乙醇-烏頭堿致心律失常的毒理分子機(jī)制研究進(jìn)展

潘美辰，周小偉，劉艷，王宇寧，邱鑫罡，吳士凡，劉茜

（1.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系，湖北 武漢 430030；2.湖北崇新司法鑒定中心，湖北 武漢 430403）

烏頭屬植物作為廣泛使用的中草藥代表之一，具有祛風(fēng)除濕、溫經(jīng)止痛等藥理功效[1]。民間有用草烏、川烏泡酒，或在烹飪食物時(shí)添加草烏、附片等食療習(xí)慣。但烏頭屬植物大多全株有毒，烏頭堿是烏頭屬植物最主要的毒性成分，主要作用于心和神經(jīng)系統(tǒng)，引起多種心律失常而導(dǎo)致死亡[2]。其治療劑量與中毒或致死劑量較為接近，是具有藥用價(jià)值的有毒植物的典型代表[2]。0.2 mg烏頭堿口服即可中毒，3～5 mg口服即可致死，使用過(guò)程中因藥物耐受性的個(gè)體差異、用法不當(dāng)或誤服、故意投毒等原因，易引起中毒和死亡[3]。

法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中常遇到烏頭類(lèi)藥酒引起的中毒案例。LIU等[4]報(bào)道的7例烏頭堿中毒死亡的案件中，6例是飲用含烏頭類(lèi)藥材的藥酒引起的中毒。乙醇的主要毒性機(jī)制是抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)，但近年來(lái)，乙醇對(duì)心臟電生理和離子通道功能影響的研究也日漸增多。研究結(jié)果[5]表明，急性攝入乙醇可引起心律失常。烏頭堿與乙醇聯(lián)合攝入，兩者是否對(duì)心臟產(chǎn)生直接的毒性作用，以及毒性相互作用機(jī)制等問(wèn)題值得深入研究。

本文通過(guò)綜述近年來(lái)乙醇及烏頭堿心臟毒性機(jī)制的研究報(bào)道，分析討論其心臟分子毒性作用的共同機(jī)制，為進(jìn)一步探索乙醇-烏頭堿致心律失常分子毒理學(xué)機(jī)理的研究提供參考。

1 烏頭堿、乙醇分別致心律失常的毒理機(jī)制研究現(xiàn)狀

早期研究[3]發(fā)現(xiàn)，烏頭堿可興奮迷走神經(jīng)，引起竇房結(jié)抑制，使心肌內(nèi)異位節(jié)律點(diǎn)興奮性增強(qiáng)；還可激活下丘腦的腹內(nèi)側(cè)核導(dǎo)致心動(dòng)過(guò)緩[2]，產(chǎn)生各種心律失常；更重要的是使心肌細(xì)胞膜鈉離子（Na+）通道持續(xù)去極化[6]。近年來(lái)，烏頭堿對(duì)心肌細(xì)胞鈣離子（Ca2+）通道的影響逐漸被重視，且成為烏頭堿致心律失常分子機(jī)制的研究熱點(diǎn)。

適量與高劑量的乙醇均可誘發(fā)心律失常，最著名的與乙醇相關(guān)性的心律失常是“假日心臟綜合征”[7]。近年來(lái)，乙醇致心律失常的分子機(jī)制研究正逐漸增多。

1.1 細(xì)胞膜電壓門(mén)控型Na+通道

電壓門(mén)控型Na+通道位于心肌細(xì)胞膜上，負(fù)責(zé)動(dòng)作電位的產(chǎn)生。烏頭堿抑制Na+通道的失活，延長(zhǎng)通道的開(kāi)放時(shí)間造成膜的持續(xù)去極化[8-9]和鈉超載，鈉超載引起延遲后去極化（delayed after-depolarization，DAD），DAD可誘導(dǎo)產(chǎn)生異常性的節(jié)律紊亂和（或）觸發(fā)性惡性心律失常[10]。KLEIN等[7]采用細(xì)胞貼附膜片鉗技術(shù)發(fā)現(xiàn)乙醇對(duì)心肌Na+通道具有急性抑制作用并呈濃度依賴(lài)性，主要通過(guò)減少鈉通道的開(kāi)放率和可用性來(lái)降低細(xì)胞內(nèi)Na+濃度。這一結(jié)果與BEBAROVA等[11]報(bào)道的乙醇對(duì)Na+通道的影響相似。

