響應(yīng)曲面法優(yōu)化防己中漢防己甲素及漢防己乙素的提取工藝

胡筱希 朱榮 唐新

【摘 要】 目的：以漢防己甲素和漢防己乙素的提取率作為考察指標(biāo)，優(yōu)化防己中漢防己甲素和漢防己乙素的提取工藝。方法：利用高效液相色譜法測定漢防己甲素和漢防己乙素的含量，采用響應(yīng)曲面法考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比及超聲時間對提取效果的影響。結(jié)果：Design expert 10預(yù)測得到漢防己甲素最佳提取工藝為乙醇濃度為60%，料液比為1∶ 36.07，超聲時間為57.12min，提取率為13.53mg/g;最佳提取漢防己乙素的提取工藝為乙醇濃度62.49%，料液比為1∶ 37.71，超聲時間為59.38min，提取率為8.71mg/g。結(jié)論：該研究為防己中防己甲素和漢防己乙素的提取工藝提供實驗依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】 漢防己甲素;漢防己乙素;防己;響應(yīng)曲面法

【中圖分類號】R284.2 ? 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A ? ?【文章編號】1007-8517（2020）1-0025-06

Abstract：Objective To optimize operation conditions for tetrandrine and hanfangichin B from Stephaniatetrandra S.Moore using yields as index.Methods HPLC was used to determine the concentrations of tetrandrine and hanfangichin B. Operation condition （ethanol volume fraction， solid-liquids ratio and ultrasonic time） were optimized with response surface methodology. Results According to the Design Expert 10 software as follows：the optimum operating paramaters were： ethanol volume fraction were 60% and 62.49%， solid-liquids ratio were 1∶ 36.07 and 1∶ 37.71， ultrasonic time were 57.12 min and 59.38 min for tetrandrine and hanfangichin B. The highest extraction rate of tetrandrine and hanfangichin B were 13.53mg/g and 8.71mg/g. Conclusion The optimized conditions are reliable and provide experiment evidences for the optimal extraction technology for tetrandrine and hanfangichin B from Stephaniatetrandra S.Moore.

Keywords：Tetrandrine;Hanfangichin B; Stephaniatetrandra S. Moore; Box-Behnken

防己為防己科植物粉防己（Stephaniatetrandra S.Moore）的干燥根，具有祛風(fēng)止痛、利水消腫、用于風(fēng)濕痹痛、水腫腳氣、小便不利、濕疹瘡毒等[1]。防己中的漢防己甲素（又名粉防己堿）和漢防己乙素（又名防己諾林堿）為其主要的活性成分，兩者均為天然的雙芐基異喹啉類生物堿，漢防己甲素具有抗腫瘤、抗炎、抗心律失常、抗菌、降壓等作用[2]，以其為主要成分的中成藥“漢防己甲素”和“漢防己甲素注射液”廣泛用于臨床上對各期矽肺病的治療[3-4]。漢防己乙素具有抗肝缺血再灌注損傷、誘導(dǎo)人肺癌95D細(xì)胞凋亡等作用[5-6]。本實驗擬采用單因素試驗結(jié)合響應(yīng)曲面法優(yōu)化防己中的漢防己甲素及漢防己乙素的提取工藝，為防己中的活性成分研究及深度開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 數(shù)顯恒溫水浴鍋HH-S2（金壇市醫(yī)療儀器廠），JJ224BC電子天平（常熟雙杰），Waters2695 高效液相色譜儀（日本 Waters 公司），KS-3200DE超聲波清洗器（昆山潔力美），LDZ4-0.8A離心機（北京醫(yī)用離心機廠）。

1.2 藥材與試劑 防己藥材由廣西大海陽光藥業(yè)有限公司提供;漢防己甲素HPLC≥98%（YM0311YBB，上海源葉生物）;漢防己乙素HPLC≥98%（RO1A6F2，上海源葉生物）;乙腈、甲醇、二乙胺為色譜純;乙醇為分析純;水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 漢防己甲素和漢防己乙素測定方法

