四君子加川牛膝方對大鼠下肢難愈性創(chuàng)面血小板衍化生長因子表達的影響*

王 鵬，劉 欣，郭樹豫，王云飛△

1.上海交通大學附屬仁濟醫(yī)院南院血管外科(上海 200000)；2.上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院中醫(yī)外科(上海 200032)

難愈性創(chuàng)面是外科的常見病，占外科總住院人數(shù)1.5%～3%[1-2]，中醫(yī)藥促進創(chuàng)面愈合具有悠久的歷史，龍華醫(yī)院顧氏外科早在上世紀七八十年代，就開始了對慢性難愈性創(chuàng)面的臨床[3-4]及實驗[5-7]研究，相關研究發(fā)現(xiàn)中醫(yī)藥可以有效促進創(chuàng)面愈合，對難愈性創(chuàng)面有良好的療效。我們運用“四君子加川牛膝方”治療下肢創(chuàng)面取得了一定的治療效果[8-9]，并開展了相應的機制研究，進一步探討其促進難愈性創(chuàng)面愈合的機制。

材料與方法

1 實驗動物 實驗動物取雄性SD(Sprague-Dawly)大鼠，SPF級別，64只，平均體質量為(234.05±26.91)g，均為12周齡。該實驗動物由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供。許可證號(實驗動物)：SCXK(滬)2008-0016。

2 主要試劑及儀器 本研究參考《太平惠民和劑局方》中“四君子湯”，由黨參、茯苓、白術各9 g，甘草6 g組成。該中藥委托本院制劑室制備。中藥按照傳統(tǒng)工藝制成水煎劑，依據《中藥藥理研究方法學》進行人鼠等效劑量換算，為2.97 g/kg。同時將水煎劑進行減壓濃縮，濃度為0.30 g/ml。而四君子加川牛膝方，則由黨參、茯苓、白術各9 g，川牛膝30 g，甘草6 g組成，換算人鼠等效劑量是5.67 g/kg，減壓濃縮至0.57 g/ml。川牛膝方是由川牛膝30 g組成的，人鼠等效劑量是2.7 g/kg，減壓濃縮至0.27 g/ml。戊巴比妥鈉(Sigma公司，批號為20100312)；大鼠血小板衍化生長因子(Platelet derived growth factor，PDGF)的ELISA試劑盒，批號201501231，來源上海西唐生物。檸檬酸鈉緩沖溶液，批號BYL40864，來源上?；鶢栴D公司；PBS，批號BYL40657，來源上?；鶢栴D公司；二甲苯，批號10023418，來源上海國藥集團；蘇木精，批號H8070-5，來源上海索萊寶生物。胎牛血清，批號10099-141，來源Gibco；0.25%胰蛋白酶，批號BYL40926，來源上海基爾頓公司；BCA蛋白定量試劑盒，批號PICPI23223，來源thermo；蛋白預染Marker，批號SM1811，來源Fermentas；NC膜，批號HATF00010，來源millipore；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒，批號G2003，來源于谷歌生物。

芬蘭雷勃酶標儀，型號MK3；微量高速離心機(國產)；吉爾森P型移液器(Pipetman)；隔水式恒溫培養(yǎng)箱(國產)；Leica(萊卡公司)水浴鍋，型號HI1210；吉爾森P型移液器(Pipetman)，型號 P20。

3 實驗方法 參照文獻[10-11]進行動物造模，實驗前12 h開始對實驗大鼠進行禁食，但給予定量飲水。實驗當天測量大鼠體重，單次腹腔注射3%戊巴比妥鈉溶液進行實驗動物的麻醉(麻醉劑量按40 mg/kg體質量換算)。麻醉滿意后，完成大鼠造模區(qū)備皮及標記，予電推剪于右側臀腿部位剃毛，并用直徑25 mm的塑料瓶蓋局部標記。在無菌條件下用手術剪沿標記在備皮部位剪開，做直徑為25 mm的圓形全層皮膚缺損，后腹腔注射氫化可的松琥珀酸鈉(按照80 mg/kg體質量換算)，完成下肢難愈性創(chuàng)面大鼠的動物造模。

