維生素D治療小鼠肺煙曲霉感染的機制研究

付啟云，戴京京，周武碧，鄭紹同

（南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一醫(yī)院 1.檢驗科，2.病理科，江蘇 淮安 223300）

煙曲霉是一種機會性致病真菌，當(dāng)患者免疫功能低下，如白血病、實體器官移植等，可導(dǎo)致侵襲性曲霉病[1-3]。隨著抗菌藥物的大量使用，感染煙曲霉的病例數(shù)呈增加趨勢，如何有效地控制煙曲霉感染，已成為臨床一大難題[2]。目前有研究揭示炎癥因子在煙曲霉對肺組織的損傷中扮演重要角色[4]，也有研究顯示，維生素D（Vitamin D,VitD）的血清含量與感染性疾病患者的預(yù)后有關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)VitD 具有調(diào)控機體免疫的功能[5]，傳統(tǒng)認為VitD 具有增強骨質(zhì)的作用，而其對機體免疫調(diào)控的影響研究甚少。因此，本實驗通過檢測VitD 充足和缺乏的小鼠感染煙曲霉孢子后的肺部真菌負荷、炎癥因子水平及細胞感染后相關(guān)蛋白的表達，探究VitD 治療小鼠煙曲霉肺部感染的機制，為臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

30只BALB/c 小鼠（SPF 級），由安徽理工大學(xué)饋贈。小鼠4周齡，體重20～22 g。

1.2 材料與試劑

DMEM-H 基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胎牛血清（美國Gibco 公司），辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔IgG、DAB染液、ECL 發(fā)光液、兔抗鼠IL-8、NF-κB（p50/p65）、IL-1β、IL-6 和TNF-α 單克隆抗體及IL-1β、IL-6和TNF-α、ELISA 檢測試劑盒（英國Abcam 公司），VitD（上海依赫生物科技有限公司），沙保羅氏固體瓊脂（河南安圖公司），Trizol 提取液、蛋白裂解液、膠回收試劑盒、IPTG、DNA 標(biāo)準(zhǔn)參照物（日本TaKaRa公司），PVDF 膜（美國Bio-Rad 公司），Ni2～-NTA（德國Qiagen 公司），病理染色液（HE）（珠海貝索公司），煙曲霉菌株、PBST 基液、BSA、脫脂奶粉等本實驗室保存配制。

1.3 儀器與設(shè)備

低溫離心機（德國Eppendorf 公司），普通和熒光顯微鏡（日本Olympus 公司），萊卡切片機（上海企偉公司），凝膠成像系統(tǒng)（美國Syngene 公司），電泳儀（南京馳順公司），超聲破碎儀（寧波新芝生物），酶聯(lián)檢測儀（臺灣Meter-tech 公司）。

1.4 方法

1.4.1 煙曲霉感染小鼠模型復(fù)制 取20只小鼠分成兩組，一組喂食含VitD 的飼料，為VitD 充足組（VitD+組），另一組喂食不含VitD 的飼料，為VitD 缺乏組（VitD-組），每組10只，喂養(yǎng)7 d。將低溫保存的煙曲霉接種于沙保羅氏固體瓊脂上，28℃培養(yǎng)72 h。用含0.1% Tween 20 的PBST 液體清洗煙曲霉菌落并制成孢子懸液，用計數(shù)器計數(shù)孢子數(shù)為1×106個/ml，取懸液30 μl 注射VitD+組和VitD-組小鼠肺部。

1.4.2 煙曲霉感染小鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)觀察 隨機取兩組小鼠各3只，斷頭處死，解剖，取肺組織，分別經(jīng)HE、革蘭和糖原染色鑒別兩組小鼠肺組織真菌載量。

1.4.3 煙曲霉感染小鼠血清和肺組織中炎癥因子檢測 隨機取兩組小鼠各3只，摘除眼球處死，采集血清，ELISA 檢測小鼠血清中炎癥因子IL-1β、IL-6 和TNF-α 的含量；解剖，取肺組織，免疫組織化學(xué)法檢測IL-1β、IL-6 和TNF-α 的表達[6-8]。余下4只備用最后銷毀。

