鳳梨內生菌篩選鑒定及拮抗效果評價

劉惠英，朱志強，陳嘉敏，羅美林，熊玉杰，易璐瑤，魏蜜

(1.湖北工程學院生命科學技術學院，特色果蔬質量安全控制湖北省重點實驗室，湖北 孝感 432000；2.湖北大學生命科學學院，湖北 武漢 430062)

0 引言

鳳梨(Ananascomosus)又名菠蘿，屬鳳梨科(Bromeliaceae)鳳梨屬(Ananas)多年生草本果樹植物，營養(yǎng)生長迅速，生產周期短，是世界重要的果樹之一.在我國華南沿海一帶分布廣泛.作為熱帶地區(qū)特色水果，葉片細長的單子葉植物.不僅具有觀賞價值，可作為室內常綠觀賞花卉，還可以吸收污染物，從而作為空氣污染指示植物[1].內生菌在植物中看起來微不足道，但內生菌可通過自身代謝物或通過信號傳導對植物產生作用.有內生菌存在的植物一般比無內生菌植物生長迅速.一方面是：內生菌可分泌IAA、吲哚乙酸、激動素等促生長激素；另一方面是：增強植物對營養(yǎng)元素氮、磷、鉀的吸收[2].在一株植物中，并非只有一種內生菌，眾多的內生菌協(xié)調的存在于宿主體內，通過它們的共同作用，促進植物的生長[3].另外，內生菌之間也相互制約，一種內生菌可能會影響一種甚至多種內生菌在宿主植物中的生存，進而達到微環(huán)境的動態(tài)平衡[4].

本課題以鳳梨為原料，對內生菌進行篩選和鑒定，通過平板對峙培養(yǎng)法篩選出3株對蔬菜軟腐病菌菊迪基氏菌有拮抗效果的生防細菌，并通過形態(tài)學、生理生化和分子手段對其進行鑒定.評價了篩選的生防菌對常見細菌性病害和真菌病害的拮抗作用，并進一步評價了其解磷固氮和產纖維素酶能力，這對生防菌的選用及植物抗病促生提供了理論基礎及參考，為拓展生物防治的微生物資源奠定了一定的基礎.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試葉片 鳳梨葉片于2018年10月采自湖北省孝感市孝南區(qū)臥龍鄉(xiāng)鳳梨種植基地.

1.1.2 供試菌株 病原細菌：蔬菜軟腐病菌菊迪基氏菌DickeyachrysanthemiHBEU-9、胡蘿卜果膠桿菌PectobacteriumcarotovorumZX-1、丁香假單胞菌PseudomonassyringaeG1、黃單胞菌XanthomonasarboricolaDW3F3.

病原真菌：燕麥鐮孢菌FusariumavenaceumRot2、膠孢炭疽菌ColletotrichumgloeosporioidesPearE、互隔交鏈孢霉Alternariaalternatezzha.

以上所有菌株均由湖北工程學院特色果蔬質量安全控制湖北省重點實驗室提供.

1.1.3 主要培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基[5]：NaCl 10 g，蛋白胨10 g，酵母粉5 g，瓊脂18 g，加入蒸餾水定容至1 000 mL，pH 7.0～7.2；PDA培養(yǎng)基[5]：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，加蒸餾水定容至1 000 mL；PD則不加瓊脂.

生理生化鑒定所需培養(yǎng)基：參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[6].

PVK培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，酵母浸膏0.5 g，NaCl 0.2 g，Ca3(PO4)25 g，(NH4)2SO40.5 g，KCl 0.2 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，FeSO4·7H2O 0.002 g，瓊脂粉18 g，0.4%溴酚藍(pH6.7)6 mL，加蒸餾水定容至1 000 mL；Asnby培養(yǎng)基：KH2PO40.2 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，NaCl 0.2 g，CaCO35 g，甘露醇10.0 g，CaSO4·2H2O 0.1 g，瓊脂18 g，加蒸餾水定容至1 000 mL；纖維素酶培養(yǎng)基：CMC 10 g，蛋白胨10 g，酵母粉10 g，NaCl 5 g，KH2PO41 g，瓊脂18 g，加蒸餾水定容至1 000 mL，pH 7.0.

以上所有藥品試劑均購于生工生物工程(上海)股份有限公司，馬鈴薯則購于孝感當地超市.

