工業(yè)大麻葉對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌機(jī)制

張正海，董 艷，田 媛，姬妍茹，楊慶麗，石 杰

（黑龍江省科學(xué)院 大慶分院，黑龍江 大慶163319）

近年來(lái)，食品安全問(wèn)題日益受到關(guān)注，已成為一個(gè)重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題[1]。金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S.aureus），是一類(lèi)球形、直徑約0.8μm、顯微鏡下呈葡萄串狀排列的革蘭氏陽(yáng)性食源性病原體[2]。S.aureus易引起乳制品、肉類(lèi)、蛋類(lèi)、冰淇淋等食品腐敗污染，導(dǎo)致人類(lèi)食物中毒[3]。在許多國(guó)家,病原菌食物中毒事件中，S.aureus列居第二或第三位[4]。其引起食物中毒的主要特征是：發(fā)病迅速，通常伴有惡心、嘔吐、腹痛和腹瀉等癥狀，嚴(yán)重時(shí)會(huì)引發(fā)敗血癥、腦膜炎和中毒性毒素休克綜合征等疾病，對(duì)于嬰幼兒、老年人、術(shù)后患者或其他體質(zhì)較虛弱的人來(lái)說(shuō)，S.aureus感染具有更大的威脅[5]。當(dāng)前，防止食品污染、延長(zhǎng)保質(zhì)期最簡(jiǎn)單有效的方法是使用天然或化學(xué)防腐劑[6]。鹽、糖、醋和酒精是傳統(tǒng)的防腐劑，但一些細(xì)菌和霉菌可以耐受這些傳統(tǒng)的防腐劑。相比之下，人工合成的化學(xué)防腐劑，如苯甲酸/苯甲酸鈉、山梨酸/山梨酸鉀、硝酸鹽等，可有效抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，然而長(zhǎng)期攝入這些化學(xué)防腐劑可能造成毒性累積，引起過(guò)敏、頭痛等癥狀，還可能產(chǎn)生細(xì)菌耐藥性[7-8]。此外，一些化學(xué)防腐劑對(duì)食品感官品質(zhì)也有一定影響。如今，植物源天然產(chǎn)物憑借不同抑菌機(jī)制發(fā)揮獨(dú)特抑菌性能，其潛在功效和較少的副作用受到廣泛關(guān)注[9]。

工業(yè)大麻（Hemp，Cannabis sativaL.）俗稱(chēng)火麻、漢麻，為大麻科、大麻屬的一年生草本植物，是經(jīng)遺傳改良和人工選育的無(wú)毒新品種，其四氫大麻酚（Δ9-THC）的質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于0.3%[10]。多項(xiàng)研究表明，大麻對(duì)人體健康有益，可預(yù)防便秘、降低膽固醇、調(diào)節(jié)免疫、抗衰老、改善記憶等[11-12]。我國(guó)大麻資源豐富，在云南、廣西、黑龍江、吉林等地都有野生或人工栽培的大麻分布。近年來(lái)，醫(yī)用大麻二酚在癌癥治療方面的作用日益被重視，全球工業(yè)大麻種植、生產(chǎn)也不斷合法化，工業(yè)大麻產(chǎn)業(yè)鏈已從農(nóng)業(yè)、紡織業(yè)延伸到新材料、食品、生物醫(yī)藥等多個(gè)行業(yè)，工業(yè)大麻的種植面積逐漸增大。隨之產(chǎn)生了較多工業(yè)大麻葉副產(chǎn)物，但其利用程度有限。

