溫敏核不育水稻HD9802-9S育性相關(guān)基因的BSA測(cè)序初步分析

甘丹陽，李龍盤，王倩，徐國成，居超明

(湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430062)

0 引言

溫敏核不育(thermo-sensitive male sterile，TGMS)水稻屬于環(huán)境敏感型不育系(environment-sensitive male sterile，EGMS).自1973年石明松發(fā)現(xiàn)光敏不育水稻NK58S后[1]，EGMS開始應(yīng)用于雜交水稻育種中.EGMS是一類花粉育性受外界環(huán)境變化而改變的水稻品系，它們?cè)诨ǚ郯l(fā)育的敏感時(shí)期，如果外界環(huán)境達(dá)到臨界條件以上時(shí)，其花粉表現(xiàn)出不育性狀，如果外界環(huán)境在臨界條件以下時(shí)，其花粉表現(xiàn)為可育性狀[2].TGMS屬于對(duì)溫度敏感的EGMS，在其小孢子發(fā)育時(shí)期對(duì)溫度敏感，處于這一時(shí)期的TGMS水稻，如果外界溫度高于臨界溫度，會(huì)導(dǎo)致水稻花粉不育[3].

HD9802S是本實(shí)驗(yàn)室自主培育的一個(gè)優(yōu)質(zhì)TGMS，其花粉不育性受一對(duì)主效隱性核基因tms5控制.該不育系具有轉(zhuǎn)育起點(diǎn)溫度低，育性穩(wěn)定(需日均溫低于23 ℃處理5 d以上才會(huì)轉(zhuǎn)育)，品質(zhì)優(yōu)，熟期短等優(yōu)點(diǎn)[4].HD9802-9S是以HD9802S為母本、以固優(yōu)12為父本雜交選育的不育系，人工氣候箱鑒定結(jié)果顯示HD9802-9S的轉(zhuǎn)育起始溫度高于HD9802S，大田的可繁性明顯好于HD9802S，我們預(yù)測(cè)HD9802-9S和HD9802S之間有差異基因調(diào)控它們的花粉育性.

群體分離分析法(bulked segregant analysis，BSA)是Michelmore于1991年根據(jù)建立近等基因系(near iso-genic lines，NIL)類似的原理提出來的[5].該分析方法是將分離群體中表現(xiàn)出極端性狀的個(gè)體混合起來構(gòu)建混池，通過分析比對(duì)不同混池間的差異序列，篩選與目的基因緊密連鎖的分子標(biāo)記以達(dá)到定位目標(biāo)基因的目的.BSA重測(cè)序是一個(gè)有效、可靠的技術(shù)手段，廣泛應(yīng)用于水稻的基因定位.Han等通過BSA重測(cè)序，結(jié)合SSR和序列標(biāo)簽位點(diǎn)(STS)定位水稻抗白葉枯病基因[6]；Tiwari等通過BSA重測(cè)序結(jié)合SNP芯片定位水稻耐鹽基因座[7]；Sun等通過BSA重測(cè)序結(jié)合二代測(cè)序(NGS)技術(shù)(Seq-BSA)，定位了水稻的抗寒基因座[8].我們采用的BSA重測(cè)序技術(shù)是利用QTL-seq[9]方法，定位HD9802-9S的育性相關(guān)基因，對(duì)比前期得到的HD9802S不育基因的定位結(jié)果[10]，篩選HD9802-9S和HD9802S之間調(diào)控花粉育性的差異基因.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料溫敏核不育系HD9802-9S，恢復(fù)系R144和R446，HD9802-9S/R446 F2群體，HD9802-9S/R144 F2群體.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 花粉育性鑒定 兩個(gè)F2代群體于2018年5月在武漢播種，6月插秧，每個(gè)群體數(shù)量約1 000株.七月底至八月中旬F2代群體處于抽穗期時(shí)對(duì)每一株材料進(jìn)行花粉鏡檢并做標(biāo)記.隨機(jī)取抽穗期單株每穗上中下3個(gè)位置的花藥置于滴有1%碘-碘化鉀溶液的載玻片上，用鑷子輕夾花藥擠出花粉染色，在光學(xué)顯微鏡下放大160倍觀察并記錄.因?yàn)楦邷貤l件下，TGMS系不產(chǎn)生花粉，所以完全無花粉的單株標(biāo)記為不育株，正常染色花粉超過80%的單株標(biāo)記為高度可育株，如圖1.