1.2 方法

1.2.1 鳳梨拮抗內生菌的分離與篩選 將鳳梨葉片洗凈涼干后于超凈工作臺上進行表面消毒處理[7]：70%乙醇中浸泡2～3 s后，用0.1% 酸性升汞水溶液處理1～3 min，再用無菌水清洗3次.

對表面已消毒的材料采用研磨法[6]分離內生菌.所得研磨勻漿適當稀釋，涂布于 LB、PDA平板上于28 ℃培養(yǎng)2～7 d.待長出菌落后采用培養(yǎng)皿稀釋培養(yǎng)法[7]和平板劃線分離法[7]進行內生菌的分離純化，直到得到單菌落，然后將菌落形態(tài)特征不同的單菌落分別挑取并及時分離編號，4 ℃保存?zhèn)溆?

初篩：采用點接法[6]進行初步篩選.量取100 μLD.chrysanthemiHBEU-9病原細菌發(fā)酵液，在LB平板上進行涂布，待干燥后用接種針分別挑取各內生菌點于平板上，每皿采用十字交叉法點接一種內生菌，對照不接種，30 ℃下培養(yǎng)3～7 d，觀察有無抑菌圈及抑菌圈直徑，測量抑菌圈直徑.

復篩：采用發(fā)酵液打孔法[6]進行再次篩選.量取100 μLD.chrysanthemiHBEU-9病原細菌發(fā)酵液，在LB平板上進行涂布，待干燥后采用十字交叉法在平板上打4個對稱的4 mm小孔，每孔接種20 μL的內生菌發(fā)酵液，對照不接種，30 ℃下培養(yǎng)3～7 d，觀察有無抑菌圈及抑菌圈直徑，測量抑菌圈的直徑.

1.2.2 鳳梨內生菌的鑒定

1)形態(tài)學鑒定.菌落形態(tài)觀察[6]：將內生菌發(fā)酵液稀釋涂布于LB平板上30 ℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落生長情況、顏色和大小、性狀、邊緣、表面、透明度等.

革蘭氏染色[6]：參照Hucker修改法[5]對獲得的內生菌進行革蘭氏染色，顯微鏡下觀察染色結果，判斷其為革蘭氏陽性或陰性菌.

2)分子生物學鑒定.參考左山等[8]的分子生物學實驗方法，進行內生菌菌株DNA提取，使用引物F27(AGAGTTTGA-TCCTGGCTCAG)和R1492(TACGGCTACC-TTGTTACGACTT)進行PCR擴增.反應條件為：在94 ℃變性4 min；94 ℃變性30 s；然后55 ℃進行退火30 s，72 ℃進行延伸1 min，一共34個循環(huán)；最后在72 ℃下進行延伸10 min.得到的產物通過瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送天一輝遠有限公司測序，得到測序結果后在NCBI網站上經過BLAST同源性比較，使用MEGA6.0構建系統(tǒng)發(fā)育樹.

1.2.3 拮抗效果測定 內生菌發(fā)酵液制備[7]：取1%接種量把內生菌F-2、F-3-1、F-3-2分別接種于LB液體培養(yǎng)基，在180 r/min，30 ℃條件下?lián)u床培養(yǎng)12～18 h.

抑制病原細菌拮抗效果測定[9]：采用平板對峙法[5]，在無菌超凈工作臺上，取病原細菌D.chrysanthemiHBEU-9、P.syringaeG1、X.arboricolaDW3F3、P.carotovorumZX-1發(fā)酵液100 μL在LB平板上涂布，內生菌接種方法參照對內生菌的篩選實驗，對照不接種，30 ℃下培養(yǎng)3～7 d，每隔12 h觀察是否產生抑菌圈，測量并記錄抑菌直徑.

抑制病原真菌拮抗效果測定[10]：采用平板對抗法[5]，在無菌超凈工作臺上，將病原菌F.avenaceumRot2、C.gloeosporioidesPearE、A.alternatezzha菌塊用打孔器接種于PDA培養(yǎng)基中央，內生菌接種方法參照對病原細菌的拮抗實驗，對照不接種，28 ℃條件下培養(yǎng)3～7 d，測量各篩選的內生菌菌落邊緣與病原真菌菌落邊緣的抑菌圈并記錄.

1.2.4 部分生化指標鑒定 生理生化鑒定參照《伯杰細菌鑒定手冊》[11]和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[6]進行.

溶磷能力測定：分別在PVK培養(yǎng)基上點接所得內生菌，于30 ℃培養(yǎng)，每隔12 h觀察一次，待出現解磷圈及時記錄.