2.1.1 HPLC色譜條件 色譜柱C18柱（4.6mm×250mm，5μm）;流動相：乙腈-甲醇-0.1%二乙胺（30∶ 35∶ 35）;檢測波長：282nm;柱溫：25℃;理論塔板數(shù)：按漢防己甲素峰計算不低于5000;流速：1.0mL/min;進(jìn)樣量：10μL。如圖1所示。

2.1.2 溶液配制 ?①對照貯備液：分別精密稱取12.5mg漢防己甲素、漢防己乙素，用甲醇溶解，定容至25mL量瓶中，搖勻，即得500μg/mL的混合對照品溶液。②供試品溶液：精密稱取1.0g防幾藥材，加適量超聲提取得溶液到供試品。按“2.1.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，如圖1所示。2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 分別精密吸取對照品溶液貯備液0.8、1.2、1.6、2、2.4、3. 2mL，稀釋到10mL，搖勻，得到40、60、80、100、120、160μg/mL混合對照品溶液。以甲醇作為空白溶液，注入色譜儀，以峰面積為縱坐標(biāo)，以對照品溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得漢防己甲素回歸方程Y=9038.4X-100992，相關(guān)系數(shù)r2=0.9997;漢防己乙素回歸方程Y=7137X-38969，相關(guān)系數(shù)r2=0.9998。

2.2 單因素提取試驗

2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù) 稱取防幾藥材粉末1.0g，在料液比1∶ 40g/mL，超聲時間40min，分別以60%、70%、80%、95%、100%乙醇提取，結(jié)果如圖2所示。漢防己甲素、漢防己乙素均在70%提取率最高。2.2.2 料液比 稱取防己藥材粉末1.0g，在乙醇濃度95%，超聲時間40min的條件下，分別以料液比（g∶ mL）1∶ 20、1∶ 30、1∶ 40、1∶ 50、1∶ 60進(jìn)行提取，結(jié)果如圖3所示。漢防己甲素在料液比1∶ 40時，提取率最高，漢防己乙素在1∶ 50時提取率最高。2.2.3 超聲時間的影響 稱取防己藥材粉末1.0g，在乙醇濃度95%，在料液比1∶ 40g/mL，分別提取20、30、40、50、60min，結(jié)果如圖4所示。在20～50min漢防己甲素及漢防己乙素的提取率均呈上升趨勢，超過50min提取率下降，因此超聲時間在50min較合適。2.3 響應(yīng)曲面實驗設(shè)計 根據(jù)單因素試驗結(jié)果和響應(yīng)面中心組合試驗設(shè)計原理，選取3個因素為響應(yīng)因素，浸膏中漢防己甲素、漢防己乙素提取率為響應(yīng)值，運用Design-Expert 10軟件設(shè)計三因素三水平響應(yīng)面試驗，結(jié)果見表1。

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果 試驗方案及結(jié)果見表2。

擬合試驗數(shù)據(jù)，建立二次多元回歸方程：R（漢防己甲素） =13.08-0.42B+0.15B+0.24C+0.20AB-7.500E-0.03AC-0.060BC-0.066A2-0.12B2-0.19C2;R （漢防己乙素） =8.33-0.51A-0.27B+0.073C+0.19AB-0.22AC-0.15BC-0.52 A2-0.33 B2-0.044C2，對其進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3、表4。

對表3中的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，由模型P值可知，該模型擬合程度良好，漢防己甲素的提取率與各試驗因素之間的線性關(guān)系顯著（R2 = 0.9327），校正系數(shù)R2Adj = 0.8461，說明84.61%的漢防己甲素提取率變化可用該模型解釋，因此可用該模型分析和預(yù)測漢防己甲素提取率。由F值可知，三個因素對漢防己甲素提取率的影響順序為：A（乙醇濃度） > C（超聲時間） > B（料液比）;由P值可知，二次項中，3個因素均對提取率影響極顯著;交互相中，A（乙醇體積分?jǐn)?shù)）與B（料液比）之間作用顯著。為評價A（乙醇體積分?jǐn)?shù)）與B（固液比）之間的交互作用對漢防己甲素提取率的顯著影響及確定各因素的最佳水平范圍，分別繪制如圖5的響應(yīng)面圖和等高線圖。從圖5中看出，以上響應(yīng)面形狀均較陡，等高線呈明顯的橢圓形，說明各交互作用均較為明顯。求解二次多元回歸方程，最佳提取漢防己甲素工藝為乙醇濃度為60%，料液比為1∶ 36.07，超聲時間為57.12min，提取率為13.53mg/g。