圖1 高度可育株花粉鏡檢圖(左)，不育株花粉鏡檢圖(右)

1.2.2 DNA樣品制備 兩個(gè)群體分別取高度可育株和不育株水稻葉片樣本各100個(gè)，CTAB法抽提水稻基因組DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量(若出現(xiàn)拖帶，加入0.5 μL RNA酶A常溫處理5～10 min).分別將HD9802-9S/R446 F2群體和HD9802-9S/R144 F2群體的不育株和高度可育株DNA等量混合構(gòu)建HD9802-9S/R446 F2可育混池，HD9802-9S/R446 F2不育混池，HD9802-9S/R144 F2可育混池和HD9802-9S/R144 F2不育混池，獲得混池樣本，每個(gè)混池樣本中DNA總含量為3～5 μg.用CTAB法分別抽提親本DNA總量各3～5 μg構(gòu)建親本池，送武漢貝納科技服務(wù)有限公司進(jìn)行BSA重測(cè)序.

1.2.3 BSA重測(cè)序分析 以93-11的基因組序列為參考基因組，對(duì)所有混池進(jìn)行二代測(cè)序，親本池測(cè)序深度為60×，混池的測(cè)序深度為100×.通過計(jì)算兩個(gè)子代樣本相對(duì)于其中一親本SNP位點(diǎn)的SNP-index值，計(jì)算兩個(gè)極端混池樣本之間的ΔSNP-index(ΔSNP-index = SNP-index(不育混池)-SNP-index(可育混池))，選取95%和99%置信水平作為篩選的閾值[9]，以1 Mb為窗口，每次分析10 kb，統(tǒng)計(jì)窗口內(nèi)SNP位點(diǎn)的ΔSNP-index平均值繪制ΔSNP-index沿染色體分布圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 BSA重測(cè)序的結(jié)果

2.1.1 HD9802-9S/R446 F2群體BSA重測(cè)序結(jié)果 HD9802-9S/R446 F2群體的ΔSNP-index沿染色體分布圖如圖2.以1 Mb為窗口，95%置信水平下超過閾值的連續(xù)區(qū)域作為候選區(qū)域，候選區(qū)域范圍如表1，99%置信水平的候選區(qū)域如表2.

圖2 HD9802-9S/R446 F2群體的ΔSNP-index沿染色體分布圖

表1 HD9802-9S/R446 F2群體ΔSNP-index超過95%置信水平候選區(qū)域

表2 HD9802-9S/R446 F2群體ΔSNP-index超過99%置信水平候選區(qū)域

由圖2和表1可以看出，當(dāng)置信水平為95%時(shí)，HD9802-9S/R446 F2的ΔSNP-index集中在2號(hào)染色體上總長(zhǎng)為12.57 Mb的候選區(qū)域內(nèi).且在7號(hào)染色體上有一段長(zhǎng)為0.69 Mb的候選區(qū)域.當(dāng)置信水平為99%時(shí)，HD9802-9S/R446 F2的ΔSNP-index集中在2號(hào)染色體上總長(zhǎng)為9.3 Mb的候選區(qū)域內(nèi)，在7號(hào)染色體上有一段長(zhǎng)為0.16 Mb的候選區(qū)域，如表2，但在7號(hào)染色體這個(gè)區(qū)域內(nèi)沒有導(dǎo)致錯(cuò)譯的SNP突變，由此推測(cè)7號(hào)染色體上的候選基因是影響HD9802-9S育性的微效基因.