4 動物分組、處理及取材 將模型大鼠64只隨機分為四組：四君子湯組、四君子加川牛膝方組、生理鹽水組、川牛膝組，每組均為16只。實驗大鼠分籠單獨飼養(yǎng)。造模后次日灌胃給藥，四組實驗大鼠依次給予四君子湯中藥、四君子加川牛膝方中藥、生理鹽水、川牛膝，每日 1次，每次2 ml。四組實驗大鼠均于造模后，每日1次創(chuàng)面清潔換藥。換藥前1∶5000呋喃西林溶液清潔創(chuàng)面，單層生理鹽水紗布濕敷，兩層無菌干紗布覆蓋，膠布固定。

每組16只動物隨機分成2批。分別于造模后的第7天、第14天進行取材。麻醉方法同上，單次腹腔內注射戊巴比妥鈉(按40 mg/kg換算)。麻醉滿意后，用眼科手術剪取創(chuàng)緣0.5 cm以內少量肉芽組織。立即放入凍存管內，超低溫冰箱保存。同時行腹主動脈抽血，每只大鼠抽取8 ml血液，放入抗凝管，超低溫冰箱保存。

5 PDGF檢測 蒸餾水按1∶10倍將標本稀釋液稀釋。測定前用標本稀釋液按1∶5倍稀釋血清。在使用前，將標準品液加入1 ml蒸餾水混合均勻，配制成20 ng/ml的溶液。取1.5 ml離心管8個，在第一管中加入標本稀釋液900 μl，在第二至第八管中分別加入標本稀釋液500 μl。在第一管中加20 ng/ml的標準品溶液100 μl，后將溶液置于漩渦混合器上，混合均勻，并予加樣器吸出500 μl，將此溶液移至第二管。同法反復進行對倍稀釋，最終從第七管中吸出溶液500 μl棄去。將第八管作為空白對照組。將標準品或待測樣品100 μl依次加入每個孔中，充分混合均勻，37℃下放置40 min。充分洗滌反應板，并在濾紙上印干。將蒸餾水和第一抗體工作液各50 μl加入每個孔中，反應板混勻后，并置37℃ 20 min。充分洗滌反應板5次，濾紙上印干。將酶標抗體工作液100 μl加入每個孔中。將反應板置37℃10 min。再次充分洗滌反應板5次，濾紙印干。每孔分別加入底物工作液100 μl，放置37 ℃暗處進行反應15 min。后每孔加入100 μl終止液，并進行混勻。30 min內通過酶標儀在450 nm處檢測吸光值。將所有的OD值減除空白值之后，再進行計算。將標準品不同濃度作為橫坐標，OD值作為縱坐標，通過軟件作圖，描繪出標準曲線。依據樣品的OD值計算相應PDGF的含量，再乘上稀釋倍數(shù)。

6 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件。正態(tài)分布的數(shù)據組間比較采用方差分析，以均數(shù)±標準差表示。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 各組肉芽組織HE染色結果 造模后第7天創(chuàng)面肉芽組織HE染色，生理鹽水組血管生成較少，成纖維細胞較少；四君子加川牛膝方組，血管生成中度，成纖維細胞中度；四君子湯組，成纖維細胞較多；川牛膝組，成纖維細胞較大，新生血管較少(圖1)。

造模后第14天創(chuàng)面肉芽組織HE染色，生理鹽水組新生血管中度，成纖維細胞中度；四君子加川牛膝方組，成纖維細胞中度,新生血管較多；四君子湯組，新生血管中度，成纖維細胞中度；川牛膝組，新生血管較多(圖2)。

A:生理鹽水組；B:四君子加川牛膝方組；C:四君子湯組；D:川牛膝組

A:生理鹽水組；B:四君子加川牛膝方組；C:四君子湯組；D:川牛膝組

2 各組大鼠PDGF濃度比較 見表1。在造模后第7天，四君子湯組、四君子加川牛膝方組與生理鹽水組比較，PDGF表達明顯增高(F=4.30,P<0.05)；川牛膝組與生理鹽水組比較，兩組PDGF無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；四君子湯組與四君子加川牛膝方組的PDGF表達無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。

