衢枳殼提取物改善2 型糖尿病db/db 模型小鼠腎臟氧化損傷的作用研究

鄭 慧 王思為 鐘松陽 樓麗君

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是2 型糖尿病最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，發(fā)病率20%～40%[1]。研究表明，DN 已成為導(dǎo)致終末期腎臟病的重要因素，并會引起多器官衰竭和死亡[2]。DN 的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前尚缺乏有效的治療方法。衢枳殼，即常山胡柚片，是蕓香科植物常山胡柚Citrus changshan huyou Y.B.Chang 的干燥未成熟果實的加工品[3]。本研究組前期研究表明，衢枳殼的主要成分為柚皮苷、新橙皮苷等黃酮類化合物，具有抗炎、降糖等多種藥理學(xué)活性[3-4]。本研究擬通過2 型糖尿病db/db 模型小鼠觀察衢枳殼提取物對其腎臟的保護(hù)作用并探討可能的機(jī)制，報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物 雄性自發(fā)性2 型糖尿病C57BLKS/J db/db 模型小鼠，Stock No:000642，7～8 周齡，體質(zhì)量30～40g；同遺傳背景C57BLKS/J db 野生型小鼠（db/m），7～8 周齡，體質(zhì)量18～22g，以上動物購自南京大學(xué)—南京生物醫(yī)藥研究院，動物生產(chǎn)許可證號：SYXK（蘇）2015-0001。飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，自由攝食及飲水。動物實驗經(jīng)浙江省衢州市人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)。

1.2 藥物及制備 衢枳殼飲片購自衢州南孔中藥有限公司。衢枳殼提取物（Quzhou Fructus Aurantii extract，QFAE）制備：稱取衢枳殼飲片1kg 凈制，粉碎，加15 倍量的80%乙醇（15000mL），浸泡1h，加熱回流提取3 次，每次2h，合并提取液，冷卻過濾，濾液回收溶劑，冷凍干燥，即得QFAE。所得QFAE 中黃酮類化合物的含量≥50%。

1.3 主要試劑及儀器 血糖試紙，購自美國強(qiáng)生，批號Lot4 525469；肌酐（Cr）檢測試劑盒（批號20181207）、尿素氮（BUN）檢測試劑盒（批號20181207）、超氧化物歧化酶（SOD）檢測試劑盒（批號20190428）、過氧化氫酶（CAT）檢測試劑盒（批號20190428）和還原型谷胱甘肽（GSH）檢測試劑盒（批號20190428），均購自南京建成生物工程研究所；Trizol 試劑（美國Invitrogen，批號Lot△S7130）；cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Thermo Fisher，批號Lot：00742498）；SYBR Green 試劑盒（上海生工，批號F708KA2311）。7020 全自動生化分析儀，日本日立；高速冷凍離心機(jī)，美國Thermo；LC480 熒光定量PCR儀，美國羅氏。

1.4 動物分組及給藥 24 只C57BLKS/J db/db 雄性小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組，QFAE 低、高劑量組，每組8 只。另取8 只C57BLKS/J db 野生型小鼠作為對照組。對照組和模型組小鼠每天以蒸餾水灌胃，QFAE 低、高劑量組小鼠每天按QFAE 100、300mg/kg 劑量灌胃，連續(xù)喂養(yǎng)7 周，每周記錄小鼠體質(zhì)量和血糖情況。末次給藥24h 后處死小鼠，收集血清、腎臟。

1.5 檢測指標(biāo)

1.5.1 生化指標(biāo)測定 全自動生化儀上測定各組小鼠血清Cr 和BUN 水平；取小鼠腎臟勻漿，根據(jù)試劑盒操作要求，檢測腎組織勻漿氧化應(yīng)激指標(biāo)SOD、CAT 和GSH 的活性。

1.5.2 腎組織病理學(xué)觀察 取各組小鼠一部分腎臟組織，用10%福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色，400 倍顯微鏡下觀察。