多項(xiàng)研究證實(shí)工業(yè)大麻葉能有效抑制S.aureus生長(zhǎng)。雋惠玲等[13]研究發(fā)現(xiàn)，工業(yè)大麻葉對(duì)S.aureus的最低抑菌濃度（MIC）為7.53 mg/mL；郭孟璧等[14]證實(shí)工業(yè)大麻雌株花葉多糖對(duì)S.aureus的MIC為3.125 mg/mL；張旭等[15]采用超臨界CO2萃取工業(yè)大麻中的大麻二酚（CBD）、六氫大麻酚（CBN）和四氫大麻酚（Δ9-THC），這3種大麻酚的混合物對(duì)S.aureus的MIC為6 mg/mL；Giovanni等[16]研究了工業(yè)大麻葉中5種大麻素對(duì)多種耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）抑菌活性的影響，發(fā)現(xiàn)大麻素的異戊二烯基主要參與脂類(lèi)親和作用的調(diào)節(jié)，對(duì)抑菌作用影響較小，酚羥基的甲基化、乙?；⑶按舐樗佤然孽セ约暗诙€(gè)萜的引入都不利于抑菌活性，但其機(jī)制尚不明確。本課題組前期研究表明，來(lái)自大慶地區(qū)的工業(yè)大麻葉乙酸乙酯萃取物對(duì)S.aureus的MIC為7.81 mg/mL，且經(jīng)紫外輻射、添加蔗糖和不同溫度處理仍表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性[17]。目前，工業(yè)大麻葉對(duì)S.aureus抑菌的研究大多圍繞抑菌效果開(kāi)展，而關(guān)于抑菌組成和抑菌機(jī)制的研究鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)在前期研究基礎(chǔ)上，對(duì)工業(yè)大麻葉萃取物進(jìn)行硅膠柱分離，評(píng)價(jià)了按不同比例的石油醚與乙酸乙酯洗脫后，萃取物各餾分對(duì)S.aureus的抑菌活性，利用GC-MS確定高活性餾分的化合物組成，進(jìn)一步分析工業(yè)大麻葉對(duì)S.aureus的作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

工業(yè)大麻葉：經(jīng)鑒定為火麻1號(hào)品種，于2019年7月中旬采自黑龍江省科學(xué)院大慶分院東風(fēng)農(nóng)場(chǎng)試驗(yàn)田；金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株[ATCC 25923]：上海魯微科技有限公司產(chǎn)品；硅膠粉：青島海洋生物有限公司產(chǎn)品；氨芐青霉素鈉：德國(guó)Ruibio公司產(chǎn)品；AKP試劑盒、可溶性蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒、ATP含量試劑盒：南京建成生物工程研究所有限公司產(chǎn)品；SOD試劑盒：上海碧云天生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；戊二醛固定液：福州phygene生物科技公司產(chǎn)品；無(wú)水乙醇、石油醚、乙酸乙酯、叔丁醇（AR）：均為遼寧泉瑞試劑有限公司產(chǎn)品。

7890B-7000c氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀：安捷倫公司產(chǎn)品；Epoch多功能酶標(biāo)儀：美國(guó)BioTek公司產(chǎn)品；UV-759紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海高致精密儀器有限公司產(chǎn)品；JSM7200F掃描電子顯微鏡：日本電子公司產(chǎn)品；DDS307電導(dǎo)率儀：上海紅益儀器儀表有限公司產(chǎn)品；VFD-4500型冷凍干燥機(jī)：北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司產(chǎn)品；RE-201D型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上?；ゼ褍x器設(shè)備有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 工業(yè)大麻葉提取物制備 根據(jù)張正海等[17]的方法，取1.5 kg陰干工業(yè)大麻葉，粉碎并過(guò)60目篩，以料液質(zhì)量體積比為1 g∶15 mL的比例加入體積分?jǐn)?shù)為88%的乙醇，超聲輔助提取20 min，真空抽濾，重復(fù)3次，合并濾液，于40℃旋蒸至膏狀（182 g）。乙酸乙酯萃取，減壓濃縮后得浸膏57 g，用85.5 g硅膠（100～200目）拌樣后干法上樣，經(jīng)200～300目硅膠柱分離，石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫（體積比分別為1∶0，50∶1，20∶1，5∶1，1∶1，0∶1），根據(jù)薄層色譜（TLC）合并相似餾分，共得到Fr1—Fr6共6個(gè)餾分，旋蒸后調(diào)整質(zhì)量濃度至10 mg/mL，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾除菌后，4℃保存，用于抑菌試驗(yàn)。

