響應(yīng)曲面法優(yōu)化防己中漢防己甲素及漢防己乙素的提取工藝

胡筱希 朱榮 唐 新 黃大權(quán) 盧文杰 陸國(guó)壽

1.廣西中醫(yī)藥研究院，廣西 南寧 530022；2.廣西大海陽(yáng)光藥業(yè)有限公司，廣西 南寧 530022

防己為防己科植物粉防己(Stephaniatetrandra S.Moore)的干燥根,具有祛風(fēng)止痛、利水消腫、用于風(fēng)濕痹痛、水腫腳氣、小便不利、濕疹瘡毒等[1]。防己中的漢防己甲素(又名粉防己堿)和漢防己乙素(又名防己諾林堿)為其主要的活性成分，兩者均為天然的雙芐基異喹啉類生物堿，漢防己甲素具有抗腫瘤、抗炎、抗心律失常、抗菌、降壓等作用[2]，以其為主要成分的中成藥“漢防己甲素”和“漢防己甲素注射液”廣泛用于臨床上對(duì)各期矽肺病的治療[3-4]。漢防己乙素具有抗肝缺血再灌注損傷、誘導(dǎo)人肺癌95D細(xì)胞凋亡等作用[5-6]。本實(shí)驗(yàn)擬采用單因素試驗(yàn)結(jié)合響應(yīng)曲面法優(yōu)化防己中的漢防己甲素及漢防己乙素的提取工藝，為防己中的活性成分研究及深度開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 數(shù)顯恒溫水浴鍋HH-S2(金壇市醫(yī)療儀器廠)，JJ224BC電子天平(常熟雙杰)，Waters2695 高效液相色譜儀(日本 Waters 公司)，KS-3200DE超聲波清洗器(昆山潔力美)，LDZ4-0.8A離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠)。

1.2 藥材與試劑 防己藥材由廣西大海陽(yáng)光藥業(yè)有限公司提供；漢防己甲素HPLC≥98%(YM0311YBB，上海源葉生物)；漢防己乙素HPLC≥98%(RO1A6F2，上海源葉生物)；乙腈、甲醇、二乙胺為色譜純；乙醇為分析純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 漢防己甲素和漢防己乙素測(cè)定方法

2.1.1 HPLC色譜條件 色譜柱C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-甲醇-0.1%二乙胺(30∶35∶35)；檢測(cè)波長(zhǎng)：282 nm；柱溫：25℃；理論塔板數(shù)：按漢防己甲素峰計(jì)算不低于5000；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL。如圖1所示。

2.1.2 溶液配制 ①對(duì)照貯備液：分別精密稱取12.5 mg漢防己甲素、漢防己乙素，用甲醇溶解，定容至25 mL量瓶中，搖勻，即得500 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。②供試品溶液：精密稱取1.0 g防幾藥材，加適量超聲提取得溶液到供試品。按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，如圖1所示。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 分別精密吸取對(duì)照品溶液貯備液0.8、1.2、1.6、2、2.4、3. 2 mL，稀釋到10 mL，搖勻，得到40、60、80、100、120、160 μg/mL混合對(duì)照品溶液。以甲醇作為空白溶液，注入色譜儀，以峰面積為縱坐標(biāo)，以對(duì)照品溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得漢防己甲素回歸方程Y=9038.4X-100992，相關(guān)系數(shù)r2=0.9997；漢防己乙素回歸方程Y=7137X-38969，相關(guān)系數(shù)r2=0.9998。

2.2 單因素提取試驗(yàn)

2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù) 稱取防幾藥材粉末1.0 g，在料液比1∶40 g/mL，超聲時(shí)間40 min，分別以60%、70%、80%、95%、100%乙醇提取，結(jié)果如圖2所示。漢防己甲素、漢防己乙素均在70%提取率最高。

