維生素D治療小鼠肺煙曲霉感染的機(jī)制研究

付啟云，戴京京，周武碧，鄭紹同

（南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一醫(yī)院 1.檢驗(yàn)科，2.病理科，江蘇 淮安 223300）

煙曲霉是一種機(jī)會(huì)性致病真菌，當(dāng)患者免疫功能低下，如白血病、實(shí)體器官移植等，可導(dǎo)致侵襲性曲霉病[1-3]。隨著抗菌藥物的大量使用，感染煙曲霉的病例數(shù)呈增加趨勢(shì)，如何有效地控制煙曲霉感染，已成為臨床一大難題[2]。目前有研究揭示炎癥因子在煙曲霉對(duì)肺組織的損傷中扮演重要角色[4]，也有研究顯示，維生素D（Vitamin D,VitD）的血清含量與感染性疾病患者的預(yù)后有關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)VitD 具有調(diào)控機(jī)體免疫的功能[5]，傳統(tǒng)認(rèn)為VitD 具有增強(qiáng)骨質(zhì)的作用，而其對(duì)機(jī)體免疫調(diào)控的影響研究甚少。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)VitD 充足和缺乏的小鼠感染煙曲霉孢子后的肺部真菌負(fù)荷、炎癥因子水平及細(xì)胞感染后相關(guān)蛋白的表達(dá)，探究VitD 治療小鼠煙曲霉肺部感染的機(jī)制，為臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

30只BALB/c 小鼠（SPF 級(jí)），由安徽理工大學(xué)饋贈(zèng)。小鼠4周齡，體重20～22 g。

1.2 材料與試劑

DMEM-H 基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胎牛血清（美國(guó)Gibco 公司），辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔IgG、DAB染液、ECL 發(fā)光液、兔抗鼠IL-8、NF-κB（p50/p65）、IL-1β、IL-6 和TNF-α 單克隆抗體及IL-1β、IL-6和TNF-α、ELISA 檢測(cè)試劑盒（英國(guó)Abcam 公司），VitD（上海依赫生物科技有限公司），沙保羅氏固體瓊脂（河南安圖公司），Trizol 提取液、蛋白裂解液、膠回收試劑盒、IPTG、DNA 標(biāo)準(zhǔn)參照物（日本TaKaRa公司），PVDF 膜（美國(guó)Bio-Rad 公司），Ni2～-NTA（德國(guó)Qiagen 公司），病理染色液（HE）（珠海貝索公司），煙曲霉菌株、PBST 基液、BSA、脫脂奶粉等本實(shí)驗(yàn)室保存配制。

1.3 儀器與設(shè)備

低溫離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf 公司），普通和熒光顯微鏡（日本Olympus 公司），萊卡切片機(jī)（上海企偉公司），凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Syngene 公司），電泳儀（南京馳順公司），超聲破碎儀（寧波新芝生物），酶聯(lián)檢測(cè)儀（臺(tái)灣Meter-tech 公司）。

1.4 方法

1.4.1 煙曲霉感染小鼠模型復(fù)制 取20只小鼠分成兩組，一組喂食含VitD 的飼料，為VitD 充足組（VitD+組），另一組喂食不含VitD 的飼料，為VitD 缺乏組（VitD-組），每組10只，喂養(yǎng)7 d。將低溫保存的煙曲霉接種于沙保羅氏固體瓊脂上，28℃培養(yǎng)72 h。用含0.1% Tween 20 的PBST 液體清洗煙曲霉菌落并制成孢子懸液，用計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)孢子數(shù)為1×106個(gè)/ml，取懸液30 μl 注射VitD+組和VitD-組小鼠肺部。

1.4.2 煙曲霉感染小鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)觀(guān)察 隨機(jī)取兩組小鼠各3只，斷頭處死，解剖，取肺組織，分別經(jīng)HE、革蘭和糖原染色鑒別兩組小鼠肺組織真菌載量。

1.4.3 煙曲霉感染小鼠血清和肺組織中炎癥因子檢測(cè) 隨機(jī)取兩組小鼠各3只，摘除眼球處死，采集血清，ELISA 檢測(cè)小鼠血清中炎癥因子IL-1β、IL-6 和TNF-α 的含量；解剖，取肺組織，免疫組織化學(xué)法檢測(cè)IL-1β、IL-6 和TNF-α 的表達(dá)[6-8]。余下4只備用最后銷(xiāo)毀。