2.1.2 HD9802-9S/R144 F2群體BSA結(jié)果 HD9802-9S/R144 F2群體的ΔSNP-index沿染色體分布圖如圖3，其置信水平95%的候選區(qū)域見表3，置信水平99%的候選區(qū)域見表4.

由圖3和表3可以看出，當(dāng)置信水平為95%時(shí)，HD9802-9S/R144 F2群體的ΔSNP-index集中在2號(hào)染色體上總長(zhǎng)為3.24 Mb 的候選區(qū)域內(nèi)，并且在7號(hào)染色體也上有一段長(zhǎng)為0.69 Mb的候選區(qū)域.說明HD9802-9S的7號(hào)染色體上確實(shí)存在與水稻不育性狀相關(guān)的突變基因.當(dāng)置信水平為99%時(shí)，HD9802-9S的ΔSNP-index集中在2號(hào)染色體上總長(zhǎng)為1.87 Mb的區(qū)域內(nèi)，在7號(hào)染色體上有一段長(zhǎng)為0.15 Mb的候選區(qū)域，如表4，但是這個(gè)候選區(qū)域內(nèi)沒有導(dǎo)致錯(cuò)譯的SNP突變.

HD9802-9S/R144 F2和HD9802-9S/R446 F2兩個(gè)群體的遺傳背景是不相同的，但是通過BSA重測(cè)序得出的結(jié)果是相同的，與HD9802-9S育性相關(guān)的基因定位在2號(hào)染色體和7號(hào)染色體上.因?yàn)檎{(diào)控HD9802S育性的主效基因tms5定位于2號(hào)染色體短臂上[12]，而HD9802-9S的不育基因來源于HD9802S，所以HD9802-9S調(diào)控育性的主效基因定位于2號(hào)染色體上，7號(hào)染色體上定位的候選基因?yàn)槲⑿Щ?

圖3 HD9802-9S/R144 F2群體的ΔSNP-index沿染色體分布圖

表3 HD9802-9S/R144 F2群體ΔSNP-index超過95%置信水平候選區(qū)域

表4 HD9802-9S/R144 F2群體ΔSNP-index超過99%置信水平候選區(qū)域

2.2 BSA重測(cè)序的數(shù)據(jù)分析HD9802-9S/R446F2群體的BSA重測(cè)序結(jié)果顯示，置信水平為95%時(shí)，2號(hào)染色體上的候選區(qū)域上有1988個(gè)導(dǎo)致錯(cuò)義突變的SNP突變位點(diǎn)，覆蓋431個(gè)候選基因，7號(hào)染色體上有15個(gè)導(dǎo)致錯(cuò)義突變的SNP突變位點(diǎn)，覆蓋4個(gè)候選基因.置信水平為99%時(shí)，2號(hào)染色體上的候選區(qū)域上有1 423個(gè)導(dǎo)致錯(cuò)義突變的SNP突變位點(diǎn)，覆蓋361個(gè)候選基因，7號(hào)染色體上沒有導(dǎo)致錯(cuò)義突變的SNP突變位點(diǎn)(表5).HD9802-9S/R144 F2群體的BSA重測(cè)序結(jié)果顯示，置信水平為95%時(shí)，2號(hào)染色體上的候選區(qū)域上有563個(gè)導(dǎo)致錯(cuò)義突變的SNP突變位點(diǎn)，覆蓋120個(gè)候選基因，7號(hào)染色體上的候選區(qū)域上有15個(gè)導(dǎo)致錯(cuò)義突變的SNP突變位點(diǎn)，覆蓋4個(gè)候選基因.置信水平為99%時(shí)，2號(hào)染色體上的候選區(qū)域上有367個(gè)導(dǎo)致錯(cuò)義突變的SNP突變位點(diǎn)，覆蓋64個(gè)候選基因，7號(hào)染色體上沒有導(dǎo)致錯(cuò)義突變的SNP突變位點(diǎn)(表6).

