BEH C18、Thermo C18）]進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果，最大未知雜質(zhì)含量的RSD均小于2%，各峰的分離度良好，表明方法耐用性較好。

2.13 樣品有關(guān)物質(zhì)測(cè)定

取83批樣品，分別按“2.2.4” “2.2.5”項(xiàng)下方法制備原料藥及片劑的供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，平行操作9次，記錄峰面積，鄰苯二胺和苯乙酸按外標(biāo)法計(jì)算含量，最大未知雜質(zhì)和未知雜質(zhì)總量按外標(biāo)法以鹽酸地巴唑峰面積為對(duì)照計(jì)算含量，結(jié)果見表2（表中，-表示未檢出）。

由表2可見，鹽酸地巴唑原料及片劑中鄰苯二胺、苯乙酸的含量較低，提示鹽酸地巴唑的起始合成底物在合成工藝中殘留較小。鹽酸地巴唑原料藥中，最大未知雜質(zhì)含量為0.05%～0.25%，未知雜質(zhì)總量為0.05%～0.31%;片劑中，最大未知雜質(zhì)含量為0.06%～0.51%，未知雜質(zhì)總量為0.10%～0.62%。采用箱式圖對(duì)片劑中最大未知雜質(zhì)含量和未知雜質(zhì)總量進(jìn)行分析，詳見圖4、圖5。由圖4、圖5可知，企業(yè)J樣品中的最大未知雜質(zhì)含量和未知雜質(zhì)總量的四分位間距最大;其次為企業(yè)K。這提示上述兩家企業(yè)樣品中雜質(zhì)含量差異較大。企業(yè)C和企業(yè)D樣品中最大未知雜質(zhì)含量和未知雜質(zhì)總量的四分位間距較小，提示這兩家企業(yè)樣品生產(chǎn)控制較好，雜質(zhì)含量差異較小。

2.14 最大未知雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)推測(cè)

2.14.1 色譜條件 色譜柱：Waters Acquity UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 ?m）;流動(dòng)相：水-甲醇（45 ∶ 55，V/V）;流速：0.2 mL/min;柱溫：30 ℃;進(jìn)樣量：1 μL。

2.14.2 質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧離子源（ESI）;掃描模式：負(fù)離子掃描模式;一級(jí)質(zhì)譜掃描范圍：m/z 100～800;毛細(xì)管電壓：3 000 V;離子源溫度：100 ℃;去溶劑氣體：氮?dú)?去溶劑氣體流速：600 L/h;錐孔流速：50 L/h;利用質(zhì)譜校正通道每20 s注射亮氨酸腦啡肽溶液，流速10 μL/min，獲得Lock mass參比質(zhì)量信號(hào)，對(duì)測(cè)得的質(zhì)量數(shù)據(jù)進(jìn)行實(shí)時(shí)校準(zhǔn)。

2.14.3 結(jié)構(gòu)推測(cè) 取最大未知雜質(zhì)（批號(hào)：A01）約10 mg，加甲醇溶解，制成質(zhì)量濃度為100 μg/mL的供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣分析，得到質(zhì)譜信息，采用1H-NMR和13C-NMR對(duì)最大未知雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行推測(cè)。結(jié)果，ESI-MS：m/z 223.2055[M-H]-。1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ：7.77（2H，m，H-1/4）、7.53（2H，m，H-2/3）、6.38（1H，s，H-8）、7.66（2H，d，J=7.4 Hz，H-10/14）、7.38（1H，t，J=7.4 Hz，H-12）、7.44（2H，t，J=7.6 Hz，H-11/13）。13C-NMR（151 MHz，DMSO-d6）δ：114.1（C-1/4）、125.8（C-2/3）、130.9（C-5/7）、155.6（C-6）、67.4（C-8）、139.2（C-9）、126.8（C-10/14）、128.8（C-11/13）、128.8（C-12）。推測(cè)其化學(xué)名為2-（羥基苯基）苯并咪唑（羥芐唑），物質(zhì)數(shù)字識(shí)別碼[CAS]為50-97-5，其結(jié)構(gòu)式見圖6。

