黃芩苷對糖尿病腎病小鼠腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響*

尹青橋，夏瑗瑜，陳杰，肖玲，王優(yōu)，趙媛媛，葉剛，吳軍

（武漢市第三醫(yī)院 1.腎內(nèi)科，2.內(nèi)分泌科，湖北 武漢 430062）

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy,DN）是終末期腎衰竭的主要原因，也是糖尿病患者死亡的重要原因[1]。隨著全球2 型糖尿病患病率的增加，需要進(jìn)行連續(xù)腎臟替代療法的患者數(shù)量也迅速增加[2]。目前，有關(guān)DN 治療和發(fā)病機(jī)制的研究已有很多，但成效甚微。大多數(shù)研究表明DN 發(fā)病與機(jī)體的氧化應(yīng)激反應(yīng)（oxidative stress,OS）有關(guān)[3]，因此，對抗OS 損傷可能成為有效預(yù)防和治療DN 的途徑之一?？寡趸磻?yīng)元件（antioxidant response element,ARE）是機(jī)體抵抗OS 損傷的路徑之一。核因子E2 相關(guān)因子2（nuclear factor-erythroid-2-related factor 2,Nrf2）作為ARE 的激活因子，可通過刺激各種抗氧化相關(guān)基因的表達(dá)在抵御OS 中發(fā)揮重要作用[4-5]。當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)OS 狀態(tài)時(shí)，Nrf2 轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)與ARE 結(jié)合，啟動(dòng)抗氧化相關(guān)基因的表達(dá)，從而增強(qiáng)細(xì)胞抗OS 的能力。此外，OS 損傷是導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞凋亡的重要機(jī)制。然而，有關(guān)Nrf2-ARE 信號通路在腎小管上皮細(xì)胞凋亡中的作用鮮有報(bào)道。

黃芩苷一種從中藥中提取的黃酮苷類化合物[6]，具有清除氧自由基、抑菌消炎、降壓、抗腫瘤、抗細(xì)胞凋亡、抗氧化等的作用，被廣泛用于治療傳染病和炎癥性疾病[7-8]。此外，黃芩苷對腎臟也具有一定的保護(hù)作用。ZHANG 等[9]發(fā)現(xiàn)黃芩苷能改善鉛中毒引起的小鼠腎臟氧化損傷。LIN 等[10]發(fā)現(xiàn)黃芩苷通過減輕氧化應(yīng)激和腎缺血再灌注損傷改善腎功能。最值得關(guān)注的是，有研究還發(fā)現(xiàn)黃芩苷對治療DN 有重要作用[11-13]。然而，黃芩苷治療DN 的作用機(jī)制尚未完全闡明。因此，本研究旨在探討黃芩苷對腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響及其在DN 治療中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料、試劑及儀器

C57BL/6 雄性小鼠（8周齡，20～22 g）購自武漢 大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[SYXK（鄂）2014-0013]，ARE 報(bào)告基因試劑盒、Dual-Glo?熒光素酶檢測試劑盒、ELISA 試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司，丙二醛（Malondialdehyde,MDA）檢測試劑盒購自南京建成生物工程有限公司，Nrf2 抗體購自美國Santa Cruz 公司，細(xì)胞溶解緩沖液、BCA 蛋白分析試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，ECL 發(fā)光液購自美國Millipore 公司，Nrf2 激活劑NK-252 購自美國Med Chem Express 公司，血糖儀購自美國強(qiáng)生公司，鏈脲佐菌素（Streptozocin,STZ）購自美國Sigma 公司，Lipofectamine 2000 購自美國Invitrogen 公司，黃芩苷購自南京青澤醫(yī)藥科技開發(fā)有限公司，F(xiàn)ACS Verse 流式細(xì)胞儀購自美國Becton-Dickinson 公司。

1.2 DN 模型復(fù)制

30只C57BL/6 雄性小鼠隨機(jī)分成空白對照組（對照組）、DN 模型組（DN 組）和黃芩苷干預(yù)組（干預(yù)組），每組10只。

小鼠禁食12 h 后，腹腔單次注射150 mg/kg STZ溶液（STZ 溶解在pH 4.5 的檸檬酸緩沖溶液中）；72 h 后于小鼠尾尖取血，并用血糖儀測量血糖，血糖＞ 16.17 mmol/L 且持續(xù)出現(xiàn)蛋白尿（尿白蛋白＞300 μg/24 h）的小鼠視為DN 模型復(fù)制成功。模型復(fù)制成功后每隔3 天對血糖和尿白蛋白進(jìn)行復(fù)查。