1.5.3 RT-PCR 檢測 采用Trizol 法提取各組小鼠腎臟RNA，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。按照SYBR Green 熒光染料法進(jìn)行定量PCR 測定，引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成，引物序列如下：Gclm 上游序列5'-CTTCGCCTCCGATTGAAGATG-3'，下游序列5'-AAAGGCAGTCAAATCTGGTGG-3'；Nqo1 上游序列5'-AGGATGGGAGGTACTCGAATC-3'，下游序列5'-TGCTAGAGATGACTCGGAAGG-3'；Gclc 上游序列5'-CTACCACGCAGTCAAGGACC-3'，下游序列5'-CCTCCATTCAGTAACAACTGGAC-3'；GAPDH 上游序列5'-TGAGGCCGGTGCTGAGTATGT-3'，下游序列5'-CAGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3'。PCR 反應(yīng)條件：95℃30s 1 循環(huán)，95℃5s 40 循環(huán)，60℃31s 40 循環(huán)，采用2-ΔΔCt 法進(jìn)行半定量分析。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間差異按方差分析進(jìn)行檢驗，并用最小顯著差法檢驗作兩兩比較，以P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 QFAE 對db/db 模型小鼠血糖、體質(zhì)量和腎質(zhì)量的影響 與對照組比較，模型組小鼠血糖、體質(zhì)量和腎質(zhì)量顯著增高（P 均<0.05）；與模型組比較，QFAE低、高劑量組小鼠血糖、體質(zhì)量無明顯變化（P＞0.05），但腎質(zhì)量顯著低于模型組（P 均＜0.01），見表1。

表1 各組小鼠血糖、體質(zhì)量和腎質(zhì)量比較（）

表1 各組小鼠血糖、體質(zhì)量和腎質(zhì)量比較（）

注：對照組予蒸餾水灌胃；模型組予蒸餾水灌胃；QFAE 低劑量組予100mg/kg 劑量QFAE 灌胃；QFAE 高劑量組予300mg/kg 劑量QFAE灌胃；QFAE 為衢枳殼提取物；與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.01

2.2 QFAE 對db/db 模型小鼠血清Cr 和BUN 水平的影響 與對照組比較，模型組小鼠血清Cr 和BUN水平顯著升高（P 均＜0.05）；與模型組比較，QFAE低、高劑量組小鼠血清Cr 和BUN 水平顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），見表2。

2.3 QFAE 對db/db 模型小鼠腎組織病理學(xué)的影響對照組小鼠腎組織結(jié)構(gòu)完整，無明顯組織病理學(xué)改變；模型組小鼠腎小球出現(xiàn)萎縮和碎裂，腎小管變性和壞死；QFAE 喂養(yǎng)能一定程度改善以上病理學(xué)變化，尤其高劑量效果顯著。見圖1。

表2 各組小鼠血清Cr 和BUN 水平比較（）

表2 各組小鼠血清Cr 和BUN 水平比較（）

注：對照組予蒸餾水灌胃；模型組予蒸餾水灌胃；QFAE 低劑量組予100mg/kg 劑量QFAE 灌胃；QFAE 高劑量組予300mg/kg 劑量QFAE灌胃；Cr 為肌酐；BUN 為血清尿素氮；QFAE 為衢枳殼提取物；與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05，bbP＜0.01

圖1 各組小鼠腎組織病理學(xué)改變（HE 染色×400）

2.4 QFAE 對db/db 模型小鼠腎組織SOD、GSH 和CAT 活性的影響 與對照組比較，模型組小鼠腎組織SOD、GSH 和CAT 活性顯著降低（P 均＜0.05）；與模型組比較，QFAE 低、高劑量組小鼠腎組織SOD、GSH 和CAT 活性顯著增加（P＜0.05 或P＜0.01）。見表3。

表3 各組小鼠腎組織SOD、GSH 和CAT 活性比較（）

表3 各組小鼠腎組織SOD、GSH 和CAT 活性比較（）

注：對照組予蒸餾水灌胃；模型組予蒸餾水灌胃；QFAE 低劑量組予100mg/kg 劑量QFAE 灌胃；QFAE 高劑量組予300mg/kg 劑量QFAE灌胃；QFAE 為衢枳殼提取物；SOD 為超氧化物歧化酶；CAT 為過氧化氫酶；GSH 為還原型谷胱甘肽；與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05，bbP＜0.01