固氮能力測定：分別在Asnby培養(yǎng)基上采用劃線法接種所得內生菌，于30 ℃培養(yǎng)，每隔12 h觀察一次，記錄菌株的生長狀況.

產纖維素酶能力測定：分別于纖維素酶培養(yǎng)基上點接所得內生菌，于30 ℃培養(yǎng)，每隔12 h觀察記錄平板上菌落的生長情況.

2 結果與分析

2.1 鳳梨拮抗內生菌的分離與篩選將分離到的內生菌進行拮抗效果篩選.根據所獲得的菌株與病原菌進行平板對峙分析，結果表明有3株內生細菌對以上4種病原細菌和3種病原真菌均有一定的抑制效果，將其編號為F-2、F-3-1、F-3-2.但本實驗未篩選到對上述病原細菌和真菌有抑制效果的內生真菌.

2.2 鳳梨內生菌的鑒定

2.2.1 形態(tài)學鑒定 如圖1所示，通過觀察發(fā)現3株內生細菌菌體呈桿狀，F-2和F-3-2芽胞為橢圓形到柱狀，F-3-1芽胞呈橢圓狀.3株內生菌幼齡菌落均為圓形，表面及邊緣較為光滑，均呈白色，培養(yǎng)24 h后菌落表面變得干燥且起皺，但邊緣仍保持光滑，菌落顏色也任然為白色.通過革蘭氏染色，顯微觀察3株菌均為紫色，故為3株內生菌均為革蘭氏陽性菌.

圖1 各菌株菌落及顯微形態(tài)

2.2.2 分子生物學鑒定 3株內生菌16S rDNA區(qū)域經過PCR擴增產物，均獲得了1 445 bp左右的堿基序列，在GenBank數據庫中均能找到同源性很高的相似菌株序列.使用MEGA6.0對3株內生菌進行同源性分析，同時構建系統(tǒng)發(fā)育樹.發(fā)現F-2與Bacillusamyloliquefaciensstrain 13(登錄號HM1070806.1)菌株序列相似度為95%(如圖2)，確定F-2菌株為解淀粉芽胞桿菌(B.amyloliquefaciens).F-3-1與Bacillusmegateriumstrain NBRC 15308(T)(登錄號MK424276.1)菌株序列相似度為97%(如圖3)，確定F-3-1菌株為巨大芽胞桿菌(B.megaterium).F-3-2與Bacillussubtilisstrain JCM 1465(登錄號MH145363.1)菌株序列相似度為94%(如圖4)，確定F-3-2菌株為枯草芽胞桿菌(B.subtilis).

圖3 內生菌F-3-1基因序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖4 內生菌F-3-2基因序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 拮抗效果測定3株目標內生菌與8株病原菌拮抗實驗表明，F-2對病原細菌D.chrysanthemiHBEU-9、P.syringaeG1、X.arboricolaDW3F3、P.carotovorumZX-1均有不錯的拮抗效果，尤其對P.syringaeG1的抑菌直徑達到28.83 mm，但是F-2對3株供試病原真菌均無明顯拮抗作用(如圖5，圖6)；F-3-1對病原真菌F.avenaceumRot2、C.gloeosporioidesPearE、A.alternatezzhazzha均有極強的抑制作用，抑菌率分別為：70.83%、91.67%、65.56%(如表1)，僅對病原細菌D.chrysanthemiHBEU-9、P.syringaeG1、X.arboricolaDW3F3有拮抗效果，抑菌直徑平均為13.25 mm左右(如圖6)；F-3-2對病原真菌的拮抗效果遠不如F-3-1，且僅對C.gloeosporioidesPearE、A.alternatezzhazzha有抑制作用，抑菌率為31.67%、23.88%，其對病原細菌的拮抗效果強于F-3-1，對X.arboricolaDW3F3、P.carotovorumZX-1的抑菌直徑分別為20.70 mm、13.33 mm均高于F-2，而對D.chrysanthemiHBEU-9、P.syringaeG1的抑制效果則低于F-2(如表2).即F-3-1表現出對多種病原真菌極強的抑制效果，可以開發(fā)為真菌的生防菌.F-2與F-3-2對真菌抑制效果較差，但對多種病原細菌表現出拮抗效果.可見不同的菌株的抗菌譜存在顯著差異.在利用內生菌進行生物防治時可以有針對性的使用一種或多種菌聯(lián)用來達到抗病害的效果.