對照組予同劑量檸檬酸緩沖溶液。干預(yù)組在模型復(fù)制成功后予黃芩苷（80 mg/kg）灌胃給藥，1 次/d，持續(xù)10周。實(shí)驗(yàn)最后1 天用代謝籠收集各組小鼠24 h 尿液樣本，并用ELISA 試劑盒（一步ELISA 法）測定尿白蛋白濃度。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，安樂死小鼠，取腎臟于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。?dòng)物實(shí)驗(yàn)獲得武漢市第三醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.3 腎小管病理學(xué)觀察

取上述各組小鼠的腎組織并用4%多聚甲醛固定，行常規(guī)石蠟包埋、切片及HE 染色后，于普通光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.4 Western blotting 檢測Nrf2 蛋白表達(dá)水平

取小鼠腎組織或腎小管上皮細(xì)胞，加入細(xì)胞溶解緩沖液后置于冰上孵育30 min。收集細(xì)胞裂解液經(jīng)12 000 r/min 離心5 min 后，取上清液并用BCA 蛋白分析試劑盒檢測蛋白濃度。取等量的蛋白樣品（60 μg）進(jìn)行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）。隨后將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯膜（PVDF）上并用5%脫脂奶粉封閉1 h。接著PVDF 與一抗（Nrf2抗體，1∶500）4℃孵育過夜；洗膜后加入二抗并于室溫下孵育1 h。最后，洗膜3 次，ECL 發(fā)光液顯色并掃描結(jié)果，利用Laser densitometer分析軟件進(jìn)行定量分析。β-actin 為內(nèi)參。

1.5 ARE 報(bào)告基因活性檢測

通過ARE 報(bào)告基因試劑盒檢測ARE 的活性。將目標(biāo)細(xì)胞接種在96 孔培養(yǎng)板上，當(dāng)細(xì)胞融合率達(dá)80%時(shí)進(jìn)行ARE 熒光素酶報(bào)告基因載體轉(zhuǎn)染。24 h后收集細(xì)胞用于熒光素酶活性檢測。依照Dual-Glo?熒光素酶檢測試劑盒說明書操作，將20 μl 細(xì)胞裂解液和100 μl 熒光素酶測試試劑Ⅱ混合，采用VICTOR ×多標(biāo)記檢測儀檢測細(xì)胞裂解物螢火蟲熒光素酶的活力。隨后，每孔加入100 μl Stop & Glo ? 試劑，湮滅螢火蟲熒光素酶反應(yīng)，同時(shí)激活海腎熒光素酶反應(yīng)，并檢測其活力。螢火蟲熒光素酶值/海腎熒光素酶值即為相對熒光素酶值。

1.6 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.6.1 腎小管上皮細(xì)胞的分離和培養(yǎng) 取小鼠腎臟，分離并剪碎腎皮質(zhì)，過100 目篩收集腎小管節(jié)段，加入 0.25%胰蛋白酶并于37℃水浴下消化30 min。消化終止后離心、棄上清液，收集腎小管上皮細(xì)胞，在DMEM（含25 mmol/L 葡萄糖）中于37℃、5%二氧化碳CO2的飽和濕度條件下培養(yǎng)。DMEM 中含100 mg/L鏈霉素、100 u/L 青霉素和10%胎牛血清。待細(xì)胞融合度達(dá)80%～90%，消化后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.6.2 實(shí)驗(yàn)分組及處理方法 ①高糖組：細(xì)胞在含25 mmol/L 葡萄糖的高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)；②激活組：細(xì)胞在高糖組處理的基礎(chǔ)上，用Nrf2 激活劑NK-252（20 μmol/ml）預(yù)處理腎小管上皮細(xì)胞24 h。③黃芩 苷組：細(xì)胞在高糖組處理的基礎(chǔ)上，用黃芩苷（100 μmol/L）預(yù)處理腎小管上皮細(xì)胞24 h。④干擾對照組：高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞在加入黃芩苷的同時(shí)，通過Lipofectamine 2000 對腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-control（si-Nrf2 的陰性對照），24 h 后收集細(xì)胞。⑤Nrf2 干擾組：高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞在加入黃芩苷的同時(shí)，通過Lipofectamine 2000 對腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-Nrf2（Nrf2 的小干擾RNA），24 h 后收集細(xì)胞。

