王 鵬,劉 欣,郭樹豫,王云飛△
1.上海交通大學附屬仁濟醫(yī)院南院血管外科(上海 200000);2.上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院中醫(yī)外科(上海 200032)
難愈性創(chuàng)面是外科的常見病,占外科總住院人數(shù)1.5%~3%[1-2],中醫(yī)藥促進創(chuàng)面愈合具有悠久的歷史,龍華醫(yī)院顧氏外科早在上世紀七八十年代,就開始了對慢性難愈性創(chuàng)面的臨床[3-4]及實驗[5-7]研究,相關研究發(fā)現(xiàn)中醫(yī)藥可以有效促進創(chuàng)面愈合,對難愈性創(chuàng)面有良好的療效。我們運用“四君子加川牛膝方”治療下肢創(chuàng)面取得了一定的治療效果[8-9],并開展了相應的機制研究,進一步探討其促進難愈性創(chuàng)面愈合的機制。
1 實驗動物 實驗動物取雄性SD(Sprague-Dawly)大鼠,SPF級別,64只,平均體質量為(234.05±26.91)g,均為12周齡。該實驗動物由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供。許可證號(實驗動物):SCXK(滬)2008-0016。
2 主要試劑及儀器 本研究參考《太平惠民和劑局方》中“四君子湯”,由黨參、茯苓、白術各9 g,甘草6 g組成。該中藥委托本院制劑室制備。中藥按照傳統(tǒng)工藝制成水煎劑,依據《中藥藥理研究方法學》進行人鼠等效劑量換算,為2.97 g/kg。同時將水煎劑進行減壓濃縮,濃度為0.30 g/ml。而四君子加川牛膝方,則由黨參、茯苓、白術各9 g,川牛膝30 g,甘草6 g組成,換算人鼠等效劑量是5.67 g/kg,減壓濃縮至0.57 g/ml。川牛膝方是由川牛膝30 g組成的,人鼠等效劑量是2.7 g/kg,減壓濃縮至0.27 g/ml。戊巴比妥鈉(Sigma公司,批號為20100312);大鼠血小板衍化生長因子(Platelet derived growth factor,PDGF)的ELISA試劑盒,批號201501231,來源上海西唐生物。檸檬酸鈉緩沖溶液,批號BYL40864,來源上?;鶢栴D公司;PBS,批號BYL40657,來源上?;鶢栴D公司;二甲苯,批號10023418,來源上海國藥集團;蘇木精,批號H8070-5,來源上海索萊寶生物。胎牛血清,批號10099-141,來源Gibco;0.25%胰蛋白酶,批號BYL40926,來源上海基爾頓公司;BCA蛋白定量試劑盒,批號PICPI23223,來源thermo;蛋白預染Marker,批號SM1811,來源Fermentas;NC膜,批號HATF00010,來源millipore;SDS-PAGE凝膠制備試劑盒,批號G2003,來源于谷歌生物。
芬蘭雷勃酶標儀,型號MK3;微量高速離心機(國產);吉爾森P型移液器(Pipetman);隔水式恒溫培養(yǎng)箱(國產);Leica(萊卡公司)水浴鍋,型號HI1210;吉爾森P型移液器(Pipetman),型號 P20。
3 實驗方法 參照文獻[10-11]進行動物造模,實驗前12 h開始對實驗大鼠進行禁食,但給予定量飲水。實驗當天測量大鼠體重,單次腹腔注射3%戊巴比妥鈉溶液進行實驗動物的麻醉(麻醉劑量按40 mg/kg體質量換算)。麻醉滿意后,完成大鼠造模區(qū)備皮及標記,予電推剪于右側臀腿部位剃毛,并用直徑25 mm的塑料瓶蓋局部標記。在無菌條件下用手術剪沿標記在備皮部位剪開,做直徑為25 mm的圓形全層皮膚缺損,后腹腔注射氫化可的松琥珀酸鈉(按照80 mg/kg體質量換算),完成下肢難愈性創(chuàng)面大鼠的動物造模。