1.4.4 熒光顯微鏡觀察 健康小鼠10只，喂養(yǎng)飼料，7 d 后無菌取其肺組織，用無菌研缽進行研磨，加入5 ml 生理鹽水充分混勻；將混勻的液體過100 μm/孔細胞篩，獲得小鼠肺巨細胞懸液，調(diào)整濃度至1×105個/ml 備用；將分離的小鼠肺巨細胞懸液1.5 ml 與煙曲霉孢子懸液（1×104個/ml）0.5 ml于6孔板中共孵育，3 孔培養(yǎng)基加VitD 0.5 ml（終濃度20 ng/ml），3 孔培養(yǎng)基不加VitD，分別于培養(yǎng)1 和3 h 后熒光顯微鏡下觀察小鼠肺巨噬細胞吞噬煙曲霉孢子變化[6-8]。

1.4.5 RT-PCR 和Western blotting 檢測分別收集1.4.4 中共培養(yǎng)后的小鼠肺巨噬細胞，用Trizol 提取總RNA，RT-PCR 擴增IL-8 和NF-κB；收集1.4.4 中共培養(yǎng)后的小鼠肺巨噬細胞并裂解，進行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)PVDF 膜并用封閉液4℃封閉過夜，加兔抗鼠IL-8、NF-κB，37℃孵育1 h，PBST 洗3 次，加HRP 標(biāo)記的羊抗兔IgG，37℃孵育2 h，PBST 洗3 次，ECL 發(fā)光液孵育、曝光，Western blotting分析IL-8 和NF-κB 的表達[8]。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用GraphPad Prism 6.0 統(tǒng)計軟件，計量 資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用t檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 VitD 對煙曲霉感染小鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)的影響

VitD+組的小鼠肺實變輕、載菌量少，而VitD-組的小鼠肺實變重、載菌量多。HE 染色煙曲霉孢子呈紫紅色，革蘭染色呈藍色，糖元染色呈粉紅色。見圖1。

2.2 VitD 對煙曲霉感染小鼠肺組織和血清中炎癥因子表達的影響

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示VitD+組小鼠肺組織顆粒顯色少而淺，表明VitD+組肺組織中IL-1β、IL-6 和TNF-α 的表達水平低，而VitD-組小鼠肺組織顆粒顯色多而深，表明VitD-組肺組織中IL-1β、IL-6 和 TNF-α 的表達水平高（見圖2）；兩組血清中IL-1β、IL-6 和TNF-α 的含量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）。見表1。

2.3 VitD 對肺巨噬細胞吞噬有調(diào)控作用

VitD、煙曲霉孢子和健康小鼠巨噬細胞共培養(yǎng)后，VitD+組可調(diào)控肺巨噬細胞吞噬煙曲霉孢子在一個合理水平而不易引起細胞自噬性死亡。見圖3。

圖1 煙曲霉感染小鼠肺組織病理形態(tài)（×400）

圖2 兩組TNF-α、IL-6 和IL-1β 在肺組織中的定位表達（免疫組織化學(xué)×100）

2.4 VitD 對煙曲霉感染肺部巨噬細胞炎癥相關(guān)蛋白IL-8、NF-κB 表達的影響

VitD、煙曲霉和健康小鼠巨噬細胞共培養(yǎng)后，RT-PCR 結(jié)果顯示，在基因轉(zhuǎn)錄水平上，VitD+組肺巨噬細胞IL-8 和NF-κB 的表達水平低；Western blotting 結(jié)果顯示，在蛋白表達水平上，VitD+組肺巨噬細胞IL-8 和NF-κB 的表達水平低。兩組基因轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖4 和表2、3。

