青錢(qián)柳葉片中總黃酮的提取方法研究

董安強(qiáng) 張哲 黃玉敏

摘要 [目的]研究青錢(qián)柳葉片中總黃酮的提取方法。[方法]通過(guò)超聲波輔助水醇提取法提取總黃酮，以乙醇濃度、料液比、超聲波功率密度、提取時(shí)間為考察因素，以得到的總黃酮含量為指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)，研究青錢(qián)柳葉片中總黃酮的最佳提取條件。[結(jié)果]提取青錢(qián)柳葉子中總黃酮的最佳提取條件為乙醇濃度70%、料液比1∶80（g∶mL）、超聲波功率密度為50%、提取時(shí)間40 min，在此條件下總黃酮提取率為2.95%。[結(jié)論]該研究為工業(yè)生產(chǎn)提取總黃酮提供了參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞 青錢(qián)柳;葉片;總黃酮;超聲波輔助水醇提取;正交試驗(yàn)

中圖分類(lèi)號(hào) R284.2 ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A ?文章編號(hào) 0517-6611（2020）05-0179-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.05.050

開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Abstract [Objective]The research aimed to study the extraction method of total flavonoids from Cyclocarya paliurus leaves.[Method]The total flavonoids were extracted by ultrasonicassisted hydroalcoholic extraction method，taking ethanol concentration， materialliquid ratio， ultrasonic power density and extraction time as factors， and using the obtained total flavonoids as an index， an orthogonal test was performed on the basis of the single factor test to study the optimal extraction conditions of total flavonoids from Cyclocarya paliurus leaves.[Result]The optimal extraction conditions for total flavonoids from Cyclocarya paliurus leaves were： ethanol concentration of 70%， materialliquid ratio of 1∶80， ultrasonic power density of 50%， and extraction time of 40 minutes. Under these conditions， the total flavonoid extraction rate was 2.95%. [Conclusion]The research provides a reference for extracting total flavonoids for industrial production.

Key words Cyclocarya paliurus;Leaves;Total flavonoids;Ultrasoundassisted wateralcohol;Orthogonal test

青錢(qián)柳（Cyclocarya paliurus）屬于雙子葉植物綱胡桃科青錢(qián)柳屬，該屬下只有青錢(qián)柳一種，零散分布于中國(guó)南部山區(qū)，目前屬?lài)?guó)家重點(diǎn)保護(hù)的瀕危植物之一[1]。青錢(qián)柳葉中富含的水提物和醇提物（黃酮），能夠有效地調(diào)節(jié)人體糖代謝，激活胰島器官功能，可以起到降血糖的作用[2]。對(duì)于黃酮的提取方法主要有索氏提取法、有機(jī)溶劑提取法、微波提取法[3]、超臨界流體萃取法[4]、超聲波輔助提取法等。超聲波輔助提取法提取黃酮類(lèi)物質(zhì)，是目前比較新的方法。超聲波是一種具有波動(dòng)與能量雙重屬性的機(jī)械波，它是利用超聲波所具有的熱效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)、空化效應(yīng)，通過(guò)增大介質(zhì)的穿透力、增大介質(zhì)分子的運(yùn)動(dòng)速度來(lái)提取生物有效成分，可以加快提取進(jìn)程，促進(jìn)植物體中有效成分的溶解，提高藥物有效成分的提取率[5-7]。該試驗(yàn)采用超聲波輔助提取法對(duì)青錢(qián)柳葉片中總黃酮進(jìn)行提取，以期研究出最佳提取條件。

1 材料與方法

1.1 試材

青錢(qián)柳新鮮葉子;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（安徽酷爾生物工程有限公司）;無(wú)水三氯化鋁（天津市大茂化學(xué)試劑廠）;無(wú)水乙醇;所用試劑均為分析純。

1.2 儀器

SB-5200 DTD 超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）;UV-5100紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（METASH上海元析儀器有限公司）;粉碎機(jī)（COSUAI永康市天祺盛世工貿(mào)有限公司）。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確配制0.3 mg/mL 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液和1%的三氯化鋁乙醇溶液，用80%乙醇定容。精確吸取0.3 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL于1～6號(hào)10 mL容量瓶中，待用;在1～6號(hào)容量瓶分別加入1 mL 1%的三氯化鋁乙醇溶液，用80%乙醇定容，放置15 min。1號(hào)管為對(duì)照組。該試驗(yàn)中，樣品在415 nm波長(zhǎng)有最大吸收峰，因此選擇415 nm作為測(cè)定波長(zhǎng)。用1號(hào)溶液對(duì)分光光度計(jì)進(jìn)行調(diào)零，隨后分別對(duì)2～6號(hào)溶液進(jìn)行3次測(cè)定，記錄每次的吸光度，最后分別取平均值;以蘆丁濃度（X）對(duì)吸光度（Y）作圖，得出回歸方程為Y = 30.091X-0.030 8（R.2=0.998 9）。