1.2 心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+通道

1.2.1 心肌細(xì)胞內(nèi)鈣平衡調(diào)節(jié)及其在心律失常中的作用

Ca2+是引發(fā)心肌收縮的直接激活劑，是心肌細(xì)胞興奮收縮偶聯(lián)的介質(zhì)。細(xì)胞內(nèi)鈣平衡需特殊的鈣結(jié)合蛋白嚴(yán)格調(diào)控。胞外Ca2+主要通過(guò)L-型Ca2+通道（L-type calcium channel，LTCC）和 Na+-Ca2+交換器（Na+-Ca2+exchanger，NCX）進(jìn)入胞內(nèi)，內(nèi)向鈣電流再刺激肌質(zhì)網(wǎng)中Ca2+通過(guò)肌質(zhì)網(wǎng)蘭尼堿受體2（ryanodine receptor，RyR2）釋放到胞漿中，產(chǎn)生“鈣促鈣釋放”的級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)，內(nèi)流的Ca2+激活RyR2通道，產(chǎn)生肌質(zhì)網(wǎng)中Ca2+的同步釋放，這一過(guò)程被稱(chēng)為鈣火花。去極化過(guò)程中許多鈣火花的同步出現(xiàn)將導(dǎo)致整個(gè)細(xì)胞的鈣瞬變。這一過(guò)程將產(chǎn)生足量的Ca2+引起心肌的收縮。心肌舒張時(shí)RyR2通道關(guān)閉，肌質(zhì)網(wǎng)膜上的肌質(zhì)網(wǎng)Ca2+-ATP酶（sarcoplasmic reticulum calcium ATPase，SERCA2）在受磷蛋白（phospholamban，PLB）的調(diào)節(jié)下將Ca2+重吸收回肌質(zhì)網(wǎng)，同時(shí)胞膜上的NCX 將Ca2+排出胞外，使胞漿內(nèi)的Ca2+水平迅速回復(fù)[12]。心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度在鈣調(diào)控蛋白的作用下保持動(dòng)態(tài)平衡的過(guò)程[13]（圖1）。隨著研究深入，人們逐漸認(rèn)識(shí)到鈣平衡紊亂在心律失常病因中的重要性。心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+調(diào)控的紊亂，尤其是產(chǎn)生鈣瞬變的蛋白調(diào)控發(fā)生紊亂是心律失常的重要原因。

圖1 心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+循環(huán)示意圖[13]Fig.1 Schematic diagram of Ca2+circulation in cardiomyocytes

1.2.2 烏頭堿、乙醇對(duì)心肌細(xì)胞Ca2+平衡的影響

FU等[14]建立的用小干擾RNA（small interfering RNA，SiRNA）下調(diào)RyR2表達(dá)的心肌細(xì)胞模型中，正常的細(xì)胞顯示平穩(wěn)周期性的鈣振蕩，鈣離子電流基線(xiàn)保持低水平。烏頭堿染毒后出現(xiàn)心肌細(xì)胞鈣振蕩振幅降低，典型的鈣火花尖峰消失[14-16]，提示鈣信號(hào)的改變?cè)跒躅^堿致心律失常的病理過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。急性乙醇染毒后心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+瞬變下降且呈濃度依賴(lài)性[17]。

SUN等[18]發(fā)現(xiàn)，在大鼠心室肌細(xì)胞中，烏頭堿顯著加重Ca2+超載并引起心律失常，說(shuō)明Ca2+超載在心律失常的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。在心肌細(xì)胞內(nèi)LTCC的調(diào)節(jié)下，1μmol與6.6μmol烏頭堿染毒后[19-20]分別出現(xiàn)對(duì)LTCC的促進(jìn)作用與抑制作用。而不同濃度的烏頭堿染毒后均出現(xiàn)RyR2、NCX蛋白的表達(dá)上調(diào)，SERCA2a的表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而使胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度升高，導(dǎo)致心律失常[14，19，21]。