1.2.2 菌懸液制備 在無(wú)菌的條件下，將活化好的S.aureus單菌落接種于已滅菌的MH培養(yǎng)基，于37℃恒溫培養(yǎng)16 h，室溫4 000 r/min離心后收集菌體，用無(wú)菌生理鹽水稀釋菌懸液至單位體積的菌落數(shù)為106～107CFU/mL，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.3 最低抑制濃度（MIC）測(cè)定 參考Tang等[18]和Zhou等[19]的方法并適當(dāng)修改，采用微量2倍稀釋法，向96孔板中加入90μL/孔菌懸液和10μL/孔的工業(yè)大麻葉提取物，使其質(zhì)量濃度分別為1 000、500、250、125、62.5、31.25、16、8μg/mL，并設(shè)空白對(duì)照（不含細(xì)菌）和陽(yáng)性對(duì)照（含等質(zhì)量濃度的氨芐青霉素鈉），37℃恒溫培養(yǎng)24 h，肉眼直接觀察，不出現(xiàn)渾濁的最小質(zhì)量濃度即為MIC。

1.2.4 GC-MS化學(xué)成分分析 利用Fr1—Fr6篩選S.aureus的活性后，取活性最佳的餾分并分析其組成。用甲醇稀釋Fr5至質(zhì)量濃度為1 mg/mL，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過(guò)濾后進(jìn)行GC-MS。GC：HP-5MS（30 m×250μm，0.25μm），He氣流量為：1.1 mL/min；升溫程序?yàn)椋?00℃保持1 min，以10℃/min速率升溫到280℃保持12 min；MS：四級(jí)桿溫度：150℃，離子源（EI）：70 eV，240℃，質(zhì)量掃描范圍：m/z 50.0～500.0。

1.2.5 生長(zhǎng)曲線(xiàn)繪制 參考Liu等[20]的方法，按體積分?jǐn)?shù)1%的接種量將S.aureus分別接種于含0 MIC、0.5 MIC、1 MIC的工業(yè)大麻葉提取物的培養(yǎng)基中，37℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，酶標(biāo)儀每隔2 h測(cè)定OD600nm，繪制OD600nm-時(shí)間生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

1.2.6 菌懸液中AKP活力[21]、可溶性蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度[22]、核酸相對(duì)濃度[23]和電導(dǎo)率的測(cè)定[24]分別向含有0 MIC、0.5 MIC、1 MIC的工業(yè)大麻葉提取物的培養(yǎng)基中加入菌懸液，使得菌懸液?jiǎn)挝惑w積菌落數(shù)為106CFU/mL，于37℃，振蕩培養(yǎng)，每隔2 h取5 mL菌液，4℃、4 000 r/min離心取上清液，按照各自試劑盒說(shuō)明書(shū)的方法測(cè)定AKP活力和可溶性蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度、紫外分光光度計(jì)測(cè)定260 nm波長(zhǎng)下吸光值、去離子水稀釋20倍后電導(dǎo)率儀測(cè)定各時(shí)間點(diǎn)電導(dǎo)率。

1.2.7 胞內(nèi)ATP濃度[25]、SOD活性[26]測(cè)定 分別于0、2、4、6、8、10 h取1 mL菌液，4℃、4 000 r/min離心后，棄上清液，按各自試劑盒說(shuō)明書(shū)方法測(cè)定菌體ATP濃度和SOD活性。

1.2.8 掃描電子顯微鏡（SEM）觀察及樣品制備 按Zhou等[27]的方法并稍加改動(dòng)，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期S.aureus菌懸液?jiǎn)挝惑w積的菌落數(shù)調(diào)整為107CFU/mL，加入工業(yè)大麻葉提取液使質(zhì)量濃度分別為0 MIC、1 MIC，于37℃，120 r/min振蕩培養(yǎng)10 h。取800μL菌體于室溫下、4 000 r/min離心后棄上清液，用0.1 mol/mL、pH 7.2的磷酸鹽緩沖液洗滌3次，離心收集菌體后用體積分?jǐn)?shù)為2.5%的戊二醛溶液固定過(guò)夜。依次用體積分?jǐn)?shù)為30.0%、50.0%、70.0%、80.0%、90.0%、100.0%的乙醇梯度脫水，叔丁醇置換。取細(xì)菌-叔丁醇懸浮液10μL滴于10 mm×10 mm硅片上，用真空冷凍干燥機(jī)干燥，噴金后SEM觀察。

1.2.9 數(shù)據(jù)處理 試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果采用DPS 7.05軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行Duncan多重比較分析，GraphPad Prism 7軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 工業(yè)大麻葉不同餾分對(duì)S.aureus的抑菌活性