4 動物分組、處理及取材 將模型大鼠64只隨機分為四組:四君子湯組、四君子加川牛膝方組、生理鹽水組、川牛膝組,每組均為16只。實驗大鼠分籠單獨飼養(yǎng)。造模后次日灌胃給藥,四組實驗大鼠依次給予四君子湯中藥、四君子加川牛膝方中藥、生理鹽水、川牛膝,每日 1次,每次2 ml。四組實驗大鼠均于造模后,每日1次創(chuàng)面清潔換藥。換藥前1∶5000呋喃西林溶液清潔創(chuàng)面,單層生理鹽水紗布濕敷,兩層無菌干紗布覆蓋,膠布固定。
每組16只動物隨機分成2批。分別于造模后的第7天、第14天進行取材。麻醉方法同上,單次腹腔內注射戊巴比妥鈉(按40 mg/kg換算)。麻醉滿意后,用眼科手術剪取創(chuàng)緣0.5 cm以內少量肉芽組織。立即放入凍存管內,超低溫冰箱保存。同時行腹主動脈抽血,每只大鼠抽取8 ml血液,放入抗凝管,超低溫冰箱保存。
5 PDGF檢測 蒸餾水按1∶10倍將標本稀釋液稀釋。測定前用標本稀釋液按1∶5倍稀釋血清。在使用前,將標準品液加入1 ml蒸餾水混合均勻,配制成20 ng/ml的溶液。取1.5 ml離心管8個,在第一管中加入標本稀釋液900 μl,在第二至第八管中分別加入標本稀釋液500 μl。在第一管中加20 ng/ml的標準品溶液100 μl,后將溶液置于漩渦混合器上,混合均勻,并予加樣器吸出500 μl,將此溶液移至第二管。同法反復進行對倍稀釋,最終從第七管中吸出溶液500 μl棄去。將第八管作為空白對照組。將標準品或待測樣品100 μl依次加入每個孔中,充分混合均勻,37℃下放置40 min。充分洗滌反應板,并在濾紙上印干。將蒸餾水和第一抗體工作液各50 μl加入每個孔中,反應板混勻后,并置37℃ 20 min。充分洗滌反應板5次,濾紙上印干。將酶標抗體工作液100 μl加入每個孔中。將反應板置37℃10 min。再次充分洗滌反應板5次,濾紙印干。每孔分別加入底物工作液100 μl,放置37 ℃暗處進行反應15 min。后每孔加入100 μl終止液,并進行混勻。30 min內通過酶標儀在450 nm處檢測吸光值。將所有的OD值減除空白值之后,再進行計算。將標準品不同濃度作為橫坐標,OD值作為縱坐標,通過軟件作圖,描繪出標準曲線。依據樣品的OD值計算相應PDGF的含量,再乘上稀釋倍數(shù)。
6 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件。正態(tài)分布的數(shù)據組間比較采用方差分析,以均數(shù)±標準差表示。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。
1 各組肉芽組織HE染色結果 造模后第7天創(chuàng)面肉芽組織HE染色,生理鹽水組血管生成較少,成纖維細胞較少;四君子加川牛膝方組,血管生成中度,成纖維細胞中度;四君子湯組,成纖維細胞較多;川牛膝組,成纖維細胞較大,新生血管較少(圖1)。
造模后第14天創(chuàng)面肉芽組織HE染色,生理鹽水組新生血管中度,成纖維細胞中度;四君子加川牛膝方組,成纖維細胞中度,新生血管較多;四君子湯組,新生血管中度,成纖維細胞中度;川牛膝組,新生血管較多(圖2)。