乙醇通過(guò)Ca2+滲漏發(fā)揮心肌毒性[5]。乙醇抑制LTCC的活性，通過(guò)加速LTCC的失活來(lái)實(shí)現(xiàn)[11]。不同濃度的乙醇表現(xiàn)出對(duì)鈣通道蛋白的不同作用，MUSTROPH等[5]發(fā)現(xiàn)1‰、3‰和6‰乙醇溶液均通過(guò)RyR2增加了心肌肌質(zhì)網(wǎng)的Ca2+滲漏，同時(shí)乙醇還增強(qiáng)了NCX及SERCA2的活性。但50 mmol乙醇卻抑制RyR2的活性，進(jìn)而明顯降低心肌細(xì)胞內(nèi)鈣火花頻率[22]。LI等[23]用4%乙醇溶液處理野生型FVB小鼠，發(fā)現(xiàn)SERCA2a、NCX和PLB表達(dá)量均下調(diào)。

1.3 心肌細(xì)胞其他通道蛋白

烏頭堿[24]與乙醇[11]對(duì)瞬時(shí)外向鉀離子（K+）電流（transient outward K+current，Ito）均表現(xiàn)出抑制作用。此外，烏頭堿亦抑制心肌細(xì)胞中的超快速延遲整流K+電流[8]（ultra-rapid delayed rectifier K+current，IKur），使復(fù)極時(shí)間延長(zhǎng)，增加后除極化的發(fā)生率，引起心律失常。乙醇表現(xiàn)為雙重抑制內(nèi)向整流鉀電流（inward rectifier K+current，IK1），在濃度≤2mmol/L時(shí)表現(xiàn)為抑制，濃度≥8 mmol/L時(shí)表現(xiàn)為激活作用[17]。ZHANG等[16，25]研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，烏頭堿對(duì)心肌細(xì)胞縫隙連接蛋白connexin 43（Cx43）的總量并不產(chǎn)生影響，而是通過(guò)影響其磷酸化狀態(tài)（誘發(fā)其脫磷酸化）發(fā)揮作用。HUNG等[26]發(fā)現(xiàn)，4%和6%乙醇溶液干預(yù)組的小鼠心肌細(xì)胞中Cx43表達(dá)均下調(diào)。

2 乙醇-烏頭堿致心律失常的毒理機(jī)制研究進(jìn)展

KURITA等[27]將0.6 mL 96%乙醇溶液直接注射到17只由1.0 μg烏頭堿誘導(dǎo)的室性心動(dòng)過(guò)速（ventricular tachycardia，VF）的實(shí)驗(yàn)狗心肌內(nèi)，15只恢復(fù)了正常竇性節(jié)律。在另外13只烏頭堿誘導(dǎo)的VF狗中，注射2.0 mL 96%乙醇溶液，7只恢復(fù)正常的竇性心律，其余6只狗死于VF。由此可見(jiàn)，隨著乙醇濃度的增高，與烏頭堿的拮抗作用變?nèi)?，但這種拮抗作用的具體機(jī)制如何，未進(jìn)行探索。GAO等[28]通過(guò)心電圖檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在烏頭堿誘導(dǎo)的心律失常模型中，低濃度乙醇（0.4 g/kg）與烏頭堿表現(xiàn)為拮抗作用，減少室性心律失常的發(fā)生，而中、高濃度乙醇（0.8g/kg和1.6g/kg）與烏頭堿則表現(xiàn)為協(xié)同作用，加重心律失常的發(fā)生。GAO等[28]認(rèn)為，0.4 g/kg乙醇與烏頭堿表現(xiàn)出拮抗作用，可能是由于心肌細(xì)胞中乙醇誘導(dǎo)的Na+電流減少所致，而高劑量乙醇的致心律失常作用可能涉及更復(fù)雜的機(jī)制。