表1顯示了不同餾分對(duì)S.aureus的最低抑制濃度（質(zhì)量濃度）。在供試范圍內(nèi)Fr1—Fr4對(duì)S.aureus無(wú)抑菌作用，說(shuō)明Fr1—Fr4餾分內(nèi)可能不含或含有很少量的活性化合物。Fr5和Fr6對(duì)S.aureus的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，最低抑菌濃度（質(zhì)量濃度）分別為31.25μg/mL和500μg/mL，其中Fr5的抑菌效果與氨芐青霉素鈉的31.25μg/mL相當(dāng)，此結(jié)果與Chakraborty等[28]的研究結(jié)果接近，較柱分離前最低抑菌濃度（質(zhì)量濃度7.53 mg/mL）顯著提高，說(shuō)明抑菌活性成分大部分富集于Fr5餾分，以此為依據(jù)，選擇Fr5分析其化學(xué)組成并探討其抑菌機(jī)理。

2.2 工業(yè)大麻葉Fr5餾分的GC-MS結(jié)果

由表2可知，工業(yè)大麻葉Fr5餾分，經(jīng)GC-MS分析，共鑒定出24種化合物，其中包括酯類(lèi)14個(gè)，醇類(lèi)3個(gè)，酚類(lèi)3個(gè)，烯烴類(lèi)2個(gè)。主要成分為亞麻酸甲酯（相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)40.79%）、棕櫚酸甲酯（相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)13.12%）、9-順，11-反-癸二烯酸甲酯（相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)4.55%）。說(shuō)明工業(yè)大麻葉Fr5餾分的抗菌活性可能與酯類(lèi)、醇類(lèi)、酚類(lèi)及其他微量化合物有關(guān)，不同成分也可能產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)。

表1 工業(yè)大麻葉不同餾分對(duì)S.aureus的抑菌活性Table 1 Antibacterial activity of each fraction from industrial hemp leaves against S.aureus

表2 工業(yè)大麻葉Fr5餾分GC-MS結(jié)果Table 2 GC-MSidentification of Fr5 fractions from industrial hemp leaves

2.3 工業(yè)大麻葉提取物的抑菌機(jī)理

2.3.1 工業(yè)大麻葉Fr5餾分對(duì)S.aureus生長(zhǎng)曲線(xiàn)的影響 OD600nm的大小可間接反應(yīng)細(xì)菌的生長(zhǎng)情況，圖1為添加了0 MIC、0.5 MIC、1 MIC 3種質(zhì)量濃度的Fr5后S.aureus的生長(zhǎng)曲線(xiàn)。對(duì)照組在培養(yǎng)后快速繁殖，2 h進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，14 h進(jìn)入穩(wěn)定期，OD600nm為1.156±0.029。在0.5 MIC處理組，菌液OD600nm增長(zhǎng)緩慢，對(duì)數(shù)增長(zhǎng)階段被推遲至6 h，并于12 h進(jìn)入穩(wěn)定階段，OD600nm為0.427±0.023，說(shuō)明抑菌作用延緩對(duì)數(shù)生長(zhǎng)進(jìn)程，減少微生物數(shù)量。而當(dāng)菌液中Fr5質(zhì)量濃度為1 MIC時(shí)，曲線(xiàn)平緩，細(xì)菌生長(zhǎng)被嚴(yán)重抑制，不能進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。因此，工業(yè)大麻葉Fr5餾分對(duì)S.aureus正常生長(zhǎng)有抑制作用，且隨著藥物質(zhì)量濃度增加，對(duì)生長(zhǎng)曲線(xiàn)影響增大。

圖1 工業(yè)大麻葉Fr5餾分對(duì)S.aureus生長(zhǎng)曲線(xiàn)的影響Fig.1 Effect of Fr5 from industrial hemp leaves extract on growth curve of S.aureus

