新疆部分地區(qū)羊捻轉(zhuǎn)血矛線蟲系統(tǒng)進(jìn)化與抗藥性分析

肖培培，綺麗格爾，李澤華，張夢(mèng)圓，吾力江，李才善，張 楊

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，江蘇南京 210095）

捻轉(zhuǎn)血矛線蟲（Haemonchus contortus）屬于毛圓科、血矛屬，是一種分布廣泛的反芻動(dòng)物胃腸道寄生性線蟲，可引起捻轉(zhuǎn)血矛線蟲病[1]。感染反芻動(dòng)物的胃腸道線蟲主要是血矛線蟲，而捻轉(zhuǎn)血矛線蟲在同類感染性線蟲中對(duì)羊群的致病力最強(qiáng)。羔羊和青年羊?qū)δ磙D(zhuǎn)血矛線蟲較易感，感染后引起的發(fā)病率和死亡率最高，而成年羊?qū)δ磙D(zhuǎn)血矛線蟲的抵抗力較強(qiáng)，且感染后有“自愈”現(xiàn)象，即有蟲體排除或不發(fā)生再感染[2]。捻轉(zhuǎn)血矛線蟲在我國(guó)草地牧區(qū)普遍流行，可引起宿主消瘦、貧血等慢性消耗性癥狀，嚴(yán)重感染時(shí)可引起死亡，給我國(guó)畜牧業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。由于基層養(yǎng)殖人員常忽視寄生線蟲病的危害，缺乏基本的防控常識(shí)和驅(qū)蟲意識(shí)，從而錯(cuò)過(guò)了預(yù)防和治療該病的最佳時(shí)機(jī)。目前捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的防控仍以藥物防治為主，因而會(huì)出現(xiàn)抗藥性、環(huán)境污染、藥物殘留等問(wèn)題。而該病的免疫防控研究進(jìn)展緩慢，目前還沒(méi)有有效的疫苗用于實(shí)際生產(chǎn)[3-6]。

本研究對(duì)新疆博樂(lè)及塔城地區(qū)采集的羊皺胃內(nèi)的線蟲進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定及分子生物學(xué)檢測(cè)，對(duì)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲陽(yáng)性樣品進(jìn)行測(cè)序鑒定對(duì)比，繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，同時(shí)進(jìn)行多重序列比對(duì)，分析2個(gè)地區(qū)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲對(duì)苯并咪唑類藥物的敏感性，以期為今后制定更有效、更有針對(duì)性的防治措施提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品來(lái)源

2018年6—7月隨機(jī)采集新疆塔城和博樂(lè)地區(qū)的羊皺胃32個(gè)，其中塔城地區(qū)20個(gè)（綿羊18個(gè)、山羊2個(gè)），博樂(lè)地區(qū)12個(gè)（綿羊皺胃）。對(duì)采集的皺胃進(jìn)行處理并分離蟲體，并裝入EP管保存于實(shí)驗(yàn)室，-20 ℃待檢。

1.2 主要試劑

EasyPure Genomic DNA kit，購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；PCR擴(kuò)增試劑，購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；無(wú)水乙醇，購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.3 試驗(yàn)儀器

體視顯微鏡ST-39，購(gòu)自中國(guó)邁克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司；旋渦混合器QL-866，購(gòu)自上海圣科儀器設(shè)備有限公司；Gel Doc 2000紫外凝膠成像系統(tǒng)、PCR儀，購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；DK-600A型電熱恒溫水浴鍋，購(gòu)自上海一恒科學(xué)儀器有限公司；RADIAL20型臺(tái)式高速離心機(jī)，購(gòu)自西班牙ORTO ALRESA公司。

2 方法

2.1 蟲體采集

參照何添文等[7]的方法進(jìn)行。鏡檢蟲體形態(tài)后，將雌雄蟲體分開(kāi)保存于70%酒精中，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 DNA提取