2.2.2 料液比 稱取防己藥材粉末1.0 g，在乙醇濃度95%，超聲時(shí)間40 min的條件下，分別以料液比(g∶mL)1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60進(jìn)行提取，結(jié)果如圖3所示。漢防己甲素在料液比1∶40時(shí)，提取率最高，漢防己乙素在1∶50時(shí)提取率最高。

2.2.3 超聲時(shí)間的影響 稱取防己藥材粉末1.0 g，在乙醇濃度95%，在料液比1∶40 g/mL，分別提取20、30、40、50、60 min，結(jié)果如圖4所示。在20～50 min漢防己甲素及漢防己乙素的提取率均呈上升趨勢(shì)，超過(guò)50 min提取率下降，因此超聲時(shí)間在50 min較合適。

2.3 響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果和響應(yīng)面中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選取3個(gè)因素為響應(yīng)因素，浸膏中漢防己甲素、漢防己乙素提取率為響應(yīng)值，運(yùn)用Design-Expert 10軟件設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)，結(jié)果見表1。

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果 試驗(yàn)方案及結(jié)果見表2。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)因素與水平

表2 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)分析方案及結(jié)果

擬合試驗(yàn)數(shù)據(jù)，建立二次多元回歸方程：R(漢防己甲素)=13.08-0.42B+0.15B+0.24C+0.20AB-7.500E-0.03AC-0.060BC-0.066A2-0.12B2-0.19C2；R(漢防己乙素)=8.33-0.51A-0.27B+0.073C+0.19AB-0.22AC-0.15BC-0.52 A2-0.33 B2-0.044C2，對(duì)其進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3、表4。

表3 方差分析表(漢防己甲素)

表4 方差分析表(漢防己乙素)

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn) 在最佳提取漢防己甲素工藝乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，料液比為1∶36.07，超聲時(shí)間為57.12 min，進(jìn)行3次試驗(yàn)，提取率分別為13.48 mg/g、13.51 mg/g、13.54 mg/g，平均值為13.51 mg/g。在最佳提取漢防己乙素工藝乙醇體積分?jǐn)?shù)為62.49%，料液比為1∶37.71，超聲時(shí)間為59.38 min，提取率分別為為8.75 mg/g、8.74 mg/g、8.67 mg/g，平均值為8.72 mg/g。結(jié)果分析見表5，試驗(yàn)值與理論值無(wú)顯著性差異。

表5 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果分析

3 討論

在選擇提取溶劑時(shí)考察了乙醇、甲醇兩種溶劑，發(fā)現(xiàn)防己中漢防己甲素和漢防己乙素在甲醇中提取率低，這是由于兩種生物堿為雙芐基異喹啉類生物堿，堿性較強(qiáng)，容易結(jié)合氫離子成鹽，在甲醇中溶解率低[7]。

用乙醇進(jìn)行超聲提取防己藥材僅得到漢防己甲素和漢防己乙素的粗提物，需進(jìn)一步純化才能得到高純度的漢防己甲素和漢防己乙素。楊欣欣等采用AB-8大孔樹脂法進(jìn)行分離純化，但漢防己甲素和漢防己乙素的純度僅為50%[8]。魏晉寶等采用回流提取、萃取、氧化鋁色譜柱層析、重結(jié)晶法得到了高純度的漢防己甲素[9]。

本實(shí)驗(yàn)采用響應(yīng)曲面法考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比及超聲時(shí)間對(duì)提取效果的影響。Design expert 10預(yù)測(cè)得到漢防己甲素最佳提取工藝為乙醇濃度為60%，料液比為1∶36.07，超聲時(shí)間為57.12 min，提取率為13.53 mg/g；最佳提取漢防己乙素的提取工藝為乙醇濃度62.49%，料液比為1∶37.71，超聲時(shí)間為59.38 min，提取率為8.71 mg/g，驗(yàn)證值與預(yù)測(cè)值相近，本實(shí)驗(yàn)的提取工藝及含量測(cè)定研究均為其今后的質(zhì)量控制提供依據(jù)。