黏蛋白MUC5B啟動子rs35705950多態(tài)性與特發(fā)性肺纖維化易感性的研究*

茍安栓，吳長東，汪海濤，常峪文，周明明

（新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院 1.呼吸與危重醫(yī)學(xué)二科，2.重癥醫(yī)學(xué)一科，3.健康管理中心，新疆 烏魯木齊 830001）

特發(fā)性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis,IPF）是一種進(jìn)行性纖維化的肺部疾病，多發(fā)于老年人，且病變部位局限于肺部，目前病因未明，生存期約3～5年，預(yù)后較差[1]。肺纖維化是一種二次打擊疾病，環(huán)境暴露與宿主遺傳相互作用導(dǎo)致肺損傷，目前認(rèn)為多種基因在IPF 發(fā)病過程中起重要作用。其中黏蛋白基因MUC5B啟動子rs35705950 G＞T 多態(tài)性被認(rèn)為是與IPF 發(fā)病相關(guān)的重要遺傳因素[2]。目前在高加索人群（意大利、法國、英國）[3-5]、中國漢族部分人群[6]已有報道，但結(jié)果不完全一致。本文采用PCR-直接測序法對新疆地區(qū)維吾爾族患者M(jìn)UC5B啟動子rs35705950 位點(diǎn)基因多態(tài)性與IPF 發(fā)病的相關(guān)性進(jìn)行初步探討。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究采用基于人群的病例-對照的研究方法，參照2011年ATS/ERS/JRS/ALAT 聯(lián)合發(fā)布的《特發(fā)性肺纖維化診療指南》中的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]，選取2015年 6月—2018年6月新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院呼吸科與重癥醫(yī)學(xué)二科確診維吾爾族IPF 患者88 例為IPF 組。其中，男性53 例，女性35 例；年齡58～77 歲，平均（66.92±5.80）歲；除外已知的繼發(fā)性肺纖維化、腫瘤、結(jié)核病，以及自身免疫性結(jié)締組織疾病相關(guān)的間質(zhì)性肺炎。對照組88 例，納入標(biāo)準(zhǔn)：與IPF 1∶1 配對的新疆地區(qū)維吾爾族人群，性別相同；年齡55～80 歲，平均（66.30±6.06）歲；無間質(zhì)性肺疾病病史，主要來自急診或門診就診及健康管理中心體檢的無慢性疾病患者。

1.2 方法

IPF 組與對照組患者分別抽取外周靜脈血3 ml，置于含有2%乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）100 μl的一次性試管中，用于DNA 抽提；置于-20℃冰箱冷凍保存，常規(guī)酚-氯-仿-異戊醇抽提法提取基因組DNA。采用PCR-直接測序法檢測MUC5B 啟動子rs35705950 G＞T 多態(tài)性，擴(kuò)增引物序列參照文獻(xiàn)[6]，NCBI Accession：1241221，正向引物5'-GC CCATCCCTGCTTTGTG-3'，反向引物5'-CACCTCTGCA TCAGCGAGATAG-3'。PCR 反應(yīng)總體積25 μl，配置如下：正向引物1.5 μl，反向引物1.5 μl，10×PCR 反應(yīng) 緩沖液[含（NH4）SO4]2.5 μl，dNTP mixture 1.2 μl，Taq DNA聚合酶0.2 μl，DNA模板2.0 μl，2.5 μl MgCl2。PCR 擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，最后3 個步驟，共35 個循環(huán)，最后72℃繼續(xù)延伸5 min。PCR 擴(kuò)增片段976 bp。PCR 產(chǎn)物送鼎國生物技術(shù)股份有限公司進(jìn)行DNA 測序。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料以例或例（%）表示，基因型分布是否符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律及兩組間基因型和等位基因頻率分布的差異比較采用χ2檢驗(yàn)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)。計(jì)算比值比（O^R）和95%可信區(qū)間（95% CI）評價突變基因型及突變等位基因頻率與IPF 的相對危險度。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組人群分布符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡

MUC5B啟動子rs35705950 位點(diǎn)各種基因型在IPF 組和對照組人群的分布符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡（P＞0.05），具有群體代表性。

2.2 兩組年齡、性別和吸煙史的比較

兩組年齡、性別比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（年齡：t=0.699，P=0.485，性別：χ2=0.000，P=1.000）；IPF組有吸煙史48 例，對照組有吸煙史52 例，兩組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（吸煙史：χ2=0.371，P=0.543）。

2.3 MUC5B 啟動子rs35705950 G＞T 多態(tài)性及PCR-直接測序分析結(jié)果

MUC5B啟動子rs35705950 G＞T 多態(tài)性及PCR-直接測序分析結(jié)果見圖1。

2.4 MUC5B 啟動子rs35705950 G＞T 基因型、等位基因頻率及發(fā)生IPF 相對危險度分析結(jié)果

IPF 組與對照組中的GT 突變基因型和野生GG基因型構(gòu)成比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；兩組等位基因G 和等位基因T 的差異，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