2.3.2 工業(yè)大麻葉Fr5餾分對(duì)菌體細(xì)胞壁的影響正常情況下AKP存在于細(xì)菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜之間，當(dāng)菌體細(xì)胞壁被破壞，AKP大量外泄，使培養(yǎng)液中AKP活力升高，因此可通過(guò)檢測(cè)胞外AKP活力的變化間接反映菌體細(xì)胞壁完整性[29]。細(xì)菌細(xì)胞壁的主要功能是：維持細(xì)菌固有形態(tài)，保護(hù)細(xì)菌免受低滲環(huán)境侵襲，起到屏障作用。一旦細(xì)胞壁功能被破壞，細(xì)菌會(huì)很快死亡。如圖2所示，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，對(duì)照組AKP活力始終處于相對(duì)較低水平，但經(jīng)過(guò)1 MIC處理后的菌液，在2 h內(nèi)AKP活力迅速上升至較高水平（0.548±0.039 U/L），之后趨于平穩(wěn)狀態(tài)，而0.5 MIC處理的AKP活力在8 h達(dá)到最大值（0.335±0.020 U/L）遠(yuǎn)低于1 MIC處理。這表明工業(yè)大麻葉Fr5餾分短時(shí)間內(nèi)能有效破壞S.aureus細(xì)胞壁的完整性，其中1 MIC的Fr5對(duì)菌體細(xì)胞壁完整性的破壞程度較0.5 MIC更明顯。

2.3.3 工業(yè)大麻葉Fr5餾分對(duì)細(xì)胞膜通透性的影響細(xì)胞膜是菌體的保護(hù)屏障，其選擇性透過(guò)K+、Na+、H+等，可維持適合細(xì)菌生存的穩(wěn)定內(nèi)環(huán)境、胞膜功能、酶活性和菌體正常代謝[30]。當(dāng)細(xì)胞膜遭到破壞，通透性增加，內(nèi)部的電解質(zhì)會(huì)外泄至細(xì)胞外，進(jìn)而使培養(yǎng)液電導(dǎo)率提高，因此菌液電導(dǎo)率的變化反映了細(xì)胞膜通透性的變化[25]。如圖3所示，第0小時(shí)，添加抑菌物質(zhì)的菌液電導(dǎo)率有一定程度的下降，可能是藥物與外泄的離子發(fā)生了靜電結(jié)合，從而導(dǎo)致離子濃度降低，電導(dǎo)率下降。隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，對(duì)照組電導(dǎo)率呈現(xiàn)穩(wěn)定上升的趨勢(shì)，但變化幅度較小，這可能是菌液中菌體濃度增加和正常的裂解所致[31]。當(dāng)加入工業(yè)大麻葉Fr5后，在短時(shí)間內(nèi)菌液電導(dǎo)率明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），尤其是1 MIC工業(yè)大麻葉提取物作用后2 h，培養(yǎng)液電導(dǎo)率提高12%。這說(shuō)明工業(yè)大麻葉Fr5可對(duì)S.aureus細(xì)胞膜造成損傷，且損傷程度與Fr5的濃度呈正相關(guān)關(guān)系。

圖2 工業(yè)大麻葉Fr5餾分對(duì)S.aureus細(xì)胞壁的影響Fig.2 Fr5 from industrial hemp leaves on wall of S.aureus

圖3 工業(yè)大麻葉Fr5餾分對(duì)培養(yǎng)液電導(dǎo)率的影響Fig.3 Effect of Fr5 from industrial hemp leaves extract on electric conductivity of culture medium

蛋白質(zhì)和核酸是影響細(xì)胞結(jié)構(gòu)和遺傳信息的重要大分子，菌體細(xì)胞正常生長(zhǎng)情況下，蛋白質(zhì)、核酸等大分子物質(zhì)貫穿于整個(gè)胞膜和胞質(zhì)當(dāng)中，核酸、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)的外溢表明胞膜完整性遭到了破壞[32]。菌懸液在260 nm處的吸光度常用來(lái)判斷核酸的相對(duì)濃度[33]。如圖4所示，0 h時(shí)，各組間核酸的吸光度和可溶性蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度均無(wú)明顯區(qū)別。隨時(shí)間增加，對(duì)照組核酸的吸光度和可溶性蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度處于較低范圍且變化均較為平緩，而經(jīng)0.5 MIC和1 MIC的Fr5處理后，培養(yǎng)液中核酸的吸光度和可溶性蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度在2 h迅速升高，與0 h相比：核酸的吸光度分別增加了0.183、0.407，可溶性蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度分別增加了0.129 g/L、0.187 g/L。0 h后，兩個(gè)處理組的核酸吸光度和可溶性蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度均始終高于對(duì)照組（P＜0.05）。對(duì)照組蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度有少量增加是因?yàn)椋弘S菌落數(shù)大幅增加，出現(xiàn)部分自然死亡細(xì)胞，釋放一定量蛋白質(zhì)。加入抑菌物質(zhì)后，S.aureus細(xì)胞膜遭破壞，DNA、RNA等大分子隨小分子相繼流出細(xì)胞，從而增加菌懸液核酸和蛋白質(zhì)的濃度。這說(shuō)明工業(yè)大麻葉提取物可導(dǎo)致菌體的膜功能障礙，細(xì)胞內(nèi)容物泄露，無(wú)法維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，從而達(dá)到抑菌作用。