1.4.4 熒光顯微鏡觀(guān)察 健康小鼠10只，喂養(yǎng)飼料，7 d 后無(wú)菌取其肺組織，用無(wú)菌研缽進(jìn)行研磨，加入5 ml 生理鹽水充分混勻；將混勻的液體過(guò)100 μm/孔細(xì)胞篩，獲得小鼠肺巨細(xì)胞懸液，調(diào)整濃度至1×105個(gè)/ml 備用；將分離的小鼠肺巨細(xì)胞懸液1.5 ml 與煙曲霉孢子懸液（1×104個(gè)/ml）0.5 ml于6孔板中共孵育，3 孔培養(yǎng)基加VitD 0.5 ml（終濃度20 ng/ml），3 孔培養(yǎng)基不加VitD，分別于培養(yǎng)1 和3 h 后熒光顯微鏡下觀(guān)察小鼠肺巨噬細(xì)胞吞噬煙曲霉孢子變化[6-8]。

1.4.5 RT-PCR 和Western blotting 檢測(cè)分別收集1.4.4 中共培養(yǎng)后的小鼠肺巨噬細(xì)胞，用Trizol 提取總RNA，RT-PCR 擴(kuò)增IL-8 和NF-κB；收集1.4.4 中共培養(yǎng)后的小鼠肺巨噬細(xì)胞并裂解，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)PVDF 膜并用封閉液4℃封閉過(guò)夜，加兔抗鼠IL-8、NF-κB，37℃孵育1 h，PBST 洗3 次，加HRP 標(biāo)記的羊抗兔IgG，37℃孵育2 h，PBST 洗3 次，ECL 發(fā)光液孵育、曝光，Western blotting分析IL-8 和NF-κB 的表達(dá)[8]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用GraphPad Prism 6.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量 資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 VitD 對(duì)煙曲霉感染小鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)的影響

VitD+組的小鼠肺實(shí)變輕、載菌量少，而VitD-組的小鼠肺實(shí)變重、載菌量多。HE 染色煙曲霉孢子呈紫紅色，革蘭染色呈藍(lán)色，糖元染色呈粉紅色。見(jiàn)圖1。

2.2 VitD 對(duì)煙曲霉感染小鼠肺組織和血清中炎癥因子表達(dá)的影響

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示VitD+組小鼠肺組織顆粒顯色少而淺，表明VitD+組肺組織中IL-1β、IL-6 和TNF-α 的表達(dá)水平低，而VitD-組小鼠肺組織顆粒顯色多而深，表明VitD-組肺組織中IL-1β、IL-6 和 TNF-α 的表達(dá)水平高（見(jiàn)圖2）；兩組血清中IL-1β、IL-6 和TNF-α 的含量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。見(jiàn)表1。

2.3 VitD 對(duì)肺巨噬細(xì)胞吞噬有調(diào)控作用

VitD、煙曲霉孢子和健康小鼠巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后，VitD+組可調(diào)控肺巨噬細(xì)胞吞噬煙曲霉孢子在一個(gè)合理水平而不易引起細(xì)胞自噬性死亡。見(jiàn)圖3。

圖1 煙曲霉感染小鼠肺組織病理形態(tài)（×400）

圖2 兩組TNF-α、IL-6 和IL-1β 在肺組織中的定位表達(dá)（免疫組織化學(xué)×100）

2.4 VitD 對(duì)煙曲霉感染肺部巨噬細(xì)胞炎癥相關(guān)蛋白IL-8、NF-κB 表達(dá)的影響

VitD、煙曲霉和健康小鼠巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后，RT-PCR 結(jié)果顯示，在基因轉(zhuǎn)錄水平上，VitD+組肺巨噬細(xì)胞IL-8 和NF-κB 的表達(dá)水平低；Western blotting 結(jié)果顯示，在蛋白表達(dá)水平上，VitD+組肺巨噬細(xì)胞IL-8 和NF-κB 的表達(dá)水平低。兩組基因轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖4 和表2、3。

表1 兩組小鼠血清IL-1β、IL-6 和TNF-α 含量的比較（n =3，pg/ml，±s）

表1 兩組小鼠血清IL-1β、IL-6 和TNF-α 含量的比較（n =3，pg/ml，±s）

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圖3 VitD 對(duì)肺巨噬細(xì)胞吞噬的調(diào)控（未染色普通暗視野×800）