表5 HD9802-9S/R446F2群體SNP數(shù)量統(tǒng)計(jì)

表6 HD9802-9S/R144F2群體SNP數(shù)量統(tǒng)計(jì)

總SNP數(shù)量為95%水平的所有SNP數(shù)量，包含外顯子上導(dǎo)致錯(cuò)譯和不導(dǎo)致錯(cuò)譯的單堿基替換和內(nèi)含子上的單堿基突變，有效SNP數(shù)量為95%置信水平內(nèi)導(dǎo)致錯(cuò)譯的SNP數(shù)量

HD9802-9S/R446 F2和HD9802-9S/R144 F2兩個(gè)群體的BSA重測(cè)序結(jié)果中，置信水平為95%時(shí)，兩個(gè)群體重疊的候選基因基因共有88個(gè)，其中84個(gè)位于2號(hào)染色體上，4個(gè)位于7號(hào)染色體上.置信水平為99%時(shí)，兩個(gè)群體重疊的候選基因共有64個(gè)，全部位于2號(hào)染色體上，7號(hào)染色體上沒有候選基因.

置信水平為95%時(shí)，HD9802-9S的7號(hào)染色上的4個(gè)候選基因分別是BGIOSGA024073、BGIOSGA025960、BGIOSGA024051和BGIOSGA024043.在GO數(shù)據(jù)庫(http://geneontology.org/)上查找這4個(gè)基因的注釋，其中BGIOSGA024073基因的產(chǎn)物能夠與ATP，核苷酸和未折疊的蛋白質(zhì)結(jié)合；BGIOSGA025960基因的產(chǎn)物能夠與鈣離子結(jié)合，且功能與物質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)；BGIOSGA024051基因與調(diào)控植物的晝夜節(jié)律相關(guān)；BGIOSGA024043基因還沒有被注釋.目前還沒有這4個(gè)基因功能研究的相關(guān)報(bào)道.

置信水平為99%時(shí)，HD9802-9S的2號(hào)染色體上有64個(gè)候選基因，其中有44個(gè)基因在GO數(shù)據(jù)庫上有注釋.BGIOSGA006998、BGIOSGA007885、BGIOSGA006793、BGIOSGA006791、BGIOSGA006788、BGIOSGA007888、BGIOSGA006760、BGIOSGA006749、BGIOSGA007908基因產(chǎn)物是膜的組成部分；BGIOSGA007667基因產(chǎn)物是葉綠體被膜的組成部分；BGIOSGA007008基因參與調(diào)節(jié)翻譯保真度；BGIOSGA007007基因產(chǎn)物有蛋白質(zhì)-半胱氨酸S-棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶活性；BGIOSGA006989基因與細(xì)胞核有關(guān)聯(lián)；BGIOSGA007706、BGIOSGA006781、BGIOSGA006780基因產(chǎn)物可以與蛋白質(zhì)結(jié)合；BGIOSGA006986、BGIOSGA006985、BGIOSGA006984參與跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)過程；BGIOSGA006983基因產(chǎn)物與質(zhì)膜有關(guān)；BGIOSGA006962基因參與GTP酶活性的正調(diào)節(jié)；BGIOSGA007886基因產(chǎn)物可以與序列特異性DNA結(jié)合；BGIOSGA006786、BGIOSGA006784、BGIOSGA007890、BGIOSGA007891與植物體內(nèi)養(yǎng)分儲(chǔ)存等活動(dòng)相關(guān)；BGIOSGA007894基因參與調(diào)控植物根系發(fā)育；BGIOSGA007895基因產(chǎn)物有水解酶活性，可作用于酯鍵；BGIOSGA006775基因產(chǎn)物能夠與核酸結(jié)合；BGIOSGA007898基因參與調(diào)控植物根冠發(fā)育；BGIOSGA006773基因參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控，與DNA模板化相關(guān)；BGIOSGA006772基因參與植物的代謝過程；BGIOSGA006771、BGIOSGA006762基因產(chǎn)物具有蛋白質(zhì)二聚活性；BGIOSGA006763基因產(chǎn)物可以與DNA結(jié)合；BGIOSGA006759基因參與植物對(duì)細(xì)菌的防御反應(yīng)；BGIOSGA006758基因產(chǎn)物可以與鋅離子結(jié)合；BGIOSGA006754基因參與調(diào)控植物對(duì)脫落酸的反應(yīng)；BGIOSGA007905基因產(chǎn)物參與植物細(xì)胞壁組織組成；BGIOSGA006752、BGIOSGA006751基因產(chǎn)物具有電子載體活性；BGIOSGA006748基因與植物氣孔復(fù)合體發(fā)育相關(guān).還有20個(gè)基因沒有注釋.