1.6.3 MDA 表達(dá)檢測 按照MDA 試劑盒說明書操作方法檢測MDA 的含量。取處理后的細(xì)胞至1.5 ml離心管中，按說明書步驟加入樣本和試劑，混勻后，沸水浴40 min，流水冷卻后，10 000 r/min 離心10 min，取200 μl 上清液于96 孔板，并于酶標(biāo)儀532 nm 波長處讀取吸光度值。

1.6.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測腎小管上皮細(xì)胞凋亡 取腎小管上皮細(xì)胞，加入0.25%胰蛋白酶消化后，經(jīng) 1 000 r/min 離心5 min，棄上清液并用磷酸鹽緩沖液洗滌2 次。加入Annexin V-FITC（5 μl）和碘化丙啶（PI）（10 μl），室溫下避光孵育5 min 后，用FACS Verse 流式細(xì)胞儀通過熒光激活細(xì)胞分選術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPPS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組比較采用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，兩組比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠尿白蛋白水平

對照組、DN 組和干預(yù)組小鼠尿白蛋白水平分別為（15.312±3.684）、（141.133±14.467）和（83.222± 13.567）mg/L，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=27.512，P=0.001）。進(jìn)一步兩兩比較，DN 組小鼠的尿白蛋白水平較對照組高（t=-5.167，P=0.000）；干預(yù)組小鼠的尿白蛋白水平較DN 組低（t=4.867，P=0.002）。此外，普通光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果顯示，DN 組小鼠的腎小管擴(kuò)張變形，而干預(yù)組小鼠的腎小管擴(kuò)張變形程度減輕。見圖1。

2.2 黃芩苷對DN 小鼠腎組織中Nrf2 蛋白表達(dá)和ARE 活性的影響

干預(yù)組小鼠腎組織中Nrf2 的蛋白表達(dá)水平高于DN 組。干預(yù)組小鼠腎組織中的ARE 活性為DN 組的（1.600±0.200）倍，兩者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-5.233，P=0.000），干預(yù)組小鼠ARE 的活性大于DN組。見圖2。

2.3 激活Nrf2 對小鼠腎組織中ARE 活性及腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響

激活組的Nrf2 蛋白表達(dá)水平高于高糖組；激活組的ARE 活性為高糖組的（1.590±0.080）倍（t=-4.233，P=0.000）；高糖組和激活組MDA 含量分別為（21.333±2.631）和（8.667±2.234）nmol/mg，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.412，P=0.003）；高糖組和激活組腎小管上皮細(xì)胞凋亡率為（16.667±2.122）%和（10.333±3.167）%，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.124，P=0.031）。與高糖組比較，激活組ARE 的活性增強(qiáng)，而MDA 的含量減少，腎小管上皮細(xì)胞凋亡數(shù)目降低。見圖3。

2.4 黃芩苷對Nrf2-ARE 信號通路的影響

黃芩苷組的Nrf2 蛋白表達(dá)水平高于高糖組，黃芩苷組的ARE 活性為高糖組的（1.710±0.111）倍。黃芩苷組ARE 的活性大于高糖組（t=-6.533，P=0.000）。見圖4。

2.5 干擾Nrf2 對小鼠腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響

4 組MDA 和細(xì)胞凋亡率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較后發(fā)現(xiàn)，與高糖組比較，黃芩苷組腎小管上皮細(xì)胞中MDA 的表達(dá)降低（t=3.748，P=0.000），細(xì)胞凋亡數(shù)目減少（t=2.667，P=0.027）；與干擾對照組比較，Nrf2 干擾組腎小管上皮細(xì)胞中MDA的表達(dá)升高（t=-5.968，P=0.001），細(xì)胞凋亡數(shù)目增多（t=-3.445，P=0.035）。見表1。

圖1 各組小鼠腎小管病理切片（HE 染色×400）

圖2 兩組小鼠腎組織中Nrf2 蛋白表達(dá) 和ARE 活性的比較

圖3 激活Nrf2 對小鼠腎組織中ARE 活性 及腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響

圖4 黃芩苷對Nrf2-ARE 信號通路的影響

表1 干擾Nrf2 對小鼠腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響（±s）

表1 干擾Nrf2 對小鼠腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響（±s）

注：①與高糖組比較，P＜0.05；②與干擾對照組比較，P＜0.05。

?