對表4中的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，由模型P值可知，該模型擬合程度良好，漢防己乙素的提取率與各試驗因素之間的線性關(guān)系顯著（R2 = 0.9679），校正系數(shù)R2Adj = 0.9265，說明92.65%的漢防己乙素提取率變化可用該模型解釋，因此可用該模型分析和預(yù)測檸檬酚提取率。由F值可知，三個因素對漢防己乙素提取率的影響順序為：A（乙醇濃度） > B（料液比） > C（超聲時間）;由P值可知，二次項中，A（乙醇濃度）、B（料液比）對提取率影響顯著;交互相中，A（乙醇體積分?jǐn)?shù)）與B（固液比）、A（乙醇體積分?jǐn)?shù)）與C（超聲時間）之間作用顯著。為評價A（乙醇體積分?jǐn)?shù)）與B（固液比）、A（乙醇體積分?jǐn)?shù)）與C（超聲時間）之間的交互作用對漢防己乙素提取率的顯著影響及確定各因素的最佳水平范圍，分別繪制如圖5的響應(yīng)面圖和等高線圖。從圖6～7中看出，以上響應(yīng)面形狀均較陡，等高線呈明顯的橢圓形，說明各交互作用均較為明顯。求解二次多元回歸方程，最佳提取漢防己乙素工藝為乙醇濃度為62.49%，料液比為1∶ 37.71，超聲時間為59.38min，提取率為8.71mg/g。

2.5 驗證試驗 在最佳提取漢防己甲素工藝乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，料液比為1∶ 36.07，超聲時間為57.12min，進(jìn)行3次試驗，提取率分別為13.48mg/g、13.51mg/g、13.54mg/g，平均值為13.51mg/g。在最佳提取漢防己乙素工藝乙醇體積分?jǐn)?shù)為62.49%，料液比為1∶ 37.71，超聲時間為59.38min，提取率分別為為8.75mg/g、8.74mg/g、8.67mg/g，平均值為8.72mg/g。結(jié)果分析見表5，試驗值與理論值無顯著性差異。

3 討論

在選擇提取溶劑時考察了乙醇、甲醇兩種溶劑，發(fā)現(xiàn)防己中漢防己甲素和漢防己乙素在甲醇中提取率低，這是由于兩種生物堿為雙芐基異喹啉類生物堿，堿性較強，容易結(jié)合氫離子成鹽，在甲醇中溶解率低[7]。

用乙醇進(jìn)行超聲提取防己藥材僅得到漢防己甲素和漢防己乙素的粗提物，需進(jìn)一步純化才能得到高純度的漢防己甲素和漢防己乙素。楊欣欣等采用AB-8大孔樹脂法進(jìn)行分離純化，但漢防己甲素和漢防己乙素的純度僅為50%[8]。魏晉寶等采用回流提取、萃取、氧化鋁色譜柱層析、重結(jié)晶法得到了高純度的漢防己甲素[9]。

本實驗采用響應(yīng)曲面法考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比及超聲時間對提取效果的影響。Design expert 10預(yù)測得到漢防己甲素最佳提取工藝為乙醇濃度為60%，料液比為1∶ 36.07，超聲時間為57.12 min，提取率為13.53mg/g;最佳提取漢防己乙素的提取工藝為乙醇濃度62.49%，料液比為1∶ 37.71，超聲時間為59.38min，提取率為8.71mg/g，驗證值與預(yù)測值相近，本實驗的提取工藝及含量測定研究均為其今后的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

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（收稿日期：2019-11-27 編輯：程鵬飛）