苗藥了哥王“汗?jié)n法”炮制前后抗小鼠免疫性炎癥的“量-效-毒”關系研究

鄭傳奇 馮果 李瑋 周志容 許琴 李志平 易懂斌 李金徽

摘 要 目的：探討苗藥了哥王炮制前后抗小鼠免疫性炎癥的“量-效-毒”關系。方法：將小鼠分成空白組、模型組、了哥王生品醇提物1～6組、了哥王“汗?jié)n法”炮制品醇提物1～6組（以下分別簡稱為“生品1～6組”“炮制品1～6組”，劑量均分別為0.13、0.20、0.26、0.52、1.04、2.6 g/kg）和陽性組（環(huán)磷酰胺，36.4 mg/kg），每組10只。除空白組外，其余各組小鼠均以1% 2，4-二硝基氟苯-丙酮-麻油混合溶液復制遲發(fā)型超敏反應模型。造模后，空白組和模型組小鼠均灌胃等容1.0%羧甲基纖維素鈉溶液，各給藥組小鼠灌胃相應藥液20 mL/kg，每日1次，連續(xù)5 d。末次給藥后，記錄各組小鼠耳腫脹度，并計算生品及炮制品的腫脹抑制率、半數(shù)有效劑量（ED50）及其95%置信區(qū)間（CI）;稱定小鼠心、肝、脾、肺、腎的質量，并計算各臟器指數(shù);采用酶聯(lián)免疫吸附測定法、改良化學氧化法分別檢測小鼠血清中炎癥因子[腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素10（IL-10）]和肝腎功能指標[丙氨酸轉氨酶（ALT）、天冬氨酸轉氨酶（AST）、總膽紅素（TBIL）、尿素氮（BUN）、血肌酐（CREA）]水平。結果：與空白組比較，模型組小鼠耳腫脹度顯著升高（P<0.05）;與模型組比較，了哥王生藥及炮制品醇提物各劑量組小鼠耳腫脹度均顯著降低（P<0.05），其腫脹抑制率均有隨劑量增加而升高的趨勢，兩者抗小鼠遲發(fā)型超敏反應耳腫脹的ED50及95%CI分別為0.239 6（0.129 0，0.445 2）g/kg、0.147 3（0.076 8，0.282 7）g/kg。與空白組比較，模型組小鼠肝指數(shù)、血清TNF-α水平均顯著升高，肺指數(shù)、血清IL-10水平均顯著降低（P<0.05）;與模型組比較，不同給藥組小鼠肝指數(shù)（陽性組、生品3組和炮制品1～6組）、血清TNF-α水平（陽性組、生品1～3組及炮制品1～4組）均顯著降低，肺指數(shù)（陽性組、生品3～6組及炮制品3～6組）、血清IL-10水平（生品1、2、4、5組以及炮制品2～6組）以及ALT、AST、BUN、CREA水平（生品4～6組）和TBIL水平（生品3～6組）均顯著升高（P<0.05）。結論：了哥王生品醇提物具有一定的抗免疫炎癥活性，且對小鼠具有肝腎毒性，呈一定的“量-效-毒”關系;炮制品醇提物也具有一定的抗免疫炎癥活性，但肝腎毒性弱于生品。“汗?jié)n法”具有“存效減毒”的效果。

關鍵詞 了哥王;汗?jié)n法;免疫性炎癥;劑量;藥效;毒性

了哥王是瑞香科蕘花亞族蕘花屬植物了哥王[Wikstroemia indica（L.）C. A. Mey.]的干燥根或根皮，學名南嶺蕘花（Wikstroemia viridiflore meisen），是苗族地區(qū)民間常用苗藥之一。該藥味苦、微辛，性寒，歸肺、肝經(jīng)，具有化痰散瘀、通經(jīng)利水、殺蟲拔瘡、清熱解毒等功效[1]?，F(xiàn)代藥理研究表明，了哥王具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗腫瘤等多種活性[1-4]，臨床主要用于治療肝炎、肝硬化、急性扁桃體炎、慢性支氣管炎、腎炎、肢體疼痛等，同時還可用于治療惡性淋巴癌、乳腺癌、肺癌及其他體表癌[5-6]。該藥療效確切，但毒性較大。有文獻指出，了哥王有大毒，其果實、莖、葉和根皮均有毒，中毒時可導致腹瀉、嘔吐等消化道反應以及皮疹等皮膚反應[7-8]。為降低了哥王的毒性作用，本課題組前期對其炮制減毒方法進行了深入研究，優(yōu)選出其最佳炮制減毒方法“汗?jié)n法”[9-10];同時，對了哥王生品不同溶劑提取物以及不同炮制品乙醇提取物進行了初步的急性毒性研究，結果發(fā)現(xiàn)生品中非極性部位石油醚提取物和乙酸乙酯提取物均具有較大毒性，且生品毒性明顯大于炮制品[9，11-12]。基于上述研究，本課題組對了哥王炮制前后抗免疫性炎癥的“量-效-毒”關系進行了探討，旨在為該藥炮制方法及炮制機制研究提供依據(jù)，為其臨床合理應用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