3 討論

我們分別構(gòu)建HD9802-9S/R446和HD9802-9S/R144兩個(gè)有不同父本遺傳背景的F2代群體，將這兩個(gè)群體的可育混池、不育混池和親本池進(jìn)行BSA重測(cè)序，把HD9802-9S的不育性狀相關(guān)基因定位在2號(hào)染色體和7號(hào)染色體上.HD9802-9S的不育基因來源于HD9802S，而調(diào)控HD9802S的主效基因tms5的突變位點(diǎn)定位于2號(hào)染色體短臂上[11]，所以HD9802-9S的BSA重測(cè)序結(jié)果中，超過99%置信水平的范圍定位在2號(hào)染色體上是可信的.前期的研究中我們對(duì)HD9802S的不育基因做了定位分析[10]，結(jié)果顯示，在99%置信水平，HD9802S的不育相關(guān)基因主要定位在2號(hào)染色體上，在4號(hào)染色體上也存在超過99%置信水平的候選基因，在7號(hào)染色體上沒有定位到候選基因.人工氣候箱鑒定結(jié)果顯示(表7，表8)，HD9802S在14.5 h光照，23.5 ℃日均溫條件下，花粉不育率為100%，對(duì)照培矮64S為99.24%±0.42%；HD98092-9S在14.5 h光照，24 ℃日均溫條件下，花粉不育率為99.56%，對(duì)照培矮64S為99.48%.由此可以看出，HD9802-9S的轉(zhuǎn)育溫度比HD9802S的高.在海南連續(xù)三年冬季大田繁殖時(shí)，HD9802-9S的產(chǎn)量比HD9802S高，或者HD9802-9S產(chǎn)量底、而HD9802S基本絕收，說明HD9802-9S的轉(zhuǎn)育啟始溫度高于HD9802S，或是HD9802-9S的低溫耐受性弱于HD9802S.這進(jìn)一步印證HD9802-9S和HD9802S的育性調(diào)控基因有差異，我們推測(cè)差異基因位于4號(hào)染色體和7號(hào)染色體上.

表7 HD9802S人工氣候箱鑒定結(jié)果

表8 HD9802-9S人工氣候箱鑒定結(jié)果

tms5基因?qū)λ居哉{(diào)控的分子機(jī)制已經(jīng)被揭示.Zhou等人發(fā)現(xiàn)tms5基因的第71位堿基由C突變?yōu)锳，產(chǎn)生一個(gè)提前終止的密碼子，并將HD9802S的tms5基因進(jìn)行測(cè)序發(fā)現(xiàn)HD9802S也存在這一突變，所以他們認(rèn)為HD9802S的溫敏不育性狀的主效基因?yàn)閠ms5[11].這一結(jié)論與我們得出的BSA重測(cè)序結(jié)果一致.但是我們?cè)贖D9802S的4號(hào)染色體上定位并篩選出62個(gè)與花粉育性相關(guān)的候選基因，其中有20個(gè)候選基因位于99%置信水平，這62個(gè)候選基因中，有34個(gè)基因已經(jīng)被注釋.在HD9802-9S的7號(hào)染色體上也定位到4個(gè)候選基因，其中有3個(gè)基因已經(jīng)被注釋.這兩個(gè)染色體上的候選基因中可能存在調(diào)控HD9802S和HD9802-9S之間花粉不育性差異的基因.在之后的研究中，我們主要研究定位于4號(hào)染色體和7號(hào)染色體上的候選基因，篩選出對(duì)tms5調(diào)控機(jī)制有影響、對(duì)水稻溫敏不育性狀有調(diào)控作用的微效基因，從而篩選出影響HD9802-9S和HD9802S花粉育性的差異基因，探究基因影響花粉育性的分子機(jī)制.