膝骨性關節(jié)炎者TLR-4、IL-1β的表達變化及臨床意義

毛洪剛 朱艷麗 劉巖 劉國棟 張飛

[摘要] 目的 探討膝骨性關節(jié)炎（KOA）患者血清、膝關節(jié)液中Toll樣受體-4（TLR-4）、白細胞介素-1β（IL-1β）的表達變化及臨床意義。 方法 選擇2017年6月～2018年12月內(nèi)蒙古醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院（以下簡稱“我院”）骨科門診收治的KOA患者220例作為觀察組，根據(jù)KOA的嚴重程度，將其分為輕度亞組（n = 98）、中度亞組（n = 80）和重度亞組（n = 42），另外選取我院健康中心體檢志愿者60名作為對照組。酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測血清和關節(jié)液中TLR-4和IL-1β水平，分析TLR-4和IL-1β水平與KOA嚴重程度及兩者之間的相關性。 結(jié)果 觀察組血清及關節(jié)液中TLR-4和IL-1β水平均明顯高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P < 0.05）。重度亞組血清及關節(jié)液中TLR-4和IL-1β水平高于輕度亞組和中度亞組，中度亞組血清及關節(jié)液TLR-4和IL-1β水平高于輕度亞組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P < 0.05）。血清和關節(jié)液TLR-4和IL-1β水平與KOA的嚴重程度呈正相關（r = 0.706、0.729、0.741、0.715，均P < 0.05）;血清TLR-4水平與IL-1β水平呈正相關（r = 0.720，P < 0.05）;關節(jié)液TLR-4水平與IL-1β水平呈正相關（r = 0.736，P < 0.05）。 結(jié)論 KOA患者血清和關節(jié)液中TLR-4和IL-1β水平異常升高，且與KOA的嚴重程度聯(lián)系密切，可以用于臨床上KOA的預測、診斷及治療。

[關鍵詞] 膝骨性關節(jié)炎;血清;膝關節(jié)液;Toll樣受體-4;白細胞介素-1β;相關性

[中圖分類號] R684.3????????? [文獻標識碼] A????????? [文章編號] 1673-7210（2020）01（c）-0082-04

Expression changes and clinical significance of TLR-4 and IL-1β in serum and knee joint fluid of patients with knee osteoarthritis

MAO Honggang1?? ZHU Yanli2?? LIU Yan1?? LIU Guodong1?? ZHANG Fei1

1.Department of Orthopedics， the Third Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University （Inner Mongolia Baogang Hospital）， Inner Mongolia Autonomous Region， Baotou?? 014010， China; 2.Department of Anesthesiology， the Second Affiliated Hospital of Baotou Medical College， Inner Mongolia University of Science and Technology， Inner Mongolia Autonomous Region， Baotou?? 014030， China

[Abstract] Objective To investigate the expression changes and clinical significance of Toll-like receptor-4 （TLR-4） and interleukin-1β （IL-1β） in serum and knee joint fluid of patients with knee osteoarthritis （KOA）. Methods From June 2017 to December 2018， 220 cases with KOA who admitted in Department of Orthopedics， the Third Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University （“our hospital” for short） were selected as observation group. According to the severity of KOA， they were divided into mild subgroup （n = 98）， moderate subgroup （n = 80） and severe subgroup （n = 42）. In addition， 60 cases of volunteers were selected for physical examination in our hospital of health center medical as control group. The levels of TLR-4 and IL-1β in serum and knee joint fluid were detected by enzyme-linked immunosorbent assay. The correlation between TLR-4， IL-1β levels and KOA severity were analyzed and their correlation were analyzed. Results The levels of TLR-4 and IL-1β in serum and knee joint fluid of observation group were significantly higher than those of control group， and the differences were statistically significant （all P < 0.05）. The levels of TLR-4 and IL-1β in severe subgroup were significantly increased than those of moderate subgroup and mild subgroup， compared with mild subgroup， the levels of TLR-4 and IL-1β in moderate subgroup were significantly increased， and the differences were statistically significant （all P < 0.05）. Serum and knee joint fluid TLR-4 and IL-1β levels were positively correlated with KOA severity （r = 0.706， 0.729， 0.741， 0.715， all P < 0.05）. Serum TLR-4 level was positively correlated with IL-1β level （r = 0.720， P < 0.05）. The level of TLR-4 in knee joint fluid was positively correlated with IL-1 level （r = 0.736， P < 0.05）. Conclusion The levels of TLR-4 and IL-1β in serum and knee joint fluid of KOA patients unusually increase， which is closely related with the severity of KOA. It can be used for clinical prediction， diagnosis and treatment of KOA.