表1 各菌株與不同病原真菌的抑菌率 %

表2 各菌株對病原細菌的抑菌直徑 mm

表中抑菌直徑小于5.00 mm的均記為0.00 mm

圖5 內生菌 F-3-1對各病原真菌的拮抗效果

圖6 3株內生菌對各病原細菌的拮抗效果

2.4 內生菌部分促生能力測定

2.4.1 內生菌解磷能力測定 分離的3株內生菌點接于PVK平板上，觀察解磷圈.從圖7可知，F-2、F-3-1、F-3-2均具有解磷能力，且F-2的解磷能力強于后者.說明F-2從磷酸三鈣中釋放游離磷酸的能力更強，能更好地利用環(huán)境中的磷元素.

圖7 3株內生菌在PVK培養(yǎng)基上的生長情況

2.4.2 內生菌固氮能力測定 將所得的3株內生菌接種在Asnby培養(yǎng)基(無氮)上，通過觀察其能否在無氮源的環(huán)境中生長，來測定其是否具有固氮能力.實驗結果如圖8所示，F-2無固氮能力，F-3-1、F-3-2均能在無氮源培養(yǎng)基上生長，說明其具有固氮能力.

圖8 3株內生菌在Asnby培養(yǎng)基(無氮)上的生長情況

2.4.3 內生菌產纖維素酶能力測定 在纖維素酶培養(yǎng)基上點接獲得的內生菌，觀察透明圈，即可判斷3株內生菌能否產生纖維素酶，實驗結果如圖9所示.3株內生菌都能產生透明圈，F-2、F-3-1、F-3-2均可以生成纖維素酶，并能分解纖維素.但從透明圈的大小判斷F-2和F-3-2的纖維素酶活性高于F-3-1.

圖9 各菌株在纖維素酶培養(yǎng)基上的生長情況

3 結論與討論

本課題探究了鳳梨內生菌對常見病原菌的生防效果，并從生理生化層面、形態(tài)學層面、分子生物學層面對所獲得3株內生菌進行鑒定.通過細菌真菌篩選方法，從鳳梨中篩選出18株內生菌，通過平板對峙最終得到3株優(yōu)良內生菌，分子生物學鑒定3株菌分別為BacillusamyloliquefaciensF-2，BacillusmegateriumF-3-1，BacillussubtilisF-3-2.為了明確其生防效果，又進一步進行了抑菌直徑的觀察，發(fā)現F-2和F-3-2對常見病原細菌有不錯的拮抗效果抑菌直徑平均為10 mm以上，F-3-1對常見病原真菌有極強的拮抗效果，平均抑菌率為76 %.同時，為了探究內生菌促進植物生長的特性，采用篩選培養(yǎng)基對3株內生菌進行溶磷固氮及產酶分析，結果發(fā)現3株菌解磷，產纖維素酶能力較好，F-3-1和F-3-2具有較好的固氮能力.

參考協(xié)同演化(co-evolution)理論，內生菌中內生真菌能與宿主植物建立更穩(wěn)定的長期共生關系，因而，內生真菌資源的發(fā)掘利用有待探索[12].從防治鳳梨黑斑病出發(fā)，本實驗獲得了具有高效防治效果的3株內生細菌不僅可以促進宿主植物抗病害能力，更能通過改善生長環(huán)境中的磷源促進植物生長.內生菌區(qū)別于普通拮抗菌，具有更大的利用潛力.雖然對內生菌的多個指標進行了測定，但是缺乏對這3株芽胞桿菌的深層抗菌基因簇的研究，鑒定獲得的內生菌為芽胞桿菌，我們查閱文獻發(fā)現，芽胞桿菌已發(fā)現的抑菌物質包括：豐源素、伊枯草素等非核糖體途徑產生的脂肽類抗生素[13]，以及核糖體途徑產生的脂肽類如類羊毛硫抗生素等，脂肽類物質是芽胞桿菌的主要抗菌物質，其表現為較強的抗真菌和極弱的抗細菌效果[14]，另芽胞桿菌可分泌聚酮類物質亦有抗菌作用，研究表明聚酮針對細菌有很強的抑制作用[15-16]，結合我們的內生菌F-3-1主要拮抗病原真菌的特性，推測其抗菌活性和脂肽類物質有關；F-2和F-3-2的拮抗細菌作用與聚酮類物質有關.因此對內生菌的研究還有待深入，進一步明確其基因層面抗菌機理.