AT1受體在同型半胱氨酸致動(dòng)脈粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定性中的作用機(jī)制研究*

李天翔，祝志波，郝祥宇，郭建強(qiáng)

（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 心內(nèi)科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010050）

同型半胱氨酸（Homocysteine,Hcy）是導(dǎo)致或加重動(dòng)脈粥樣硬化的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，可直接引起內(nèi)皮損傷及功能障礙、炎癥細(xì)胞通透性增加、平滑肌細(xì)胞凋亡、增強(qiáng)氧化應(yīng)激反應(yīng)、血小板聚集性增加、凝血因子活化增強(qiáng)等血栓前狀態(tài)[1-6]，Hcy 與斑塊的穩(wěn)定性密切相關(guān)，但其機(jī)制尚不清楚。本文擬探討血管緊張素Ⅱ1 型受體（angiotension Ⅱ type 1 receptor,AT1）在Hcy 致病過(guò)程的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

21只6周齡雄性清潔級(jí)小鼠購(gòu)自北京維通利華公司，動(dòng)物合格證號(hào)：CNAS0004，C57BL/6L 為背景的載脂蛋白E 敲除（apolipoprotein E knocked out,ApoE-/-）小鼠于內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境溫度18～23℃，濕度50%～60%，保持室內(nèi)空氣新鮮，每只籠具7只小鼠，照明12 h，無(wú)污染飲水，所有飼料購(gòu)自北京科奧協(xié)力有限公司。小鼠背毛濃密有光澤，眼睛明亮活潑，行動(dòng)迅速，反應(yīng)靈敏，食欲良好，發(fā)育正常，體型豐滿。

1.2 動(dòng)物分組

將21只ApoE-/-小鼠稱重，按體重從輕到重編號(hào)1～21，按隨機(jī)數(shù)字表法進(jìn)行分組，分別為對(duì)照組（CTL組）、高同型半胱氨酸組（HHcy 組）、高同型半胱氨酸+替米沙坦（HHcy+TLM 組）[1.5%蛋氨酸+替米沙坦10 ng/（kg·d）灌胃]，每組7只，共飼養(yǎng)12周。3組均采用含21%豬油和0.15%膽固醇的高膽固醇飼料喂養(yǎng)。參考文獻(xiàn)[7-8]在飼料中加入1.5%蛋氨酸復(fù)制高同型半胱氨酸血癥模型，并采用替米沙坦10 mg/（kg·d）（勃林格殷格翰藥業(yè)有限公司）[9]+5 g/L 羧甲基纖維素的磷酸鹽緩沖液（PBS）[10]配制的混懸液灌胃，CTL 組和HHcy 組均給予5 g/L 羧甲纖維素液灌胃。

1.3 小鼠體重、血壓的檢測(cè)

從第7周（灌胃前）開(kāi)始，每周1 次規(guī)律測(cè)量小鼠體重，直至治療結(jié)束，記錄平均值；從第10周開(kāi)始用無(wú)創(chuàng) 鼠尾測(cè)壓儀（BP-300A，成都泰盟軟件公司，2014年）測(cè)量鼠尾動(dòng)脈血壓，每2周測(cè)量1 次，測(cè)量前將箱體加溫至36℃，鼠尾加熱后，保證動(dòng)物在清醒狀態(tài)及安靜環(huán)境中測(cè)量血壓，血壓重復(fù)測(cè)量3～5 次，取平均值，記錄收縮壓（SBP）值。

1.4 小鼠血清學(xué)指標(biāo)的檢測(cè)

飼養(yǎng)12周后，應(yīng)用2%戊巴比妥鈉注射液80 mg/kg 麻醉，摘眼球取血于1.5 ml 無(wú)菌EP 管，4℃、3 000 r/min 離心10 min，吸取上清液，儲(chǔ)存于-80℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩２捎萌詣?dòng)生化分析儀測(cè)量血脂，循環(huán)酶直接法檢測(cè)Hcy。

1.5 小鼠主動(dòng)脈硬化斑塊面積的檢測(cè)