造模后第14天，四君子湯組、四君子加川牛膝方組、川牛膝組、生理鹽水組，組間比較，PDGF表達水平無統(tǒng)計學差異(F=0.85，P>0.05)。

表1 各組大鼠PDGF濃度比較(mg/ml)

注：與生理鹽水組比較，*P<0.05；與川牛膝方組比較，△P<0.05

討 論

下肢難愈性創(chuàng)面屬中醫(yī)“潰瘍”、“臁瘡”范疇。早于唐醫(yī)書中即有記載，《華佗神醫(yī)秘傳·論癰瘡》云：“臁瘡有內、外之異，因臟腑中有濕毒，乃外發(fā)為瘡，亦有因打仆抓磕，或遇毒蟲惡犬咬破損傷，因而成瘡者?！敝嗅t(yī)學對下肢難愈性皮膚潰瘍的治療歷史悠久，療效良好，歷代醫(yī)書都對此做過闡述，并在臨床經驗、方藥劑型的基礎上，發(fā)展形成理論，構成了獨特的理論體系。上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院中醫(yī)外科，傳承顧氏外科，認為下肢難愈性皮膚潰瘍難以愈合的根本原因是“虛”,即正氣虛損[10]。我們認為下肢皮膚潰瘍創(chuàng)面“腐肉已脫”，肉芽色暗紅“新肉不生或難生”，經久難愈合；并且患者年高，多臟腑功能失調，正氣不足，故而膚失榮養(yǎng)。同時中醫(yī)“脾主肌肉”、“脾為氣血生化之源”、“脾主運化”的理論強調，全身肌肉都依靠脾胃運化的水谷精微化生氣血來營養(yǎng)，并促進創(chuàng)面肉芽組織生長，修復組織缺損[11]。因此在治療方面，尤其重視“益氣健脾”。在分期辨證論治的基礎上，將“益氣健脾”貫穿治療始終，治療不同階段側重略有不同。

四君子湯是健脾益氣的經典代表方劑。宋朝《太平惠民和劑局方》中記載了“四君子湯”，由人參、白術、茯苓、甘草四味藥物組成，該實驗研究以黨參代替人參。該方平和穩(wěn)妥，遵從“君子致中和”的古意，故方名四君子?！夺t(yī)方集解》云此方 “人參甘溫，大補元氣，為君。白術苦溫，燥脾補氣，為臣；茯苓甘淡，滲濕瀉熱，為佐。甘草甘平，和中益土，為使也。氣足脾運，飲食倍進，則余臟受蔭，而色澤身強矣?！弊怨排Ｏプ鳛橐浰帲t(yī)家認為其“引藥下行”，歷代本草均有論述。如《本草經疏》提出牛膝“性善下行”，并擅長 “病在下”疾患的治療。四君子加川牛膝方，以補虛生肌為治療原則，加川牛膝為引經藥以引藥下行，促使藥力直達病所，促進創(chuàng)面愈合。前期研究發(fā)現(xiàn)[12-13]，四君子湯加引經藥川牛膝，可提高創(chuàng)面的愈合速度，有效治療下肢皮膚潰瘍。

本實驗結果顯示，造模后第7天，創(chuàng)面肉芽組織HE染色，四君子湯組，成纖維細胞較多；生理鹽水組血管生成較少，成纖維細胞較少。與此同時造模后第7天，PDGF的表達，四君子湯組明顯高于生理鹽水組。