ADVIA 1800型全自動生化分析儀（德國Siemens Healthcare Diagnostics公司）;Multiskan FC型酶標儀、Sorvall RC 6型離心機（美國Thermo Fisher Scientific公司）;FA 2004型電子分析天平（上海衡平儀器儀表廠）;Targin VX-02型多管渦旋振蕩器（北京踏錦科技有限公司）;202-3 AB型電熱恒溫干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）;RE52-99型旋轉蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）;DZF-6020型減壓真干燥箱（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠）。

1.2 藥品與試劑

了哥王藥材購自廣西壯族自治區(qū)玉林市玉林銀豐國際中藥港（產(chǎn)地：廣西玉林，批號：20160115），經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學藥學院李瑋教授鑒定為瑞香科蕘花屬植物了哥王[W. indica（L.）C. A. Mey.]的根。

注射用環(huán)磷酰胺（陽性對照，江蘇盛迪醫(yī)藥有限公司，批號：16070925，規(guī)格：200 mg/瓶）;腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素10（IL-10）、丙氨酸轉氨酶（ALT）、天冬氨酸轉氨酶（AST）、總膽紅素（TBIL）、尿素氮（BUN）、血肌酐（CREA）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號分別為20160905、20160910、20160912、20160915、20160920、20160515、20160511）;2，4-二硝基氟苯（DNFB，廣東翁江化學試劑有限公司，批號：1612101101R）;羧甲基纖維素鈉、氫氧化鈉（天津市恒興化學試劑制造有限公司，批號分別為20170110、20170501）;L-組氨酸鹽酸鹽（北京博奧拓達科技有限公司，批號：645-35-2）;氯化鈉[重慶川東化工（集團）有限公司，批號：20180401];二水合磷酸二氫鈉（天津市光復科技發(fā)展有限公司，批號：20160107）;其余試劑均為分析純，水為蒸餾水。

1.3 動物

SPF級昆明種小鼠150只，雄性，體質量（20.0±2.0）g，購自長沙市天勤生物技術有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2014-0011。所有小鼠均飼養(yǎng)于每12 h明暗交替的動物房內，控制室內溫度為（25.0±1.0）℃、相對濕度為（50.0±10.0）%，并給予標準飼料和飲用水。

2 方法

2.1 了哥王生品及炮制品醇提物的制備

2.1.1 了哥王生品醇提物 取了哥王藥材，粉碎后取粗粉5 kg，以14倍量（g/mL，下同）的70%乙醇按5 mL/（min·kg）的速度進行滲漉提取。收集提取液，回收乙醇至無醇味，采用低壓真空濃縮干燥法（溫度：60 ℃，真空度：0.07～0.08 MPa）進行濃縮、干燥后，粉碎成細粉（過80目篩），即得了哥王生品醇提物（每100 g醇提物相當于992 g生藥）[13]。

2.1.2 了哥王炮制品醇提物 取了哥王生品藥材粗粉5 kg，每日噴灑人工汗液（含L-組氨酸鹽酸鹽0.5 g/L、氯化鈉5 g/L、二水合磷酸二氫鈉2.2 g/L，用0.05 mol/L氫氧化鈉溶液調節(jié)pH至5.5，即得），每100 kg藥材粗粉噴灑人工汗液30 kg[14]，拌勻，悶潤，待吸盡水分后置于（37.0±0.5）℃的干燥箱中烘干24 h。同法反復炮制14 d，即得了哥王汗?jié)n法炮制品藥材。取上述炮制品藥材適量，按“2.1.1”項下滲漉法提取，制得了哥王炮制品醇提物（每100 g醇提物相當于992 g生藥）[13]。