1.4 試驗(yàn)方法 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用L9（3.4）正交設(shè)計(jì)，以青錢(qián)柳總黃酮的提取率為指標(biāo)，探討乙醇濃度、料液比、超聲波功率密度、提取時(shí)間4個(gè)因素對(duì)提取率的影響。

試驗(yàn)流程：新鮮青錢(qián)柳葉子→干燥→粉碎→稱(chēng)取樣品→按照料液比加入提取液（不同濃度的乙醇）→超聲波提取→過(guò)濾→定容→測(cè)定。

測(cè)定方法：往樣品中加入螯合劑（1%三氯化鋁乙醇溶液），放置15 min后，在415 nm波長(zhǎng)的分光光度計(jì)下測(cè)定各樣品吸光度，記錄吸光度，分別取平均值;由回歸方程求出稀釋液中總黃酮濃度，然后計(jì)算青錢(qián)柳總黃酮的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲波輔助水醇提取青錢(qián)柳葉總黃酮單因素試驗(yàn)

2.1.1 乙醇濃度對(duì)總黃酮提取率的影響。在超聲波清洗儀功率密度75%、提取時(shí)間30 min、料液比為1∶20時(shí)，考察不同乙醇濃度（40%、50%、60%、70%、80%）對(duì)青錢(qián)柳葉片總黃酮提取率的影響。從圖1可以看出，在試驗(yàn)條件下，當(dāng)其他提取條件固定時(shí)，乙醇的濃度越高，總黃酮的量就越多，在用60%～80%的乙醇濃度提取時(shí)，總黃酮提取率的變化趨勢(shì)比較平緩，說(shuō)明提取的用量已經(jīng)接近飽和狀態(tài)。結(jié)合經(jīng)濟(jì)效益，提取總黃酮的乙醇濃度以60%為最優(yōu)選擇。

2.1.2

料液比對(duì)總黃酮提取率的影響。在超聲波清洗儀功率密度75%、提取時(shí)間30 min、乙醇濃度60%時(shí)，考察不同料液比（1∶20、1∶40、1∶60、1∶80、1∶100）對(duì)青錢(qián)柳葉片總黃酮提取率的影響。從圖2可以看出，在試驗(yàn)條件下，當(dāng)其他提取條件固定時(shí)，隨著料液比的提高，總黃酮提取率先隨之升高，當(dāng)料液比為1∶60時(shí)，總黃酮提取率最大，之后有所下降。推斷原因是增加溶劑的劑量時(shí)，增大了溶質(zhì)推動(dòng)力，有利于黃酮類(lèi)物質(zhì)的溶出，青錢(qián)柳總黃酮提取率明顯提高，當(dāng)溶劑量繼續(xù)增多時(shí)，雜質(zhì)成分溶出增多，影響了黃酮類(lèi)物質(zhì)的浸出，故隨后的總黃酮提取率有所下降。提取液量過(guò)少不利于后期過(guò)濾工作，黃酮損失率也較大[8]。因此選擇料液比1∶60為最佳。

2.1.3 超聲波清洗儀功率密度對(duì)總黃酮提取率的影響。在料液比1∶40、提取時(shí)間30 min、乙醇濃度60%時(shí)，考察不同超聲波清洗儀功率密度（50%、60%、70%、80%、90%）對(duì)青錢(qián)柳葉片總黃酮提取率的影響。從圖3可以看出，在試驗(yàn)條件下，當(dāng)其他提取條件固定時(shí)，超聲波清洗儀功率密度為60%和70%時(shí)，總黃酮提取率達(dá)到最大值。分析其原因是一開(kāi)始隨著功率密度的增加，對(duì)細(xì)胞壁的破壞作用逐漸增強(qiáng)，這促進(jìn)了總黃酮的溶出，使其提取率逐漸增加，但當(dāng)功率密度大于70%時(shí)，引起局部高溫，會(huì)破壞總黃酮的結(jié)構(gòu)，使其提取率下降。因此超聲波清洗儀功率密度選擇60%為宜。