3 討論

DN 是糖尿病微血管并發(fā)癥之一，其發(fā)病機(jī)制是一個(gè)極其復(fù)雜的過程，與多種因素有關(guān)，包括高血壓、遺傳、氧化應(yīng)激、腎臟血流動(dòng)力學(xué)和血管活性物質(zhì)異常、高血糖癥、局部腎素-血管緊張素系統(tǒng)的激活，以及促炎癥細(xì)胞因子的增加等[14-16]。尿白蛋白增多是腎小球損傷的標(biāo)志，也是DN 發(fā)病的早期臨床表現(xiàn)[17]。腎小球高濾引起尿白蛋白增多，加重系統(tǒng)性高血壓，最終導(dǎo)致腎功能的逐漸喪失。目前，DN 的治療重點(diǎn)是改善血糖和控制血壓，而對腎臟的功能幾乎沒有改善[18]。因此，尋找能改善DN 患者腎功能的藥物具有潛在的臨床意義。

黃芩苷是黃芩中黃酮類成分之一，研究顯示黃芩苷對急性肝損傷[19]、腦缺血損傷[20]、膿毒癥[7]、牙周炎[21]及結(jié)腸炎等[22]具有緩解作用。KONG 等[23]發(fā)現(xiàn)黃芩苷能通過抗氧化和旁分泌作用保護(hù)離體大鼠心肌免受再灌注損傷。LIU 等[24]報(bào)道說黃芩苷能減輕二氧化硅誘導(dǎo)的炎癥性纖維化肺疾病。此外，LIN 等[10]表明黃芩苷通過抑制炎癥反應(yīng)和線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡發(fā)揮對腎臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。本研究發(fā)現(xiàn)黃芩苷能夠降低DN 小鼠尿白蛋白，說明黃芩苷能有效減少蛋白尿的形成，這有助于緩解早期DN 的腎臟功能。對DN 小鼠腎組織的檢測發(fā)現(xiàn)，黃芩苷能促進(jìn)Nrf2 的表達(dá)，增強(qiáng)ARE 的活性。因此，筆者推測黃芩苷可能通過調(diào)控Nrf2-ARE 信號通路來發(fā)揮其腎保護(hù)作用。

Nrf2 作為一個(gè)亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子，于1994年首次被發(fā)現(xiàn)[25]。目前，Nrf2 被認(rèn)為是抗氧化反應(yīng)的“總開關(guān)”，能夠介導(dǎo)多種氧化應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)，包括抗氧化蛋白、Ⅰ型和Ⅱ型解毒酶、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、蛋白酶體亞基以及一些轉(zhuǎn)錄因子等[26-27]。ARE 是細(xì)胞保護(hù)基因啟動(dòng)子調(diào)控區(qū)的一段保守序列，該序列能被Nrf2 激活[27]。研究顯示Nrf2-ARE 信號通路對某些疾病具有一定的調(diào)節(jié)作用。LIANG 等[28]研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇能激活Nrf2/ARE 信號通路來減輕炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，從而緩解心肌缺血再灌注損傷。HUANG 等[29]報(bào)道虎杖苷通過活化Nrf2-ARE 信號通路來抑制DN 的發(fā)展。本研究發(fā)現(xiàn)，在高糖培養(yǎng)的小鼠腎小管上皮細(xì)胞中，黃芩苷能提高Nrf2 的表達(dá)水平和ARE 的活性，降低脂質(zhì)過氧化反應(yīng)產(chǎn)物MDA 的含量并抑制腎小管上皮細(xì)胞凋亡，而si-Nrf2 能逆轉(zhuǎn)黃芩苷的作用。由此說明，黃芩苷可通過激活Nrf2-ARE 信號通路抑制腎小管上皮細(xì)胞凋亡。

綜上所述，黃芩苷對DN 小鼠腎臟保護(hù)的機(jī)制可能是通過激活Nrf2-ARE 信號來提高腎的抗OS 能力，進(jìn)而抑制DN 的發(fā)展。這為DN 的治療提供了一個(gè)新的研究方向。