2.2 分組、造模與給藥

取雄性小鼠150只，隨機分為空白組、模型組、了哥王生品醇提物1～6組（簡稱“生品1～6組”;劑量分別為0.13、0.20、0.26、0.52、1.04、2.6 g/kg，按人用臨床最高劑量的10倍換算得最高劑量[1]，以1.0%羧甲基纖維素鈉溶液為溶劑，下同）、了哥王炮制品醇提物1～6組（簡稱“炮制品1～6組”;劑量分別為0.13、0.20、0.26、0.52、1.04、2.6 g/kg）和陽性組（環(huán)磷酰胺，36.4 mg/kg，按人用臨床最高劑量換算而得[15]，以1.0%羧甲基纖維素鈉溶液為溶劑），每組10只。除空白組外，其余各組小鼠均于腹部去毛（面積約為3 cm×3 cm），并將1%DNFB-丙酮-麻油混合溶液[將DNFB 50 mg溶于丙酮-麻油溶液（1 ∶ 1，V/V）5 mL中，即得]50 μL均勻涂抹至去毛處致敏以復制遲發(fā)型超敏反應模型。模型復制成功（即出現(xiàn)皮膚紅腫脹、局部有滲出液、水腫等癥狀[15]）后，空白組和模型組小鼠均灌胃等容1.0%羧甲基纖維素鈉溶液，各給藥組按20 mL/kg灌胃相應藥液，每日1次，連續(xù)5 d。

2.3 小鼠耳腫脹情況及臟器指數(shù)檢測

末次給藥后，將1%DNFB-丙酮-麻油混合溶液10 μL均勻涂抹于小鼠右耳（兩面）進行攻擊。攻擊24 h后，于眼內眥靜脈叢取血，隨后頸椎脫臼處死小鼠，剪下雙耳，用9 mm直徑打孔器分別在兩耳同一部位處打孔，取圓耳片稱定質量，以右耳片與左耳片的質量之差（即腫脹度）為觀察指標，計算每只小鼠的耳腫脹抑制率：腫脹抑制率=（給藥組腫脹度-空白組腫脹度）/空白組腫脹度×100%。采用Bliss法[16]計算生品與炮制品的半數(shù)有效劑量（ED50）及其95%置信區(qū)間（CI）。將小鼠解剖后，取心、肝、脾、肺、腎并精密稱定質量，計算臟器指數(shù)：臟器指數(shù)=某臟器質量/體質量×100%。

2.4 小鼠炎癥因子及肝腎功能指標檢測

取“2.3”項下血液樣品適量，以4 500 r/min離心15 min，取血清，采用酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）以酶標儀檢測血清TNF-α、IL-10水平，采用改良化學氧化法以全自動生化分析儀測定血清ALT、AST、TBIL、BUN、CREA水平。嚴格按照相應試劑盒說明書操作。

2.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料均以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 了哥王生品及炮制品醇提物對遲發(fā)型超敏反應模型小鼠耳腫脹情況的影響

與空白組比較，模型組小鼠耳腫脹度顯著升高（P<0.05）。與模型組比較，了哥王生品及炮制品醇提物各劑量組小鼠耳腫脹度均顯著降低（P<0.05），且腫脹抑制率有隨劑量增加而升高的趨勢。了哥王生品及炮制品醇提物抗小鼠遲發(fā)型超敏反應耳腫脹的ED50及95%CI分別為0.239 6（0.129 0，0.445 2）g/kg、0.147 3（0.076 8，0.282 7）g/kg，詳見表1。

3.2 了哥王生品及炮制品醇提物對遲發(fā)型超敏反應模型小鼠臟器指數(shù)的影響

與空白組比較，模型組小鼠肝指數(shù)顯著升高，肺指數(shù)顯著降低（P<0.05）;與模型組比較，陽性組、生品3組和炮制品1～6組小鼠肝指數(shù)均顯著降低，陽性組、生品3～6組及炮制品3～6組小鼠肺指數(shù)均顯著升高（P<0.05）;而其余臟器指數(shù)組間比較差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05），詳見表2。

3.3 了哥王生品及炮制品醇提物對遲發(fā)型超敏反應模型小鼠炎癥因子的影響

與空白組比較，模型組小鼠血清TNF-α水平顯著升高，IL-10水平顯著降低（P<0.05）。與模型組比較，陽性組、生品1～3組以及炮制品1～4組小鼠血清TNF-α水平均顯著降低，生品1、2、4、5組以及炮制品2～6組小鼠血清IL-10水平均顯著升高（P<0.05），詳見表3。

3.4 了哥王生品及炮制品醇提物對遲發(fā)型超敏反應模型小鼠血清肝腎功能指標的影響

與空白組比較，模型組小鼠各肝腎功能指標差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。與模型組比較，生品4～6組小鼠血清ALT、AST、BUN、CREA水平以及生品3～6組TBIL水平均顯著升高（P<0.05），且上述各指標有隨劑量增大而升高的趨勢;而炮制品各劑量組上述指標與模型組比較差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05），詳見表4。