[Key words] Knee osteoarthritis; Serum; Knee joint fluid; Toll-like receptor-4; Interleukin-1β; Correlation

骨性關節(jié)炎（osteoarthritis，OA）的實質(zhì)是關節(jié)軟骨退行性變化，關節(jié)活動受限，嚴重影響生活質(zhì)量，且該病多發(fā)生于中老年人群。而膝骨性關節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）占OA所有類型的78.5%[1-2]。KOA是臨床常見的慢性炎癥性疾病之一，臨床主要特征為關節(jié)軟骨退行性變化、骨質(zhì)增生，同時伴隨骨滑膜炎癥。另外，KOA患者的膝關節(jié)可出現(xiàn)疼痛、關節(jié)畸形等[3-5]。隨著我國人口老齡化速度的加快，KOA已經(jīng)成為導致中老年人群致殘的重要因素，但其診斷缺乏有效的生化指標，若不能對早期KOA進行診斷，則會喪失有效的治療時機[6]。

KOA的發(fā)病機制尚未明確，同時缺乏有效的治療藥物，因此尋找其致病機制，并進行有效的治療成為研究重點。人們一直認為KOA的發(fā)生與多種細胞因子的關系密切，如白細胞介素（IL）家族，從分子水平揭示組織細胞的變化機制。近年來，隨著生物分子學技術的發(fā)展，逐漸發(fā)現(xiàn)Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）家族對于非特異性免疫的調(diào)節(jié)功能具有重要作用，同時也可以將特異性免疫和非特異性免疫連接起來[7]。TLR-4和IL-1β胞漿區(qū)同源性較高，并且兩者與KOA的關系緊密，兩者可能共同參與KOA的病變過程[8-9]。這為臨床上探索KOA的具體致病機制提供思路。本研究通過檢測血清及膝關節(jié)液中TLR-4和IL-1β水平及其相關性，為尋找KOA致病機制和治療途徑提供理論基礎。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2017年6月～2018年12月內(nèi)蒙古醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院（以下簡稱“我院”）骨科收治的KOA患者220例，作為觀察組，其中男104例，女116例;年齡50～75歲，平均（62.26±5.15）歲;體重指數(shù)19.25～23.12 kg/m2，平均（21.25±1.36）kg/m2;病程2～6年，平均（3.76±1.02）年。根據(jù)KOA的嚴重程度[10]，將其分為輕度亞組98例，中度亞組80例，重度亞組42名。另外選擇于我院健康中心體檢的志愿者60例，作為對照組，其中男26名，女34名;年齡48～77歲，平均（61.35±4.26）歲;體重指數(shù)19.10～22.89 kg/m2，平均（21.07±1.17）kg/m2。兩組基本資料比較，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05），具有可比性。本研究經(jīng)我院醫(yī)學倫理委員會批準。

納入標準：①符合KOA診斷標準[11];②患者的臨床資料完整，且依從性高;③患者及其家屬同意，并簽署知情同意書。排除標準：①伴有高血壓、冠心病等其他慢性疾病;②患者有膝關節(jié)手術史及感染史;③伴有類風濕性關節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等免疫性疾病;④入組前半個月使用糖皮質(zhì)激素等藥物。