解剖顯微鏡下剝離主動(dòng)脈弓，剝離周圍脂肪組織，用鑷子小心提起主動(dòng)脈弓，于無(wú)名動(dòng)脈分叉處剪斷，置于含有0.1 mmol/L PBS 的EP 管中，置于冰上，用手術(shù)刀在平行左右心耳連線下方1 mm 處將心臟下部切除，心臟上部進(jìn)行OCT 包埋，10 μm 厚度切片。顯微鏡下觀察，3 個(gè)主動(dòng)脈瓣同時(shí)出現(xiàn)的第1 張組織切片標(biāo)記為0，向上第2 張標(biāo)記為10，以此類推。從主動(dòng)脈0 點(diǎn)開(kāi)始每間隔100 μm 取1 張切片進(jìn)行斑塊的面積測(cè)量，共測(cè)量6 張，計(jì)算這6 張切片斑塊面積的均值，即為主動(dòng)脈根部斑塊的面積。切片后進(jìn)行油紅O 染色，用4 倍物鏡采集圖像后，用Image-Pro Plus 6.0 軟件測(cè)量油紅O 染色陽(yáng)性斑塊面積，并計(jì)算斑塊面積占血管管腔面積的百分比。

1.6 HE 和Masson 染色

HE 染色：將OCT 包埋的主動(dòng)脈根部組織以6 μm 厚度進(jìn)行切片；用10%中性甲醛固定1 min；1 mmol/L PBS 洗3 次，3 min/次，主要以浸泡的方式，防脫片；Weigert 鐵蘇木精染液3～5 min；流水（自來(lái)水）洗去蘇木精染液5～10 s；1%鹽酸乙醇分化1～3 s，自來(lái)水中返藍(lán)20 s；伊紅染色10～20 s；脫水、透明、中性樹(shù)膠封片。染色結(jié)果：細(xì)胞核藍(lán)染，細(xì)胞漿紅染。

Masson 染色（北京卡柏萊公司）：將厚度為5 μm 冷凍切片，用10%中性甲醛固定1 min；Weigert 鐵蘇木精染液3～5 min；1%鹽酸乙醇分化1～3 s，流水（自來(lái)水）洗3 min，至返藍(lán)；麗春紅品紅染液染色5 min；0.1%～0.3%乙酸溶液洗1 min；1%磷鉬酸液洗1 min；重復(fù)步驟0.1%～0.3%乙酸溶液洗1 min；直接放入苯胺藍(lán)染液1 min；重復(fù)步驟0.1%～0.3%乙酸溶液洗1 min；95%乙醇快速脫水，100%乙醇脫水3 次，5～10 s/次；二甲苯透明3 次，1～2 min/次；中性樹(shù)膠封片。染色結(jié)果：膠原纖維、細(xì)胞核藍(lán)染，肌肉、細(xì)胞漿紅染。

1.7 免疫組織化學(xué)SP 法

制備5 μm 冷凍切片，4%多聚甲醛固定15 min，PBS 沖洗3 次，每次5 min，吸水紙吸干載玻片上的殘余水分，按照試劑盒（SP0022）（北京博奧森公司）說(shuō)明書的步驟進(jìn)行操作，首先加3%過(guò)氧化氫溫孵育10 min，為減少內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性；采用A 液血清封閉15 min，分別加入抗巨噬細(xì)胞表面分子（mac-3）抗體（1∶100，AB13524）、抗IL-6 抗體（1∶100，AB7737）、抗MCP-1抗體（1∶100，AB7202）、MMP-9 抗體（1∶100，AB76003），DAB 顯色（購(gòu)自福州邁新公司），Leica 顯微鏡用4 倍物鏡采集圖像后，應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0 軟件計(jì)算斑塊內(nèi)平均光密度，平均光密度=積分光密度（IOD）/區(qū)域面積（Area）。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組小鼠血脂、Hcy、SBP、體重情況

3組小鼠甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、低密度 脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白（HDL-C）比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；3組小鼠Hcy 比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），HHcy 組較CTL 組高（P＜ 0.05）；治療前3組小鼠SBP、體重比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；治療后3組小鼠SBP、體重比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），治療后HHcy+TLM 組SBP、體重比HHcy 組低。見(jiàn)表1、2。

2.2 3組小鼠主動(dòng)脈根部斑塊面積占血管管腔面積百分比的比較

油紅O 染色陽(yáng)性斑塊面積占血管管腔面積的百分比，CTL 組為（18.72±1.96）%，HHcy 組為（22.17± 2.07）%，HHcy+TLM 組為（10.02±1.96）%，3組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=73.269，P=0.000）；HHcy 組油紅O 染色陽(yáng)性斑塊面積占血管管腔面積的百分比較CTL 組、HHcy+TLM 組大（P＜0.05）。見(jiàn)圖1、2。