A:生理鹽水組;B:四君子加川牛膝方組;C:四君子湯組;D:川牛膝組
A:生理鹽水組;B:四君子加川牛膝方組;C:四君子湯組;D:川牛膝組
2 各組大鼠PDGF濃度比較 見表1。在造模后第7天,四君子湯組、四君子加川牛膝方組與生理鹽水組比較,PDGF表達明顯增高(F=4.30,P<0.05);川牛膝組與生理鹽水組比較,兩組PDGF無統(tǒng)計學差異(P>0.05);四君子湯組與四君子加川牛膝方組的PDGF表達無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。
造模后第14天,四君子湯組、四君子加川牛膝方組、川牛膝組、生理鹽水組,組間比較,PDGF表達水平無統(tǒng)計學差異(F=0.85,P>0.05)。
表1 各組大鼠PDGF濃度比較(mg/ml)
注:與生理鹽水組比較,*P<0.05;與川牛膝方組比較,△P<0.05
下肢難愈性創(chuàng)面屬中醫(yī)“潰瘍”、“臁瘡”范疇。早于唐醫(yī)書中即有記載,《華佗神醫(yī)秘傳·論癰瘡》云:“臁瘡有內、外之異,因臟腑中有濕毒,乃外發(fā)為瘡,亦有因打仆抓磕,或遇毒蟲惡犬咬破損傷,因而成瘡者?!敝嗅t(yī)學對下肢難愈性皮膚潰瘍的治療歷史悠久,療效良好,歷代醫(yī)書都對此做過闡述,并在臨床經驗、方藥劑型的基礎上,發(fā)展形成理論,構成了獨特的理論體系。上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院中醫(yī)外科,傳承顧氏外科,認為下肢難愈性皮膚潰瘍難以愈合的根本原因是“虛”,即正氣虛損[10]。我們認為下肢皮膚潰瘍創(chuàng)面“腐肉已脫”,肉芽色暗紅“新肉不生或難生”,經久難愈合;并且患者年高,多臟腑功能失調,正氣不足,故而膚失榮養(yǎng)。同時中醫(yī)“脾主肌肉”、“脾為氣血生化之源”、“脾主運化”的理論強調,全身肌肉都依靠脾胃運化的水谷精微化生氣血來營養(yǎng),并促進創(chuàng)面肉芽組織生長,修復組織缺損[11]。因此在治療方面,尤其重視“益氣健脾”。在分期辨證論治的基礎上,將“益氣健脾”貫穿治療始終,治療不同階段側重略有不同。
四君子湯是健脾益氣的經典代表方劑。宋朝《太平惠民和劑局方》中記載了“四君子湯”,由人參、白術、茯苓、甘草四味藥物組成,該實驗研究以黨參代替人參。該方平和穩(wěn)妥,遵從“君子致中和”的古意,故方名四君子?!夺t(yī)方集解》云此方 “人參甘溫,大補元氣,為君。白術苦溫,燥脾補氣,為臣;茯苓甘淡,滲濕瀉熱,為佐。甘草甘平,和中益土,為使也。氣足脾運,飲食倍進,則余臟受蔭,而色澤身強矣?!弊怨排Oプ鳛橐浰帲t(yī)家認為其“引藥下行”,歷代本草均有論述。如《本草經疏》提出牛膝“性善下行”,并擅長 “病在下”疾患的治療。四君子加川牛膝方,以補虛生肌為治療原則,加川牛膝為引經藥以引藥下行,促使藥力直達病所,促進創(chuàng)面愈合。前期研究發(fā)現(xiàn)[12-13],四君子湯加引經藥川牛膝,可提高創(chuàng)面的愈合速度,有效治療下肢皮膚潰瘍。
本實驗結果顯示,造模后第7天,創(chuàng)面肉芽組織HE染色,四君子湯組,成纖維細胞較多;生理鹽水組血管生成較少,成纖維細胞較少。與此同時造模后第7天,PDGF的表達,四君子湯組明顯高于生理鹽水組。