按照 EasyPure Genomic DNA kit說(shuō)明書進(jìn)行，將提取的DNA置于-20 ℃保存。

2.3 PCR目的片段擴(kuò)增

PCR引物應(yīng)用薄新文[8]設(shè)計(jì)的引物合成。其引物主要根據(jù) GenBank 發(fā)表的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲β-微管蛋白（β-tubulin）基因組（登錄號(hào)X67489）的第三外顯子序列設(shè)計(jì)。上游引物P1：5'-CGT TCT GGA CCG TAT GGA CA-3'；下游引物P4：5'-ATG TTC ACG GCT AAC TTG CG-3'。引物由新疆昆泰銳生物技術(shù)有限公司引物合成。捻轉(zhuǎn)血矛線蟲PCR 反應(yīng)體系（25 μL）如下：2×EsTaqMaster Mix（Dye）13 μL，上游引物、下游引物、模板DNA各1 μL，9 μL滅菌雙蒸水補(bǔ)足體系。PCR 反應(yīng)條件如下：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 45 s（30個(gè)循環(huán)）；72 ℃ 延伸10 min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳（1%瓊脂糖）檢測(cè)后，通過(guò)瓊脂糖凝膠成像儀熒光成像觀察。

2.4 系統(tǒng)發(fā)育分析

選取博樂(lè)地區(qū)2個(gè)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲陽(yáng)性樣品（編號(hào)16、23），塔城地區(qū)4個(gè)樣品（編號(hào)1FTTacheng、4FTTacheng、4FHTacheng、21FHTacheng）進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果用BLAST進(jìn)行相似性檢索；選取與捻轉(zhuǎn)血矛線蟲同科、不同屬的環(huán)紋背帶線蟲（登錄號(hào)分別為KF483653.1、KF483647.1、KP204098.1、KP204100.1）以及不同科、不同屬的羊仰口線蟲（登錄號(hào)為KP792295.1），應(yīng)用 MEGA6.0軟件，以所選擇的18種線蟲的β-tubulin基因?yàn)榘袠?biāo)（表1），以最大似然法構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，并計(jì)算遺傳距離進(jìn)行分析；同時(shí)，對(duì)所選擇的同科同種的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲序列與測(cè)定序列進(jìn)行序列比對(duì)分析。

2.5 抗性分析

對(duì)確定為捻轉(zhuǎn)血矛線蟲β-tubulin基因的6個(gè)序列（16、23、1FTTacheng、4FTTacheng、4FHTacheng、21FHTacheng）與抗苯丙咪唑標(biāo)準(zhǔn)序列（登錄號(hào)X67489.1），采用序列分析軟件ESPript 3和CLUSTALW進(jìn)行多序列比對(duì)，分析博樂(lè)和塔城地區(qū)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲抗苯并咪唑類藥物的抗性。

3 結(jié)果

3.1 蟲體收集

在塔城地區(qū)收集的20個(gè)羊皺胃中，從14個(gè)羊皺胃內(nèi)發(fā)現(xiàn)寄生性線蟲，共采集到85只蟲體；在博樂(lè)地區(qū)收集的12個(gè)羊皺胃中，從7個(gè)羊皺胃內(nèi)發(fā)現(xiàn)寄生性線蟲，共采集到210只蟲體。

表1 捻轉(zhuǎn)血矛線蟲及其他線蟲β-微管蛋白基因

3.2 病原鑒定

將形態(tài)學(xué)鑒定初步鑒定為捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的蟲體提取DNA后，通過(guò)PCR檢測(cè)。電泳結(jié)果顯示，基因片段大小約798 bp，與預(yù)期結(jié)果一致（圖1）。最終確定：塔城地區(qū)分離到的85只蟲體中，有27只為捻轉(zhuǎn)血矛線蟲；在博樂(lè)地區(qū)分離到的210只蟲體中，有55只為捻轉(zhuǎn)血矛線蟲。

3.3 遺傳進(jìn)化分析

測(cè)序所得序列與從GenBank下載序列進(jìn)行比對(duì)，運(yùn)用最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖2）并計(jì)算遺傳距離（圖3）。

圖1 部分樣品的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲PCR檢測(cè)結(jié)果

圖2 運(yùn)用最大似然法構(gòu)建的β-tubulin基因核苷酸序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