1.2 疾病診斷標準

所有患者均符合中華醫(yī)學會骨科分會2007版OA診療中關于KOA的標準[11]：①1個月內(nèi)膝關節(jié)疼痛現(xiàn)象反復出現(xiàn);②膝關節(jié)X線掃描結(jié)果顯示關節(jié)腔變窄，有關節(jié)緣骨贅形成;③關節(jié)液清亮且黏稠，白細胞數(shù)量<2×106個/L;④年齡>40歲，膝關節(jié)僵硬時間<30 min，且活動時出現(xiàn)骨摩擦音?；颊叻息俸廷?，①、③和④，①～④均可診斷為KOA。

應用關節(jié)鏡對軟骨損傷程度進行評級[10]：①Ⅰ度，關節(jié)表面出現(xiàn)定都腫脹;②Ⅱ度，關節(jié)表面有直徑<1 cm的毛糙和淺表潰瘍、纖維化;③Ⅲ度，關節(jié)表面有直徑>1 cm的深度潰瘍，但軟骨下骨并未暴露;④Ⅳ度，軟骨下骨暴露。

使用X線對軟骨損傷進行診斷[6]：①Ⅰ級，關節(jié)腔無變化，出現(xiàn)微小骨贅;②Ⅱ級，關節(jié)腔輕度變窄，且出現(xiàn)輕度骨贅;③Ⅲ級，關節(jié)腔顯著變窄，出現(xiàn)中度骨贅;④Ⅳ級，關節(jié)腔顯著變窄，并出現(xiàn)大量的重度骨贅。

1.3 KOA分級標準

輕度亞組：軟骨損傷為Ⅰ度且Kellgren-Lawrence（K-L）分級為0～Ⅰ級;中度亞組：軟骨損傷為Ⅱ～Ⅲ度和/或K-L分級為Ⅱ級;重度亞組：軟骨損傷為Ⅳ度和/或K-L分級為Ⅲ～Ⅳ級。

1.4 方法

受試者均抽取空腹外肘靜脈血3 mL，靜置20 min后，3500 r/min離心10 min，離心半徑為4 cm，取上清液，置于-80℃冰箱中待測。受試者取坐位，局部麻醉后，抽取關節(jié)液2 mL，置Eppendorf管中，-80℃冰箱中待測。酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測血清和關節(jié)液中TLR-4（批號：170427）和IL-1β（批號：170316）水平，試劑盒由美國R&D公司生產(chǎn)，嚴格按照試劑盒上的說明進行操作。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，血清及關節(jié)液中TLR-4和IL-1β水平用均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗，兩組間比較采用t檢驗;血清及關節(jié)液中TLR-4和IL-1β水平與KOA嚴重程度及兩者之間的相關性采用Pearson或Spearman相關性分析。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清及關節(jié)液中TLR-4和IL-1β水平比較

觀察組血清及關節(jié)液中TLR-4和IL-1β水平均高與對照組，差異有統(tǒng)計學意義（均P < 0.05）。見表1。

2.2 不同程度KOA亞組血清及關節(jié)液中TLR-4和IL-1β水平比較

重度亞組血清及關節(jié)液中TLR-4和IL-1β水平高于輕度亞組和中度亞組，中度亞組血清及關節(jié)液中TLR-4和IL-1β水平高于輕度亞組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P < 0.05）。見表2。

2.3 Spearman相關性結(jié)果

血清和關節(jié)液TLR-4和IL-1β水平與KOA嚴重程度呈正相關（r = 0.706、0.729、0.741、0.715，均P < 0.05）。

2.4 Pearson相關性結(jié)果

血清TLR-4水平與IL-1β水平呈正相關（r = 0.720，P < 0.05）;關節(jié)液TLR-4水平與IL-1β水平呈正相關（r = 0.736，P < 0.05）。

3 討論

目前對于KOA的治療缺少有效的治療方法，KOA患者的組織細胞受到多種損傷因素的刺激，致使組織細胞發(fā)生變性，甚至壞死;而機體則會產(chǎn)生一系列的應激反應，減輕損傷程度[1]。有研究報道顯示[12]，導致KOA的原因有外傷、年齡、免疫功能異常、負重過度及家族遺傳等，但具體機制需進一步研究。有研究顯示[8]，炎性反應和免疫應激反應對于KOA的發(fā)生及發(fā)展具有重要意義。KOA不僅是累及全身關節(jié)的炎癥性疾病，而且自身免疫反應在KOA的發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[13]。