創(chuàng)面修復是將損傷組織結構的完整性進行修復和恢復的過程，包括了炎癥反應、細胞增殖和創(chuàng)面重建等幾個階段，主要包括：新生毛細血管生長、成纖維細胞增殖分裂、細胞外基質纖維化以及表皮細胞增生覆蓋創(chuàng)面[14]，最終完成再上皮化或者形成瘢痕。皮膚損傷，由于其存在嚴重的真皮缺損，需要先形成肉芽組織以填補缺損，這是整個創(chuàng)面修復過程中的最先環(huán)節(jié)，也是關鍵環(huán)節(jié)。而肉芽組織是由成纖維細胞與毛細血管共同組成的，因此成纖維細胞在創(chuàng)面修復中發(fā)揮重要的功能，其在創(chuàng)面愈合過程中起到遷移、增殖、分泌基質成份以及膠原纖維的作用，并且分泌多種細胞因子參與創(chuàng)面愈合。成纖維細胞與新生的毛細血管等共同構成肉芽組織，填補了組織缺損，為表皮細胞創(chuàng)造條件，促進創(chuàng)面愈合。因此成纖維細胞能否正常增殖，對促進創(chuàng)面愈合、維護機體功能，發(fā)揮了重要的作用。成纖維細胞的增殖能力成為反映其參與組織修復能力的重要指標。本次實驗結果表明，在造模后第7天，創(chuàng)面肉芽組織HE染色提示，四君子湯組，成纖維細胞較多；生理鹽水組血管生成較少，成纖維細胞較少。

PDGF是一種間接或直接的參與創(chuàng)面愈合的生長因子，參與細胞和組織的增殖與分化等過程，具有廣泛的生物學活性，在創(chuàng)面修復過程中起關鍵調控作用[15]。在創(chuàng)面修復過程中，創(chuàng)面或其周圍組織細胞可以通過旁分泌或者自分泌產生PDGF，而PDGF則可間接或者直接的參與組織及血管的修復，從而對創(chuàng)面的修復起調控作用。PDGF與細胞膜表面的受體結合后，可以通過受體的介導，激活細胞內MAPK信號轉導途徑，導致一系列連鎖反應。PDGF能促進成纖維細胞的增殖，并促進其分泌細胞外基質，在創(chuàng)面愈合過程中起關鍵調控作用。PDGF還可趨化單核細胞、中性粒細胞以及成纖維細胞，促使這些細胞遷移至創(chuàng)傷部位；PDGF 作為成纖維細胞的有絲分裂原，對成纖維細胞的再生具有誘導作用，能夠增加肉芽組織中成纖維細胞的含量；同時PDGF 在體內還可激活巨噬細胞，促使巨嗜細胞合成血管內皮生長因子，從而促進血管新生，加速創(chuàng)面愈合。

中醫(yī)認為下肢皮膚潰瘍存在“腐去肌生”、“肌平皮長”的愈合階段，與之相類似，西醫(yī)學認為創(chuàng)面的愈合，先后經歷“炎癥反應期”、“肉芽增生期”、“上皮形成期”過程。因此我們針對難愈性創(chuàng)面“腐肉已脫，新肉不生或難生”階段，依據中醫(yī)“補虛生肌”、“脾主肌肉”的理論，應用益氣健脾中藥四君子湯以促進肉芽組織生長，填充組織缺損，促進創(chuàng)面愈合。在造模后第7天創(chuàng)面以肉芽增生為主，補虛生肌類中藥四君子湯，通過上調PDGF等細胞因子的合成和分泌，PDGF通過趨化作用使單核細胞、中性粒細胞、巨噬細胞等向損傷部位聚集，利于創(chuàng)傷早期炎癥消退；同時PDGF能促進成纖維細胞、血管內皮細胞的增殖與分化[13-14]，從而促進肉芽組織的生長，填充組織缺損；趨化角化細胞遷移，縮小創(chuàng)傷體積，并加速內皮細胞損傷修復，提高愈合速度。而造模后第14天，前期研究證實四君子湯組大鼠創(chuàng)面愈合平均時間為17.74 d，在造模后第14天，此時創(chuàng)面以“上皮化”為主，四君子湯益氣健脾促進肉芽增生作用起效甚微，故而對PDGF影響不大，與生理鹽水組比較無明顯差異。