圖4 工業(yè)大麻葉Fr5餾分對(duì)S.aureus核酸吸光度和可溶性蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的影響Fig.4 Effect of Fr5 from industrial hemp leaves extract on the nucleic acid absorbance and the soluble protein content of S.aureus

2.3.4 工業(yè)大麻葉Fr5餾分對(duì)菌體能量代謝的影響ATP在細(xì)胞物質(zhì)運(yùn)輸、能量轉(zhuǎn)換中發(fā)揮重要作用，其濃度的變化直接關(guān)系到細(xì)胞的能量代謝。圖5反映了經(jīng)過(guò)不同濃度的Fr5處理后，S.aureus胞內(nèi)ATP濃度的變化：對(duì)照組樣品細(xì)胞內(nèi)ATP濃度隨時(shí)間增加呈上升趨勢(shì)，而經(jīng)0.5 MIC和1 MIC Fr5處理后，細(xì)胞內(nèi)ATP濃度在2 h顯著升高（P＜0.05），隨后降低，在10 h降低至26.175±3.336μmol/L和16.154±2.672μmol/L，較0 h分別降低了51.96%和70.35%?？赡苁且志镔|(zhì)刺激了菌體，細(xì)胞為了維持正常生理功能出現(xiàn)應(yīng)激，ATP濃度在2 h內(nèi)迅速上升。在4～10 h，因電解質(zhì)損失，細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)子動(dòng)力降低，影響還原氫利用，ATP合成受抑制。另外，細(xì)胞內(nèi)ATP濃度降低也可能因?yàn)椋杭?xì)胞過(guò)度凋亡造成ATP合成速率降低和ATP的水解速率增加[34]。其他抗菌藥物，如檸檬烯等也有類(lèi)似現(xiàn)象[24]。因此，工業(yè)大麻葉提取物會(huì)影響S.aureus的ATP合成或消耗，結(jié)合膜通透性變化，造成胞內(nèi)ATP濃度下降，從而抑制菌體代謝。

圖5 工業(yè)大麻葉Fr5餾分對(duì)S.aureus ATP濃度的影響Fig.5 Effect of Fr5 from industrial hemp leaves extract on the ATP content of S.aureus

2.3.5 工業(yè)大麻葉Fr5餾分對(duì)菌體氧化損傷的影響菌體自由基能攻擊生物膜并引起細(xì)胞損傷，形成丙二醛等過(guò)氧化物。SOD是細(xì)胞中重要的保護(hù)酶，SOD特異性催化超氧陰離子，將其轉(zhuǎn)化為過(guò)氧化氫，CAT進(jìn)一步催化過(guò)氧化氫分解為水，它們協(xié)調(diào)工作，維持細(xì)胞內(nèi)活性氧的代謝平衡。由圖6可知，對(duì)照組SOD活力相對(duì)穩(wěn)定且維持在較低水平，說(shuō)明細(xì)胞膜未受到損傷。不同濃度工業(yè)大麻葉Fr5處理后的S.aureus胞內(nèi)SOD活力均呈先升高后降低的趨勢(shì)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)0 MIC、0.5 MIC、1 MIC細(xì)胞內(nèi)SOD活力分別為0.203±0.014、0.180±0.023、0.132±0.011 U，推測(cè)菌體在提取物的逆境脅迫下，前期SOD增加，清除有害物質(zhì)從而保護(hù)菌體免受毒害，但后期由于氧自由基的累積、膜脂過(guò)氧化的加重和蛋白質(zhì)變性導(dǎo)致保護(hù)酶水平的降低，使菌體自身防御能力下降。故推測(cè)：Fr5以劑量依賴(lài)的方式造成S.aureus的氧化損傷。