1985年，Toll樣受體由Nusslein Volhard在果蠅的胚胎中發(fā)現(xiàn)，該受體屬于一類跨膜蛋白受體，能夠識別脂多糖、細菌脂蛋白等外源性配體[7-9]。TLR-4作為Toll家族中重要的成員之一，是一種Ⅰ型跨膜蛋白受體，主要由細胞內(nèi)外區(qū)和跨膜區(qū)組成，能夠通過特異性啟動自身免疫反應參與多種疾病的發(fā)展[14]。TLR-4位于9q32-33，包括879個氨基酸，細胞外由富含亮氨酸的序列組成[15]。TLR-4與炎性反應中IL-1β同源性高。IL-1β是IL-1家族的重要成員之一，在KOA患者的軟骨組織中呈強陽性表達，動物實驗和細胞試驗也發(fā)現(xiàn)IL-1β對于KOA具有重要作用[7]。

本研究發(fā)現(xiàn)，觀察組血清及關節(jié)液中TLR-4和IL-1β水平高于對照組（P < 0.05），同時隨著KOA嚴重程度的加重，患者血清及關節(jié)液中TLR-4和IL-1β水平均顯著升高（P < 0.05），另外Spearman相關性顯示，血清和關節(jié)液中TLR-4和IL-1β水平與KOA的嚴重程度呈正相關（P < 0.05），提示TLR-4和IL-1β參與KOA發(fā)生發(fā)展，這與王學宗等[7]的研究結(jié)果一致。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因為TLR-4的信號轉(zhuǎn)導通路能夠激活軟骨分解酶類及炎性因子的釋放，如金屬基質(zhì)蛋白、腫瘤壞死因子及IL-1等，導致KOA患者的軟骨代謝平衡異常[16-17]。IL-1β參與KOA的過程可能與以下個方面相關：①與金屬基質(zhì)蛋白的合成有關，金屬基質(zhì)蛋白能夠降解細胞外基質(zhì)的蛋白成分，造成KOA[18];②提高腫瘤壞死因子和血管內(nèi)皮細胞黏附因子的表達水平、強化一氧化氮等炎性介質(zhì)的作用[19];③減少蛋白多糖的合成量，增加糖酵解量，導致軟骨組織基質(zhì)降解，加速軟骨細胞的凋亡，共同參與KOA的發(fā)病過程[20];④增強B細胞的生長速度，抑制軟骨細胞膠原蛋白的表達，發(fā)揮骨吸收功能[21];⑤加速滑膜組織和軟骨組織中前列腺素E2的釋放，而前列腺素E2又可提高IL-1β對軟骨的分解作用[22];⑥提高膠原酶的促炎作用[8]。

Pearson相關性分析顯示，血清TLR-4水平與IL-1β水平呈相關（P < 0.05）;關節(jié)液TLR-4水平與IL-1β水平呈正相關（P < 0.05）。提示TLR-4和IL-1β之間存在密切的相關性，可能是由于兩者存在較高的同源性，主要通過TLR/4Myd88/NF-κB信號通路激活核因子，誘發(fā)機體的全身免疫性反應，共同參與KOA的發(fā)展過程[8]。

綜上所述，KOA患者血清及關節(jié)液中TLR-4和IL-1β水平異常升高，與疾病的發(fā)展密切相關，臨床上不僅可以用于預測疾病的發(fā)生，還可用于監(jiān)測KOA的發(fā)展程度。另外，其可作為臨床治療KOA的靶點，值得在臨床上推廣應用。

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（收稿日期：2019-08-23? 本文編輯：劉明玉）

[基金項目] 中國金屬學會冶金安全與健康分會健康衛(wèi)生科研項目（jkws201835）。

[作者簡介] 毛洪剛（1980.3-），男，碩士;研究方向：骨與關節(jié)外科。

[通訊作者] 朱艷麗（1980.4-），女，碩士，副主任醫(yī)師;研究方向：麻醉醫(yī)學。