表1 3組小鼠Hcy 和血脂指標(biāo)比較（n =7，±s）

表1 3組小鼠Hcy 和血脂指標(biāo)比較（n =7，±s）

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表2 3組小鼠SBP 及體重情況（n =7，±s）

表2 3組小鼠SBP 及體重情況（n =7，±s）

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圖1 3組小鼠主動(dòng)脈根部陰性斑塊面積（油紅O 染色×40）

圖2 3組小鼠主動(dòng)脈根部斑塊面積占血管管腔面積 百分比的比較（±s）

2.3 3組小鼠主動(dòng)脈根部斑塊穩(wěn)定性

HHcy 組可見(jiàn)纖維帽變薄，大量泡沫細(xì)胞，較大的脂質(zhì)/壞死核心，可見(jiàn)膽固醇結(jié)晶；HHcy+TLM 組纖維帽較厚，少許泡沫細(xì)胞，脂質(zhì)/壞死核心減小。見(jiàn)圖3。

2.4 3組小鼠炎癥因子表達(dá)

免疫組織化學(xué)SP 法結(jié)果顯示，HHcy 組斑塊內(nèi)mac-3、MCP-1、IL-6 的棕黃色顆粒沉積最多，半定量分析平均光密度值最高，HHcy+TLM 組炎癥因子的表達(dá)下降。mac-3 的值分別為：CTL 組（0.123±0.015）、HHcy 組（0.633±0.035）、HHcy+TLM 組（0.167±0.021），3組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=235.947，P=0.000），HHcy 組較CTL 組、HHcy+TLM 組多（P＜0.05）；MCP-1 的值分別為：CTL 組（0.150±0.021）、HHcy 組（0.637± 0.086）、HHcy+TLM 組（0.187±0.025），3組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=78.075，P=0.000），HHcy 組較CTL 組、HHcy+TLM 組多（P＜0.05）；IL-6 的值分別為：CTL 組（0.103±0.015）、HHcy 組（0.337±0.032）、HHcy+TLM組（0.167±0.021），3組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=77.08，P=0.000），HHcy 組較CTL 組、HHcy+TLM 組多（P＜0.05）。見(jiàn)圖4、5。

2.5 3組小鼠膠原蛋白分泌及MMP-9 的表達(dá)

Masson 染色結(jié)果顯示，HHcy+TLM 組與HHcy 組比較，藍(lán)染的膠原蛋白明顯增加（見(jiàn)圖6）。斑塊內(nèi)MMP-9 的表達(dá)水平分別為：CTL 組（0.237±0.021）、HHcy 組（0.393±0.031）、HHcy+TLM 組（0.187±0.015），3組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=65.396，P=0.000），HHcy 組較CTL 組、HHcy+TLM 組多（P＜0.05）。見(jiàn)圖7、8。