4 討論

了哥王為我國苗族地區(qū)常用的一種苗藥，其療效確切，但具有一定的毒性[7-8]?！稁X南采藥錄》記載“了哥王有毒，能使狗中毒，狗食之必死”;《生草藥性備要》記載“了哥王能殺人，不能亂服”。有研究指出，炮制是降低有毒中藥毒性的有效方法[17]。經(jīng)本課題組前期調查研究發(fā)現(xiàn)，在貴州黔東南苗族地區(qū)的苗族群眾常采用“汗?jié)n法”（又稱“身背汗?jié)穹ā保┡谥屏烁缤跻詼p輕其毒性，即將藥材捆于人腰部，以汗液浸漬、以體溫溫煦藥材，從而達到降低藥材毒性的目的。經(jīng)本課題組深入研究發(fā)現(xiàn)，該炮制方法確實具有較好的減毒作用，但存在操作不便、無法大規(guī)模炮制、不能控制其炮制質量的缺點。因此，本課題組在尊重少數(shù)民族民間用藥經(jīng)驗及炮制方法的基礎上，對其炮制工藝進行了優(yōu)化，以人工汗液炮制了哥王藥材，并于37 ℃條件下反復干燥，建立了了哥王藥材科學、合理、簡便、穩(wěn)定、可控的炮制方法——汗?jié)n法[14]。

本文在前期研究的基礎上，建立了小鼠遲發(fā)型超敏反應模型，初步研究了了哥王生品及“汗?jié)n法”炮制品抗小鼠免疫性炎癥的“量-效-毒”關系。結果顯示，模型組小鼠耳腫脹度較空白組顯著升高;經(jīng)藥物干預后，了哥王生品及炮制品醇提物各劑量組小鼠耳腫脹度均較模型組顯著降低，且腫脹抑制率有隨劑量增加而升高的趨勢;了哥王生品及炮制品醇提物抗小鼠遲發(fā)型超敏反應耳腫脹的ED50及其95%CI分別為0.239 6（0.129 0，0.445 2）g/kg、0.147 3（0.076 8，0.282 7）g/kg。了哥王生品的ED50值大于炮制品，提示炮制品抗小鼠遲發(fā)型超敏反應耳腫脹的作用比生品的作用要強。但由于ED50及95%CI較低，部分結果低于劑量設置范圍最低值，故仍有待進一步驗證。

本研究結果還顯示，模型組小鼠肝指數(shù)較空白組顯著升高，肺指數(shù)較空白組顯著降低;經(jīng)藥物干預后，陽性組、生品3組和炮制品1～6組小鼠肝指數(shù)均較模型組顯著降低，陽性組、生品3～6組及炮制品3～6組小鼠肺指數(shù)均較模型組顯著升高。此外從數(shù)據(jù)上看，了哥王炮制品1～6組小鼠的肝指數(shù)均較同劑量生品小，且炮制品1～6組小鼠肝指數(shù)以及其較高劑量組別（3～6組）小鼠的腎指數(shù)更接近于空白組水平。這提示了哥王生品、炮制品的藥效、劑量之間可能存在一定的正相關關系，且炮制品降低遲發(fā)型超敏反應模型小鼠肝指數(shù)的作用較生品稍強，而生品所致毒性有隨著劑量增加而增強的趨勢。

本研究還考察了不同劑量了哥王生品及炮制品醇提物對遲發(fā)型超敏反應模型小鼠血清炎癥因子和肝腎功能指標的影響。結果顯示，模型組小鼠血清TNF-α水平較空白組顯著升高，IL-10水平較空白組顯著降低;經(jīng)藥物干預后，陽性組、生品1～3組以及炮制品1～4組小鼠血清TNF-α水平均較模型組顯著降低，生品1、2、4、5組以及炮制品2～6組小鼠血清IL-10水平，生品4～6組ALT、AST、BUN、CREA水平以及生品3～6組TBIL水平均較模型組顯著升高。這提示了哥王生品及炮制品均可減輕小鼠的免疫性炎癥，且生品與炮制品的“藥效-劑量”之間也呈一定的變化趨勢，其中炮制品的肝腎毒性比生品要小。

綜上所述，了哥王生品醇提物（0.13～2.6 g/kg）具有抗免疫性炎癥的作用，同時對小鼠臟器也具有一定的毒副作用，其毒性有隨劑量增加而增強的趨勢，可能存在一定的“量-效-毒”依賴性關系;炮制品醇提物（0.13～2.6 g/kg）也具有抗免疫性炎癥的作用，具有一定的“量-效”關系，但與生品組比較，其肝腎毒性相對較小，提示“汗?jié)n法”具有“存效減毒”的效果。本研究為苗藥了哥王臨床應用的安全性、有效性以及“汗?jié)n法”的炮制機制研究提供了一定的參考。但是，目前該藥毒性成分尚未明確，其藥理作用的物質基礎研究還不夠深入，故仍有待后續(xù)研究予以完善。

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（收稿日期：2019-06-09 修回日期：2019-11-19）

（編輯：張元媛）