表1 兩組小鼠血清IL-1β、IL-6 和TNF-α 含量的比較（n =3，pg/ml，±s）

表1 兩組小鼠血清IL-1β、IL-6 和TNF-α 含量的比較（n =3，pg/ml，±s）

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圖3 VitD 對肺巨噬細胞吞噬的調(diào)控（未染色普通暗視野×800）

圖4 VitD 對煙曲霉感染肺巨噬細胞的炎癥相關(guān)蛋白IL-8、NF-κB 表達的影響

表2 兩組小鼠肺巨噬細胞IL-8 和NF-κB（p50/p65）基因轉(zhuǎn)錄水平的比較（n =3，pg/ml，±s）

表2 兩組小鼠肺巨噬細胞IL-8 和NF-κB（p50/p65）基因轉(zhuǎn)錄水平的比較（n =3，pg/ml，±s）

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表3 兩組小鼠肺巨噬細胞IL-8和NF-κB（p50/p65蛋白）蛋白相對表達量的比較（n =3，pg/ml，±s）

表3 兩組小鼠肺巨噬細胞IL-8和NF-κB（p50/p65蛋白）蛋白相對表達量的比較（n =3，pg/ml，±s）

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3 討論

侵襲性曲霉病是由煙曲霉引起的一種疾病，最近研究顯示，炎癥因子在煙曲霉對肺的損傷中起重要作用,煙曲霉可誘導(dǎo)炎癥因子浸潤肺組織，從而誘導(dǎo)肺炎的發(fā)生，加重?zé)熐沟那忠u損害[4]。曲霉病常導(dǎo)致免疫功能低下的患者死亡，對人類生命構(gòu)成巨大威脅。目前臨床煙曲霉感染率正逐年上升，臨床常用藥的耐藥問題越來越突出[6-8]。且臨床常用的抗真菌藥，如唑類的氟康唑、酮康唑，丙烯胺類的特比萘芬、萘替芬，多烯類的兩性霉素B、制霉菌素等多有耐藥及不良反應(yīng)的存在[9]。而VitD 目前已用于細菌感染的治療，如果其用于抗煙曲霉感染，不僅減少煙曲霉的耐藥，而且可從日常飲食及自身合成、攝取，具有來源廣泛及易于獲取的優(yōu)點，不良反應(yīng)小、價格便宜等特點，具有廣泛的應(yīng)用前景，值得研究推廣應(yīng)用。

本研究煙曲霉感染小鼠肺部后，從小鼠肺組織的載菌量、炎癥因子的表達、實變及血清中炎癥因子的含量結(jié)果可知，VitD+組小鼠比VitD-組小鼠肺部的真菌孢子數(shù)少且肺部的實變輕；炎癥因子在組織和血清的表達VitD+組低于VitD-組。體外將健康小鼠肺巨噬細胞與煙曲霉孢子共孵育，結(jié)果顯示，VitD 可調(diào)控肺巨噬細胞吞噬煙曲霉孢子在一個合理水平；缺乏VitD 調(diào)控，巨噬細胞不斷吞噬煙曲霉孢子，易引起巨噬細胞自噬性死亡。結(jié)果還顯示：VitD+組的巨噬細胞IL-8、NF-κB 基因和蛋白表達水平低于VitD-組。以上結(jié)果可以說明，VitD 可通過降低細胞和組織的炎癥因子的表達來調(diào)控肺巨噬細胞抵抗煙曲霉的感染，從而提高小鼠的生存率和生存質(zhì)量，為臨床治療提供參考。

本課題基于組織和血清中炎癥因子的表達，研究VitD 對細胞感染煙曲霉后的調(diào)控作用，特別是對炎癥相關(guān)蛋白調(diào)控的研究，將會幫助臨床工作者更加理解VitD 對人體煙曲霉感染性疾病的治療新作用，為臨床提供輔助治療方法，為臨床耐藥問題的解決提供一種方法。進一步研究VitD 抵抗真菌感染的機制具有重要意義，其在調(diào)控細胞炎癥因子抵抗真菌感染方面的作用將日益受到關(guān)注。