創(chuàng)面修復是將損傷組織結構的完整性進行修復和恢復的過程,包括了炎癥反應、細胞增殖和創(chuàng)面重建等幾個階段,主要包括:新生毛細血管生長、成纖維細胞增殖分裂、細胞外基質纖維化以及表皮細胞增生覆蓋創(chuàng)面[14],最終完成再上皮化或者形成瘢痕。皮膚損傷,由于其存在嚴重的真皮缺損,需要先形成肉芽組織以填補缺損,這是整個創(chuàng)面修復過程中的最先環(huán)節(jié),也是關鍵環(huán)節(jié)。而肉芽組織是由成纖維細胞與毛細血管共同組成的,因此成纖維細胞在創(chuàng)面修復中發(fā)揮重要的功能,其在創(chuàng)面愈合過程中起到遷移、增殖、分泌基質成份以及膠原纖維的作用,并且分泌多種細胞因子參與創(chuàng)面愈合。成纖維細胞與新生的毛細血管等共同構成肉芽組織,填補了組織缺損,為表皮細胞創(chuàng)造條件,促進創(chuàng)面愈合。因此成纖維細胞能否正常增殖,對促進創(chuàng)面愈合、維護機體功能,發(fā)揮了重要的作用。成纖維細胞的增殖能力成為反映其參與組織修復能力的重要指標。本次實驗結果表明,在造模后第7天,創(chuàng)面肉芽組織HE染色提示,四君子湯組,成纖維細胞較多;生理鹽水組血管生成較少,成纖維細胞較少。
PDGF是一種間接或直接的參與創(chuàng)面愈合的生長因子,參與細胞和組織的增殖與分化等過程,具有廣泛的生物學活性,在創(chuàng)面修復過程中起關鍵調控作用[15]。在創(chuàng)面修復過程中,創(chuàng)面或其周圍組織細胞可以通過旁分泌或者自分泌產生PDGF,而PDGF則可間接或者直接的參與組織及血管的修復,從而對創(chuàng)面的修復起調控作用。PDGF與細胞膜表面的受體結合后,可以通過受體的介導,激活細胞內MAPK信號轉導途徑,導致一系列連鎖反應。PDGF能促進成纖維細胞的增殖,并促進其分泌細胞外基質,在創(chuàng)面愈合過程中起關鍵調控作用。PDGF還可趨化單核細胞、中性粒細胞以及成纖維細胞,促使這些細胞遷移至創(chuàng)傷部位;PDGF 作為成纖維細胞的有絲分裂原,對成纖維細胞的再生具有誘導作用,能夠增加肉芽組織中成纖維細胞的含量;同時PDGF 在體內還可激活巨噬細胞,促使巨嗜細胞合成血管內皮生長因子,從而促進血管新生,加速創(chuàng)面愈合。
中醫(yī)認為下肢皮膚潰瘍存在“腐去肌生”、“肌平皮長”的愈合階段,與之相類似,西醫(yī)學認為創(chuàng)面的愈合,先后經歷“炎癥反應期”、“肉芽增生期”、“上皮形成期”過程。因此我們針對難愈性創(chuàng)面“腐肉已脫,新肉不生或難生”階段,依據中醫(yī)“補虛生肌”、“脾主肌肉”的理論,應用益氣健脾中藥四君子湯以促進肉芽組織生長,填充組織缺損,促進創(chuàng)面愈合。在造模后第7天創(chuàng)面以肉芽增生為主,補虛生肌類中藥四君子湯,通過上調PDGF等細胞因子的合成和分泌,PDGF通過趨化作用使單核細胞、中性粒細胞、巨噬細胞等向損傷部位聚集,利于創(chuàng)傷早期炎癥消退;同時PDGF能促進成纖維細胞、血管內皮細胞的增殖與分化[13-14],從而促進肉芽組織的生長,填充組織缺損;趨化角化細胞遷移,縮小創(chuàng)傷體積,并加速內皮細胞損傷修復,提高愈合速度。而造模后第14天,前期研究證實四君子湯組大鼠創(chuàng)面愈合平均時間為17.74 d,在造模后第14天,此時創(chuàng)面以“上皮化”為主,四君子湯益氣健脾促進肉芽增生作用起效甚微,故而對PDGF影響不大,與生理鹽水組比較無明顯差異。