李浩然[29]發(fā)現(xiàn)烏頭堿-乙醇共同干預(yù)的原代大鼠心室肌細(xì)胞鈣振蕩改變較烏頭堿單獨(dú)干預(yù)組更明顯，Ca2+振幅變小，典型的鈣火花消失。烏頭堿及乙醇可能通過(guò)協(xié)同作用影響鈣通道，使得心肌細(xì)胞內(nèi)鈣振蕩改變。前期研究結(jié)果[30]顯示，乙醇與烏頭堿聯(lián)合干預(yù)對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞RyR2蛋白表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)單純（1 μmol）烏頭堿干預(yù)與不同濃度乙醇與烏頭堿聯(lián)合干預(yù)均使RyR2蛋白含量升高，但與單一烏頭堿干預(yù)組比較，低、中濃度（5、50mmol/L）乙醇與烏頭堿表現(xiàn)為拮抗作用，但中等濃度的拮抗作用較弱；而高濃度（100 mmol/L）乙醇與烏頭堿聯(lián)合干預(yù)組與單獨(dú)烏頭堿干預(yù)組RyR2含量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。聯(lián)合干預(yù)時(shí)對(duì)心肌細(xì)胞的影響并非簡(jiǎn)單的協(xié)同或拮抗效應(yīng)，可能因乙醇濃度而異，在對(duì)心肌RyR2的影響上，低濃度乙醇對(duì)烏頭堿引起RyR2含量增加有拮抗作用，隨著乙醇濃度逐漸升高，這種拮抗作用逐漸減弱，且有向協(xié)同作用轉(zhuǎn)化的趨勢(shì)。這一聯(lián)合作用與YE等[22]報(bào)道的乙醇單獨(dú)影響RyR2的趨勢(shì)較相似。

綜上所述，目前乙醇和烏頭堿分別對(duì)鈉通道、部分鈣通道（LTCC、RyR2、NCX）影響的研究較多，而對(duì)PLB、SERCA及鉀通道的研究相對(duì)較少?，F(xiàn)有的研究多集中在對(duì)心肌細(xì)胞內(nèi)通道蛋白量的測(cè)定上，對(duì)其功能狀態(tài)及上游調(diào)控機(jī)制的研究較少（心肌細(xì)胞內(nèi)的通道蛋白含量不能完全作為整體結(jié)構(gòu)和功能改變的衡量標(biāo)準(zhǔn)，蛋白激酶依賴(lài)的磷酸化狀態(tài)是心肌細(xì)胞鈣調(diào)控蛋白活性調(diào)節(jié)的重要機(jī)制）。此外，乙醇-烏頭堿聯(lián)合作用對(duì)心臟毒理分子機(jī)制的研究逐漸增多，聯(lián)合染毒效應(yīng)因乙醇濃度不同而異。

烏頭堿與乙醇聯(lián)合作用對(duì)心肌的毒性效應(yīng)及具體機(jī)制方面的研究正逐漸增多，從電生理和分子水平揭示兩者對(duì)心肌細(xì)胞毒性作用的內(nèi)在相互關(guān)系有助于了解并闡述在法醫(yī)病理學(xué)實(shí)踐中遇到的烏頭類(lèi)酒精中毒死亡的機(jī)制，亦為酒-藥聯(lián)合中毒的防治及臨床制藥的解讀提供理論依據(jù)。筆者認(rèn)為，乙醇-烏頭堿聯(lián)合染毒時(shí)對(duì)心肌細(xì)胞的影響，并非單純協(xié)同或拮抗作用，可能因乙醇與烏頭堿的濃度不同而異，這一現(xiàn)象及其機(jī)制值得更深入地探索。在今后的研究中，可關(guān)注聯(lián)合染毒對(duì)鈣通道（如PLB、SERCA）以及鉀通道的影響，從通道蛋白功能狀態(tài)及其上游調(diào)節(jié)機(jī)制方面進(jìn)行更全面細(xì)致的研究。