圖1 MUC5B 啟動子rs35705950 G＞T 多態(tài)性

表1 兩組MUC5B 啟動子rs35705950 基因型、等位基因的分布及相對危險度 例（%）

3 討論

IPF 是一種以增強(qiáng)的細(xì)胞外基質(zhì)沉積為特征，進(jìn)行性、最終致命的慢性間質(zhì)性肺病[8]。肺纖維化是基因調(diào)控（異常肺泡上皮細(xì)胞周期的基因調(diào)控及細(xì)胞凋亡）與環(huán)境壓力相結(jié)合的遺傳傾向，包括暴露于已知的纖維材料[9-10]，因此認(rèn)為遺傳因素在間質(zhì)性肺疾病發(fā)生中可能起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，位于MUC5B啟動子的SNP（rs35705950）被證實(shí)與家族性肺間質(zhì)病和IPF相關(guān)性最強(qiáng)，存在于34%的家族性肺間質(zhì)病和38%的IPF，僅有9%存在于正常對照，并被認(rèn)為是這2 種疾病的危險等位基因[4]。

目前研究證實(shí)，黏蛋白基因MUC5B在氣道黏液纖毛清除、調(diào)節(jié)氣道炎癥、防御肺部感染方面發(fā)揮重要保護(hù)作用[11]。PLANTIER 等[12]對IPF 時細(xì)支氣管末端氣腔特征進(jìn)行了從形態(tài)學(xué)到轉(zhuǎn)錄因子及信號傳導(dǎo)系統(tǒng)相關(guān)性的一系列研究，發(fā)現(xiàn)MUC5B表達(dá)失控參與肺纖維化的形成。該研究發(fā)現(xiàn)，在肺組織中rs35705950 明顯導(dǎo)致IPF 患者高表達(dá)MUC5B免疫組織化學(xué)染色顯示在IPF 時，黏蛋白基因MUC5B在微小蜂窩組織部位積聚，蜂窩囊壁化生的上皮細(xì)胞內(nèi)也有補(bǔ)丁樣染色，同時在蜂窩囊腔中有黏液栓沉積。而過多的黏蛋白基因MUC5B潴留在肺泡和蜂窩組織內(nèi)會損害宿主的防御功能，從而導(dǎo)致因吸入物質(zhì)沉積，肺清除能力下降而引起的肺損傷，另外，過多的黏蛋白基因MUC5B在呼吸性細(xì)支氣管末端沉積會影響損傷肺泡的修復(fù)，正常肺泡的修復(fù)機(jī)制失敗，最終持續(xù)膠原沉積，瘢痕形成，肺結(jié)構(gòu)破壞，隨著時間的推移，最終導(dǎo)致終末期肺纖維化的組織重塑和纖維化。

MUC5B基因位于染色體11p15 的保守簇，主要調(diào)控氣道黏蛋白MUC5B合成。一項(xiàng)來自美國華盛頓大學(xué)對1 例臨床確診IPF 的61 歲歐美男性患者尸體全基因組測序研究發(fā)現(xiàn)，在MUC5B啟動子區(qū)并未發(fā)現(xiàn)除rs35705950 以外其他相鄰的序列變異，也未發(fā)現(xiàn)其他稀少及新發(fā)現(xiàn)遺傳性變型。rs35705950 位于MUC5B啟動子區(qū)，干擾DNA 酶與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，上調(diào)MUC5B表達(dá)。表明MUC5B啟動子區(qū)單核苷酸多態(tài)性可能是與IPF 發(fā)病相關(guān)的重要遺傳因素[2]。BORIE 等[3]報道一項(xiàng)包括法國、意大利人在內(nèi)的前瞻性隊(duì)列研究及Meta分析結(jié)果，MUC5B啟動子G＞T多態(tài)性與IPF 發(fā)病相關(guān)。WANG 等[6]對163 例IPF 患者M(jìn)UC5B啟動子G＞T 多態(tài)性分析，結(jié)果顯示我國漢族人群IPF 患者中，T 等位基因的頻率為3.33%，高于正常對照組，分層分析顯示，該變異與中國老年男性IPF 患者遺傳易感性相關(guān)。

本文通過采用PCR-直接測序的方法對，按照1∶1 配對IPF 組與對照組進(jìn)行MUC5B啟動子位點(diǎn)基因多態(tài)性與IPF 發(fā)病的相關(guān)性進(jìn)行初步探討。結(jié)果顯示，兩組的GT 突變基因型和野生GG 基因型構(gòu)成差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，兩組等位基因G 和T 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。誠然，本研究存在一定局限性，樣本量偏少，且未進(jìn)一步設(shè)立非IPF 特發(fā)性間質(zhì)性肺炎對照研究，今后將進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，并從IPF 環(huán)境暴露及遺傳因素交互作用分析，以及其他IPF 易感基因的確定方面尋找更多證據(jù)，并希望最終能夠從黏蛋白基因MUC5B功能及表達(dá)的研究中進(jìn)一步證實(shí)遺傳易感性在IPF 發(fā)病的作用。