圖4 VitD 對(duì)煙曲霉感染肺巨噬細(xì)胞的炎癥相關(guān)蛋白IL-8、NF-κB 表達(dá)的影響

表2 兩組小鼠肺巨噬細(xì)胞IL-8 和NF-κB（p50/p65）基因轉(zhuǎn)錄水平的比較（n =3，pg/ml，±s）

表2 兩組小鼠肺巨噬細(xì)胞IL-8 和NF-κB（p50/p65）基因轉(zhuǎn)錄水平的比較（n =3，pg/ml，±s）

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表3 兩組小鼠肺巨噬細(xì)胞IL-8和NF-κB（p50/p65蛋白）蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較（n =3，pg/ml，±s）

表3 兩組小鼠肺巨噬細(xì)胞IL-8和NF-κB（p50/p65蛋白）蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較（n =3，pg/ml，±s）

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3 討論

侵襲性曲霉病是由煙曲霉引起的一種疾病，最近研究顯示，炎癥因子在煙曲霉對(duì)肺的損傷中起重要作用,煙曲霉可誘導(dǎo)炎癥因子浸潤(rùn)肺組織，從而誘導(dǎo)肺炎的發(fā)生，加重?zé)熐沟那忠u損害[4]。曲霉病常導(dǎo)致免疫功能低下的患者死亡，對(duì)人類(lèi)生命構(gòu)成巨大威脅。目前臨床煙曲霉感染率正逐年上升，臨床常用藥的耐藥問(wèn)題越來(lái)越突出[6-8]。且臨床常用的抗真菌藥，如唑類(lèi)的氟康唑、酮康唑，丙烯胺類(lèi)的特比萘芬、萘替芬，多烯類(lèi)的兩性霉素B、制霉菌素等多有耐藥及不良反應(yīng)的存在[9]。而VitD 目前已用于細(xì)菌感染的治療，如果其用于抗煙曲霉感染，不僅減少煙曲霉的耐藥，而且可從日常飲食及自身合成、攝取，具有來(lái)源廣泛及易于獲取的優(yōu)點(diǎn)，不良反應(yīng)小、價(jià)格便宜等特點(diǎn)，具有廣泛的應(yīng)用前景，值得研究推廣應(yīng)用。

本研究煙曲霉感染小鼠肺部后，從小鼠肺組織的載菌量、炎癥因子的表達(dá)、實(shí)變及血清中炎癥因子的含量結(jié)果可知，VitD+組小鼠比VitD-組小鼠肺部的真菌孢子數(shù)少且肺部的實(shí)變輕；炎癥因子在組織和血清的表達(dá)VitD+組低于VitD-組。體外將健康小鼠肺巨噬細(xì)胞與煙曲霉孢子共孵育，結(jié)果顯示，VitD 可調(diào)控肺巨噬細(xì)胞吞噬煙曲霉孢子在一個(gè)合理水平；缺乏VitD 調(diào)控，巨噬細(xì)胞不斷吞噬煙曲霉孢子，易引起巨噬細(xì)胞自噬性死亡。結(jié)果還顯示：VitD+組的巨噬細(xì)胞IL-8、NF-κB 基因和蛋白表達(dá)水平低于VitD-組。以上結(jié)果可以說(shuō)明，VitD 可通過(guò)降低細(xì)胞和組織的炎癥因子的表達(dá)來(lái)調(diào)控肺巨噬細(xì)胞抵抗煙曲霉的感染，從而提高小鼠的生存率和生存質(zhì)量，為臨床治療提供參考。

本課題基于組織和血清中炎癥因子的表達(dá)，研究VitD 對(duì)細(xì)胞感染煙曲霉后的調(diào)控作用，特別是對(duì)炎癥相關(guān)蛋白調(diào)控的研究，將會(huì)幫助臨床工作者更加理解VitD 對(duì)人體煙曲霉感染性疾病的治療新作用，為臨床提供輔助治療方法，為臨床耐藥問(wèn)題的解決提供一種方法。進(jìn)一步研究VitD 抵抗真菌感染的機(jī)制具有重要意義，其在調(diào)控細(xì)胞炎癥因子抵抗真菌感染方面的作用將日益受到關(guān)注。