2.1.4?提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響。在料液比1∶40、超聲波清洗儀功率密度為75%、乙醇濃度60%時(shí)，考察不同提取時(shí)間（10、20、30、40、50 min）對(duì)青錢(qián)柳葉片總黃酮提取率的影響。從圖4可以看出，當(dāng)其他提取條件固定時(shí)，提取時(shí)間為40 min時(shí)，總黃酮提取率最大，之后有所下降。分析其原因在于提取的前期，細(xì)胞內(nèi)總黃酮快速擴(kuò)散到溶劑中，使得其提取率顯著增加。大于40 min后，由于長(zhǎng)時(shí)間的超聲波機(jī)械效應(yīng)和熱能效應(yīng)對(duì)總黃酮結(jié)構(gòu)產(chǎn)生破壞，同時(shí)又造成細(xì)胞內(nèi)其他雜質(zhì)擴(kuò)散進(jìn)入溶劑中，使得總黃酮提取率下降。因此提取時(shí)間選擇40 min為宜[9]。

2.2 正交試驗(yàn)對(duì)提取方法參數(shù)的優(yōu)化

單因素試驗(yàn)是在各個(gè)因素相互不影響的情況下所得到的結(jié)論，但實(shí)際提取的過(guò)程中所存在的變量都是相互影響的，利用單因素試驗(yàn)結(jié)果選取正交試驗(yàn)的最優(yōu)范圍，方便試驗(yàn)數(shù)據(jù)的整理，故在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用L9（3.4）正交設(shè)計(jì)，進(jìn)行正交試驗(yàn)，設(shè)計(jì)參數(shù)為乙醇濃度、料液比、超聲波清洗儀功率密度、提取時(shí)間4個(gè)參數(shù)（表1）;設(shè)計(jì)梯度參照單因素試驗(yàn)的代表梯度，以青錢(qián)柳葉總黃酮提取率為指標(biāo)進(jìn)行提取方法參數(shù)的優(yōu)化。

從表2可以看出，超聲波輔助提取青錢(qián)柳葉總黃酮過(guò)程中的各個(gè)變量因素影響程度不同，各因素的影響程度從大到小依次為料液比、提取時(shí)間、乙醇濃度、超聲波清洗儀功率密度。正交試驗(yàn)所得最佳條件為A3B3C2D1，即料液比1∶80，乙醇濃度為70%，提取時(shí)間為40 min，超聲波功率密度為50%，在此提取條件下，總黃酮的提取率為2.95%。

3 結(jié)論與討論

關(guān)于青錢(qián)柳葉子中總黃酮的提取方法報(bào)道較少，該試驗(yàn)對(duì)總黃酮的提取方法進(jìn)行研究，對(duì)比傳統(tǒng)的酶解法提取[10]，超聲波輔助水醇提取法所運(yùn)用的化學(xué)物質(zhì)少;對(duì)比超臨界流體萃取法，其操作簡(jiǎn)單;對(duì)比索氏提取法，超聲波輔助水醇提取法所運(yùn)用的時(shí)間更短。超聲波輔助水醇提取法適用于食品工業(yè)生產(chǎn)，安全且成本較低，操作容易。

單因素試驗(yàn)表明，各個(gè)因素在相互不影響的情況下提取青錢(qián)柳葉片中總黃酮的最佳條件為乙醇濃度60%、料液比1∶60、超聲波功率密度為60%、提取時(shí)間為40 min。但實(shí)際提取的過(guò)程中所存在的變量都是相互影響的，故利用單因素試驗(yàn)結(jié)果選取正交試驗(yàn)的最優(yōu)范圍進(jìn)一步進(jìn)行了正交試驗(yàn)。正交試驗(yàn)結(jié)果表明，料液比的影響最大，其次是提取時(shí)間、乙醇濃度，超聲波清洗儀功率密度的影響最小。超聲波功率太強(qiáng)或者提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)均會(huì)影響總黃酮的穩(wěn)定性，導(dǎo)致提取率降低。提取青錢(qián)柳葉片中總黃酮的最佳條件為乙醇濃度70%，料液比1∶80，超聲波功率密度為50%，提取時(shí)間為40 min，在最佳提取條件下，總黃酮的最終提取率為2.95%。

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