3 討論

鹽酸地巴唑的原料為鄰苯二胺和苯乙酸，分別屬于堿性化合物和酸性化合物，而鹽酸地巴唑?qū)儆谟袡C(jī)銨鹽酸鹽，三者化學(xué)結(jié)構(gòu)相差較大。通過查詢相關(guān)文獻(xiàn)[9-10]，筆者考察了0.01 mol/L醋酸銨緩沖液-乙腈（70 ∶ 30，V/V）、甲醇-水（55 ∶ 45，V/V）、甲醇-水-三乙胺（80 ∶ 19.5 ∶ 0.5，V/V/V）、水-甲醇-冰醋酸-三乙胺（45 ∶ 55 ∶ 0.5 ∶ 0.5，V/V/V/V）等不同流動(dòng)相系統(tǒng)的分離效果。結(jié)果，以水-甲醇-冰醋酸-三乙胺（45 ∶ 55 ∶ 0.5 ∶ 0.5，V/V/V/V）為流動(dòng)相時(shí)的分離效果較好，且主峰與相鄰雜質(zhì)峰的分離度良好。

Bao K等[11]研究發(fā)現(xiàn)，重復(fù)使用的活性炭在水中可催化合成2-苯甲?；讲⑦溥蚝?-苯甲酰基苯并惡唑衍生物。由此本研究推測(cè)，鹽酸地巴唑中最大未知雜質(zhì)產(chǎn)生的原因可能為鹽酸地巴唑在脫色過程中接觸到活性炭時(shí)，與殘留的氧氣發(fā)生反應(yīng)，生成2-（羥基苯基）苯并咪唑（羥芐唑）。

根據(jù)鹽酸地巴唑片說明書，該藥用量為10～20 mg/次，每日3次，以最大服用量計(jì)算，每日最大劑量為60 mg。根據(jù)《化學(xué)藥物雜質(zhì)研究的技術(shù)指導(dǎo)原則》[12]和《人用藥品注冊(cè)技術(shù)要求國際協(xié)調(diào)會(huì)（ICH）三方協(xié)調(diào)指導(dǎo)原則ICH-Q3A（R2）》[13]建議，當(dāng)每日最大劑量<2 g時(shí)，雜質(zhì)限度為0.15%;當(dāng)每日最大劑量為10～100 mg時(shí)，雜質(zhì)限度為0.5%。參考上述原則規(guī)定，鹽酸地巴唑原料藥中鄰苯二胺、苯乙酸、最大未知雜質(zhì)和未知雜質(zhì)總量的限度分別為0.15%、0.15%、0.15%、0.5%;鹽酸地巴唑片劑中的限度分別0.5%、0.5%、0.5%、1.0%。按上述限度規(guī)定，本研究的83批樣品基本符合要求。

不同廠家鹽酸地巴唑原料藥和片劑中鄰苯二胺和苯乙酸含量較低，最大未知雜質(zhì)為主要雜質(zhì);本研究中的鹽酸地巴唑原料藥均來源于企業(yè)A和企業(yè)B，由于無法獲得更多的生產(chǎn)信息，因此未對(duì)最大未知雜質(zhì)含量和未知雜質(zhì)總量存在較大差異的樣品進(jìn)行研究，僅推測(cè)可能與不同鹽酸地巴唑原料藥生產(chǎn)企業(yè)間工藝差異較大有關(guān)。

綜上所述，本研究所建方法快速、準(zhǔn)確、專屬性好，可用于測(cè)定鹽酸地巴唑原料藥及片劑中的有關(guān)物質(zhì)。鹽酸地巴唑原料藥及片劑中的最大未知雜質(zhì)可能為2-（羥基苯基）苯并咪唑（羥芐唑）。

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（收稿日期：2019-08-27 修回日期：2020-02-10）

（編輯：陳 宏）