圖3 3組小鼠主動(dòng)脈根部斑塊形態(tài)觀察（HE 染色×200）

圖4 3組小鼠主動(dòng)脈根部斑塊內(nèi)mac-3、MCP-1、IL-6 的表達(dá)（DAB 染色×40）

圖5 3組小鼠主動(dòng)脈根部斑塊mac-3、MCP-1、IL-6 的平均光密度值比較（±s）

圖6 3組小鼠主動(dòng)脈根部斑塊內(nèi)膠原蛋白比較（Masson 染色×40）

圖7 3組小鼠主動(dòng)脈根部斑塊MMP-9 的表達(dá)（DAB 染色×40）

圖8 3組小鼠主動(dòng)脈根部斑塊內(nèi)MMP-9 水平比較（±s）

3 討論

動(dòng)脈粥樣硬化表現(xiàn)為動(dòng)脈壁粥樣斑塊形成，致使管腔狹窄，斑塊破裂時(shí)會(huì)導(dǎo)致急性心血管不良事件發(fā)生[11]；ApoE-/-給予蛋氨酸飲食誘導(dǎo)，可導(dǎo)致高同型半胱氨酸血癥，HHcy 除具有可引起內(nèi)皮損傷、平滑肌細(xì)胞凋亡、增加血小板聚集等致動(dòng)脈粥樣硬化形成的機(jī)制外，還有促動(dòng)脈粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定性的作用[12]。Hcy 可通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和腺苷酸活化蛋白激酶作用，上調(diào)腫瘤壞死因子-α 和MMP-9 的表達(dá)[13-14]，增加斑塊不穩(wěn)定性，但Hcy 結(jié)合受體并不清楚。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HHcy+TLM組血清中Hcy含量高于CTL組，但HHcy+TLM 組Hcy 含量較HHcy 組無(wú)明顯下降，一方面說(shuō)明模型復(fù)制成功，一方面說(shuō)明TLM 并不是直接通過(guò)降低Hcy 的含量來(lái)減輕動(dòng)脈粥樣硬化；HHcy 組主動(dòng)脈根部斑塊面積占血管管腔面積的百分比與CTL 組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。文中主動(dòng)脈根部HE 染色、免疫組織化學(xué)SP 法結(jié)果提示Hcy 不僅具有促動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成作用，而且使斑塊內(nèi)出現(xiàn)較大的脂質(zhì)壞死核心，巨噬細(xì)胞大量浸潤(rùn)，炎癥因子高表達(dá)，MMP-9分泌增加，細(xì)胞外基質(zhì)、膠原蛋白降解，纖維帽變薄，降低了斑塊的穩(wěn)定性，加速斑塊的進(jìn)展及破裂；應(yīng)用AT1 受體阻斷劑替米沙坦干預(yù)后，能夠逆轉(zhuǎn)HHcy 的這些作用，斑塊面積明顯減小、穩(wěn)定性增加，表明AT1 受體與Hcy 存在一定的聯(lián)系。

腎素血管緊張素系統(tǒng)在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生中具有重要作用，如細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化、遷移和凋亡、細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)、炎癥反應(yīng)等方面[15]，其中主要是通過(guò)血管緊張素Ⅱ與AT1 受體結(jié)合，在動(dòng)脈粥樣硬化的起始、進(jìn)展和并發(fā)癥發(fā)揮著多重生物活性作用。除血管緊張素Ⅱ之外，還有一些因素，如膜環(huán)境、機(jī)械拉伸、自身抗體相互作用等[16]亦可激活A(yù)T1 受體。

LIU 等[17]發(fā)現(xiàn)AT1 受體阻滯劑可消除高水平Hcy加重的腹主動(dòng)脈瘤，還發(fā)現(xiàn)Hcy 可直接激活A(yù)T1 受體，加重血管炎癥。本研究也證實(shí)，替米沙坦阻斷AT1 受體可減小高水平Hcy 致動(dòng)脈粥樣斑塊面積及促進(jìn)斑塊的穩(wěn)定，也進(jìn)一步證實(shí)Hcy 與AT1 受體有密切的關(guān)系。

同時(shí)發(fā)現(xiàn)HHcy+TLM 組治療后的SBP 較CTL 組和HHcy 組下降。學(xué)術(shù)界一直存在著一種爭(zhēng)議——降壓藥物在減輕動(dòng)脈粥樣硬化的作用中，是得益于降壓作用，還是其本身獨(dú)立于降壓因素之外而起的作用？本研究中HHcy+TLM 組的SBP 降低比較明顯，因此尚不能確定動(dòng)脈粥樣硬化的改善作用是否來(lái)源于替米沙坦的降壓作用，這需要進(jìn)一步探索研究。但目前已有文獻(xiàn)表明，Hcy 和血管緊張素Ⅱ在動(dòng)脈瘤的致病方面具有協(xié)同作用，Hcy 可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞AT1 受體的活化[17]，因此，可以認(rèn)為Hcy 的致病作用可能部分與AT1 受體相關(guān)。

Hcy 可通過(guò)拮抗過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisomal proliferators activate receptors,PPARγ），促進(jìn)脂肪的積累、導(dǎo)致代謝紊亂和血管重塑[18]；PPARγ 受體是脂肪代謝主要調(diào)節(jié)因子，在脂肪組織中高表達(dá)，血管緊張素受體阻滯劑亦有部分激活PPARγ受體的作用[19]，減少脂肪的堆積，可能是TLM 組體重下降的原因之一。本實(shí)驗(yàn)替米沙坦拮抗Hcy 在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊易損性的作用中，是否包含PPARγ 這一因素并不明確，也是本實(shí)驗(yàn)局限性所在，有待于下一步深入研究。

替米沙坦阻斷AT1 受體可減小高水平Hcy 致動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積，促進(jìn)斑塊的穩(wěn)定，表明Hcy 的致病機(jī)制與AT1 受體相關(guān)，本研究結(jié)果將Hcy 與腎素血管緊張素系統(tǒng)聯(lián)系在一起，豐富了動(dòng)脈粥樣硬化的理論，也豐富了Hcy 的致病機(jī)制理論。