2.5 QFAE 對db/db 模型小鼠腎組織抗氧化基因Gclm、Nqo1 和Gclc 表達(dá)的影響 RT-PCR 結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組小鼠腎臟抗氧化基因Gclm、Nqo1 和Gclc mRNA 表達(dá)降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與模型組比較，QFAE 低、高劑量組小鼠腎組織Gclm、Nqo1 和Gclc mRNA 表達(dá)顯著升高（P＜0.05，P＜0.01），見表4。

3 討論

DN 特征主要包括細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）蛋白的積累和不可逆轉(zhuǎn)的腎功能下降[5]。血清Cr 和BUN 水平反應(yīng)腎小球濾過率，DN 會引起血清Cr 和BUN 水平升高。本研究結(jié)果顯示，與db/m 模型小鼠比較，db/db小鼠血Cr 和BUN 水平顯著升高，且小鼠腎臟出現(xiàn)一定程度的病理學(xué)改變。然而，給予不同劑量QFAE后，db/db 模型小鼠SCr 和BUN 水平降低，且腎臟組織的病理損傷緩解，提示QFAE 對db/db 模型小鼠腎損傷具有一定改善作用。

表4 各組小鼠腎組織抗氧化基因Gclm、Nqo1和Gclc mRNA 表達(dá)量比較（）

表4 各組小鼠腎組織抗氧化基因Gclm、Nqo1和Gclc mRNA 表達(dá)量比較（）

注：對照組予蒸餾水灌胃；模型組予蒸餾水灌胃；QFAE 低劑量組予100mg/kg 劑量QFAE 灌胃；QFAE 高劑量組予300mg/kg 劑量QFAE灌胃；Gclm 為谷氨酸-半胱氨酸修飾亞基；Nqo1 為醌氧化還原酶1；Gclc 為谷氨酸-半胱氨酸連接酶催化亞基；QFAE 為衢枳殼提取物；與模型組比較，aP＜0.05，aaP＜0.01

氧化應(yīng)激被認(rèn)為是DN 發(fā)生與發(fā)展的重要機(jī)制之一。有研究認(rèn)為，2 型糖尿病腎病與機(jī)體氧化損傷及抗氧化防御系統(tǒng)失衡有關(guān)[6-7]。正常生理條件下，機(jī)體內(nèi)自由基、過氧化脂質(zhì)和抗氧化酶之間保持動態(tài)平衡。然而，當(dāng)組織和細(xì)胞受到外界環(huán)境不利因素刺激（例如高糖高脂環(huán)境），會導(dǎo)致機(jī)體氧化-還原體系平衡被打破，引起一些抗氧化酶（如SOD、CAT 和GSH 等）活性降低，從而導(dǎo)致組織和細(xì)胞氧化損傷[6-7]。藥理研究表明，QFAE 的主要成分柚皮苷、新橙皮苷等均具有較強(qiáng)的抗氧化作用[8]。因此，我們認(rèn)為QFAE可能具有提高db/db 模型小鼠腎臟抗氧化能力的作用。結(jié)果顯示，與對照組比較，db/db 模型小鼠腎組織抗氧化酶SOD、CAT 和GSH 活性顯著降低，而QFAE能夠顯著提高db/db 小鼠腎組織抗氧化酶SOD、CAT和GSH 活性，減輕腎臟氧化損傷。

Nqo1、Gclc、Gclm 等是參與維持組織、細(xì)胞氧化-還原平衡體系的重要基因[9]。研究顯示，Nqo1、Gclc、Gclm 能夠通過提高SOD、CAT 和GSH 等酶活性，加速自由基的清除，從而抑制細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)，緩解細(xì)胞氧化損傷[10]。本研究結(jié)果顯示，QFAE 能夠顯著提高小鼠腎組織抗氧化基因Gclm、Nqo1、Gclc mRNA 表達(dá)，提示促進(jìn)腎組織抗氧化基因表達(dá)可能是QFAE 改善db/db 模型小鼠腎臟氧化損傷的主要機(jī)制之一。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，QFAE 具有改善2型糖尿病db/db 模型小鼠腎功能，緩解腎損傷的作用，其機(jī)制主要與促進(jìn)抗氧化基因表達(dá)，提高腎組織抗氧化能力有關(guān)。