將博樂(lè)地區(qū)（16、23）和塔城地區(qū)（1FTTacheng、4FTTacheng、4FHTacheng、21FHTacheng）測(cè)序獲得的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲β-tubulin 基因序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，選取不同捻轉(zhuǎn)血矛線蟲β-tubulin 基因序列（登錄號(hào)分別為KX246658.1、KX246651.1、KX246666.1、KJ410522.1、KJ410523.1、KX246667.1、KX246668.1），同科、不同屬的環(huán)紋背帶線蟲（登錄號(hào)分別為KF483653.1、KF483647.1、KP204098.1、KP204100.1） 以及不同科、不同屬的羊仰口線蟲（登錄號(hào)為KP792295.1），應(yīng)用MEGA6.0軟件構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。結(jié)果表明，本試驗(yàn)所測(cè)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲序列與GenBank上發(fā)表的相應(yīng)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲蟲株序列聚為一支，置信度為100%，與捻轉(zhuǎn)血矛線蟲同科、不同屬的環(huán)紋背帶線蟲蟲株序列相聚類，置信度為100%，其外群為不同科、不同屬的羊仰口線蟲，登錄號(hào)為KP792295.1，內(nèi)群與外群分別形成獨(dú)立的進(jìn)化分支。

圖3 捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的遺傳距離矩陣

用MEGA6.0軟件計(jì)算的遺傳距離矩陣顯示：環(huán)紋背帶線蟲的種間距離為0～0.059，捻轉(zhuǎn)血矛線蟲為0～0.082，1FTTacheng為0.009～0.080，4FHTTacheng為0.05～0.061，4FHTacheng為0.021～0.080，16Bole為0.012～0.074，23Bole為0.033～0.065。本試驗(yàn)測(cè)定的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲遺傳距離均在捻轉(zhuǎn)血矛線蟲種間距離內(nèi)，說(shuō)明為同種，同時(shí)也說(shuō)明毛圓科的β-tubulin基因種間遺傳距離為0～0.082。

3.4 序列比較分析

將進(jìn)化樹(shù)中從GenBank上下載的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲β-tubulin基因序列與本研究測(cè)定的序列進(jìn)行排序比對(duì)，發(fā)現(xiàn)相似度為96.86%，有89個(gè)變異位點(diǎn)（圖4），其中KJ410522.1與KJ410523.1，KX246658.1與KX246651.1的 G、A、T、C含量相同。本研究測(cè)定序列4FHTacheng的G和C含量低于其他捻轉(zhuǎn)血矛線蟲序列，其他測(cè)定序列在G、A、T、C含量上無(wú)明顯差異（表2）。

從13種捻轉(zhuǎn)血矛線蟲β-tubulin基因序列堿基分布表中可看出，G基因堿基分布平均在21%左右，A基因在27%左右，T基因在30%左右，C基因在21%左右，說(shuō)明堿基在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中出現(xiàn)了顛倒轉(zhuǎn)換、缺失、突變等變化。整體上看，G+C的含量小于A+T的含量，說(shuō)明出現(xiàn)了堿基偏移。

3.5 抗藥性分析

經(jīng)多序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，與突變株相比，所采集的6個(gè)樣品的第200位氨基酸殘基密碼子為TTC（苯丙氨酸），而突變株為TAC（酪氨酸），說(shuō)明采集的這6個(gè)樣品為敏感型（圖5）。