圖6 工業(yè)大麻葉Fr5餾分對(duì)S.aureus SOD活性的影響Fig.6 Effect of Fr5 from hemp leaves extract on the SOD activity of S.aureus

2.3.6 工業(yè)大麻葉Fr5餾分對(duì)細(xì)胞顯微特征的影響用0 MIC和1 MIC濃度的Fr5分別處理細(xì)菌，掃描電鏡觀察S.aureus的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征變化。結(jié)果如圖7所示，對(duì)照組大部分S.aureus細(xì)胞呈球形，表面規(guī)則、光滑、外觀飽滿(mǎn)且結(jié)構(gòu)完整；然而，經(jīng)工業(yè)大麻葉1 MIC提取物處理10 h后，菌體表面出現(xiàn)皺縮，可見(jiàn)明顯破潰的菌體。這與細(xì)胞壁完整性、細(xì)胞膜通透性研究結(jié)果一致。細(xì)菌被抑制的原因可能是細(xì)胞膜被破壞，即使是膜結(jié)構(gòu)微小的變化也能極大影響細(xì)胞代謝并導(dǎo)致細(xì)胞死亡，其他研究也有類(lèi)似結(jié)論[31，35]。以上結(jié)果再次證明：工業(yè)大麻葉Fr5餾分可以使S.aureus膜結(jié)構(gòu)造成破壞。

圖7 工業(yè)大麻葉提取物處理后S.aureus的掃描電鏡圖（50μm）Fig.7 SEM images of S.aureus with or without Fr5 from hemp leaves extract treatment

3 結(jié) 語(yǔ)

為了應(yīng)對(duì)過(guò)度使用化學(xué)防腐劑造成的健康風(fēng)險(xiǎn)和細(xì)菌耐藥性問(wèn)題，本研究探索了工業(yè)大麻葉對(duì)S.aureus的抑菌組成并對(duì)其機(jī)理進(jìn)行探索，證實(shí)了工業(yè)大麻葉Fr5餾分（V石油醚∶V乙酸乙酯=1∶1）可有效抑制S.aureus的生長(zhǎng)，MIC值為31.25μg/mL。經(jīng)GCMS分析，共鑒定出24種化合物。由胞外AKP活力的升高、電導(dǎo)率的增加和細(xì)胞內(nèi)生物大分子（核酸和蛋白質(zhì)）的滲漏以及掃描電鏡下菌體的微觀機(jī)構(gòu)變化，推測(cè)：工業(yè)大麻葉可能與陽(yáng)性對(duì)照氨芐青霉素鈉有相似的抑菌機(jī)制，均能破壞細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜完整性。在食品加工過(guò)程中，控制微生物生長(zhǎng)的主要目標(biāo)是對(duì)細(xì)菌細(xì)胞膜的滅活處理[35]。細(xì)菌細(xì)胞膜可保護(hù)細(xì)胞免受周?chē)h(huán)境傷害，并負(fù)責(zé)運(yùn)輸細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝所必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。當(dāng)細(xì)胞膜受損時(shí)，細(xì)菌的生長(zhǎng)和代謝就會(huì)被破壞[36]。工業(yè)大麻葉Fr5作用于S.aureus后，可能是其中的化合物通過(guò)脂質(zhì)雙分子層疏水羥基的積累，作用于細(xì)胞膜或?qū)е录?xì)胞外膜脂多糖釋放，從而造成膜通透性和膜電位變化[37]。維持正常膜電位是產(chǎn)生ATP維持細(xì)胞功能的前提[20]。由于細(xì)胞膜的通透性增加，細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖所需的能量和關(guān)鍵物質(zhì)無(wú)法及時(shí)合成，影響菌體的能量代謝并造成氧化損傷，最終導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制。這些結(jié)果為工業(yè)大麻葉在食品保鮮方面的綜合利用和新型天然防腐劑的開(kāi)發(fā)提供了理論基礎(chǔ)，但抑菌物質(zhì)仍需進(jìn)一步分離、鑒定，并需要在分子水平上深入研究作用機(jī)制，尋找其具體靶點(diǎn)。