4 討論

圖4 捻轉(zhuǎn)血矛線蟲β-tubulin基因序列比對(duì)結(jié)果

表2 13種捻轉(zhuǎn)血矛線蟲β-tubulin基因序列堿基分布%

圖5 博樂(lè)地區(qū)、塔城地區(qū)及突變株β-tubulin基因多序列比對(duì)結(jié)果

捻轉(zhuǎn)血矛線蟲作為一種腸道寄生線蟲廣泛流行于世界各地。國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)全國(guó)各地捻轉(zhuǎn)血矛線蟲感染情況的調(diào)查結(jié)果顯示，不同地區(qū)感染率差異較大，為12.5%～100%。我國(guó)新疆地區(qū)地域遼闊，牧草資源豐富，養(yǎng)羊業(yè)多采用散養(yǎng)放牧的養(yǎng)殖方式。與圈養(yǎng)相比，放牧環(huán)境下的羊接觸污染草料和土地的概率明顯增高，因此感染寄生蟲的概率更高。本次試驗(yàn)結(jié)果顯示，博樂(lè)地區(qū)共發(fā)現(xiàn)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲55只，塔城地區(qū)發(fā)現(xiàn)27只，感染情況并不太高。這可能是因?yàn)楸敬瘟餍胁W(xué)調(diào)查采集樣品的時(shí)間為6—7月，屬于夏季。而捻轉(zhuǎn)血矛線蟲感染一般在春季和秋季較嚴(yán)重，這兩個(gè)季節(jié)氣候條件相對(duì)適宜，非常適合寄生蟲生長(zhǎng)繁殖，因而感染率相對(duì)較高。

近年來(lái)，基因分類學(xué)以及進(jìn)化分析手段已應(yīng)用于寄生蟲生態(tài)學(xué)、流行病學(xué)以及進(jìn)化相關(guān)研究中，為更好地掌握寄生蟲進(jìn)化特征提供了技術(shù)支持。特異性分子鑒定對(duì)于正確鑒別寄生蟲種類、遷移及進(jìn)化來(lái)說(shuō)非常有效，而基因特征分析對(duì)更精確診斷寄生蟲病以及制定更合理的防控措施十分重要。

β-tubulin基因是細(xì)胞內(nèi)微管的基本結(jié)構(gòu)單位。微管蛋白對(duì)于保持細(xì)胞形狀、運(yùn)動(dòng)、胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸起到了不可或缺的作用。β-tubulin與毛圓科寄生線蟲的治療藥物——苯并咪唑類藥物（BZ）的藥理作用發(fā)揮有關(guān)。藥物選擇性地與蟲體細(xì)胞內(nèi)的微管蛋白結(jié)合，通過(guò)干擾微管蛋白變化，影響微管和微管蛋白之間的自由集合，從而抑制蟲體內(nèi)微管的組裝而發(fā)揮作用[9-10]。

本次試驗(yàn)將陽(yáng)性樣品篩選后進(jìn)行測(cè)序，應(yīng)用MEGA6.0軟件構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，將測(cè)序結(jié)果在NCBI中用BLAST進(jìn)行相似性檢索，與GenBank登錄號(hào)分別為KX246658.1（761 bp）、KX246651.1（760 bp）、KX246666.1（760 bp）、KJ410522.1（813 bp）、KJ410523.1（813 bp）、KX246667.1（767 bp）、KX246668.1（767 bp）的核苷酸相似性分別為94.13%、94.13%、95.68%、99.47%、99.74%、98.20%、97.79%。結(jié)果表明，所測(cè)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲序列與GenBank上發(fā)表的相應(yīng)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲蟲株序列聚為一支，置信度為100%，與捻轉(zhuǎn)血矛線蟲同科、不同屬的環(huán)紋背帶線蟲蟲株序列相聚類，置信度為100%，其外群為不同科、不同屬的羊仰口線蟲，登錄號(hào)為KP792295.1，內(nèi)群與外群分別形成獨(dú)立的進(jìn)化分支。

苯丙咪唑類藥物是防治消化道線蟲的主流藥物之一，在我國(guó)使用年限長(zhǎng)。在國(guó)外，已有較全面的報(bào)道，表明捻轉(zhuǎn)血矛線蟲已出現(xiàn)苯并咪唑類抗藥性蟲株。而國(guó)內(nèi)，相關(guān)的報(bào)道卻不多見(jiàn)。本次試驗(yàn)對(duì)選取的博樂(lè)和塔城地區(qū)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲樣品進(jìn)行多序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，與抗性蟲株序列相比，博樂(lè)和塔城地區(qū)樣品的第200位氨基酸均未發(fā)現(xiàn)突變，說(shuō)明選取的樣品是對(duì)苯并咪唑類藥物敏感的。

本研究有助于新疆開(kāi)展線蟲病的綜合防控，也為制定更合理的線蟲防控方案提供了參考，并為寄生蟲系統(tǒng)進(jìn)化分析研究奠定了基礎(chǔ)。