• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    鹽脅迫促進(jìn)鼠李糖乳桿菌富硒的效果

    2020-04-02 03:32:40鄔淑芳楊芙蓮余海霞賀佳璇
    食品科學(xué) 2020年6期
    關(guān)鍵詞:鼠李糖還原酶谷胱甘肽

    徐 穎,鄔淑芳,楊芙蓮,余海霞,賀佳璇

    (陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,陜西 西安 710021)

    硒是人體必需的微量營(yíng)養(yǎng)素,隨著人們對(duì)硒營(yíng)養(yǎng)功能的研究發(fā)現(xiàn),硒不僅是谷胱甘肽過氧化物酶、硒磷酸酯合成酶等酶活性中心的組成成分,還具有保護(hù)心血管和心肌的健康、增強(qiáng)免疫功能、防癌抗癌、重金屬的天然解毒劑等作用,并且能促進(jìn)身體生長(zhǎng)、保護(hù)視覺器官[1-4]。 硒的補(bǔ)充主要有無機(jī)硒和有機(jī)硒兩種形式,有機(jī)硒相比無機(jī)硒,安全性相對(duì)較高,不易發(fā)生硒中毒,也容易被機(jī)體吸收利用[5]。

    有益微生物對(duì)于硒的富集和轉(zhuǎn)化是當(dāng)前乃至以后研究的方向。Sarathchandra等[6]研究巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)富硒效果,發(fā)現(xiàn)生成了紅色硒單質(zhì)。此外,深紅螺菌(Rhodospirillum rubrum)[7]、 大腸桿菌(Escherichia coli)[7]、印度脫硫元螺菌(Desulfurispirillum indicum)[8]、酵母菌[9]、枯草芽孢桿菌(B. subtilis)[10]等也具有將亞硒酸鹽或硒酸鹽轉(zhuǎn)化為硒單質(zhì)的能力。乳酸菌同樣具有將無機(jī)硒生物轉(zhuǎn)化成有機(jī)硒的功能[11-14],相對(duì)于化學(xué)法,操作簡(jiǎn)便、安全,但存在富硒量偏低的問題。所以,本課題在前期研究的基礎(chǔ)上,探討鹽脅迫對(duì)鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)富硒效果的影響,提高鼠李糖乳桿菌富硒量,探索其作用機(jī)制,以期對(duì)富硒乳酸菌在乳品工業(yè)的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    鼠李糖乳桿菌ATCC 53103由實(shí)驗(yàn)室提供;亞硒酸鈉 山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司;MRS培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)股份有限公司;其他試劑均為分析純。

    1.2 儀器與設(shè)備

    722E型分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司;臺(tái)式 低速離心機(jī) 湖南赫西儀器裝備有限公司;PB-10酸度計(jì) 德國(guó)賽多利斯公司;H-7650透射電子顯微鏡 日本日立公司;EDAX透射電鏡專用能譜儀 美國(guó)伊達(dá)克斯有限公司;IRIS Intreid II電感耦合等離子發(fā)射光譜儀 美國(guó)Thermo Fisher公司;FD5-series真空冷凍干燥機(jī) 美國(guó)Freeze Dryer公司。

    1.3 方法

    1.3.1 菌種的活化

    將0.3~0.5 mL經(jīng)高溫高壓滅菌后的MRS肉湯培養(yǎng)基注入該菌凍干管中,用移液槍輕輕吹打,使之充分溶解成菌懸液。將菌懸液移入試管,37 ℃活化培養(yǎng)24 h,連續(xù)活化3 代,作為供試菌液。

    1.3.2 鹽脅迫富硒培養(yǎng)

    一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的NaCl溶液、0.17 mg/mL亞硒酸鈉溶液和MRS液體培養(yǎng)基預(yù)先滅菌,將供試菌液以1%接種量接種于液體培養(yǎng)基中,15 mL培養(yǎng)基加入1 mL亞硒酸鈉和1 mL NaCl溶液,使亞硒酸鈉質(zhì)量濃度為10 μg/mL,同時(shí)做空白對(duì)照,37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)72 h,采用比濁法,每隔3 h取出在600 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度,繪制各菌種生長(zhǎng)曲線,觀察菌體生長(zhǎng)情況,以確定鹽脅迫富硒培養(yǎng)的時(shí)間。

    1.3.3 富硒培養(yǎng)條件優(yōu)化

    1.3.3.1 NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)的選擇

    2%、4%、6%、8% NaCl溶液和0.17 mg/mL亞硒酸鈉溶液、MRS液體培養(yǎng)基預(yù)先滅菌,將供試菌液以1%接種量接種于不同含鹽量富硒液體培養(yǎng)基中,以富硒不加鹽脅迫為的空白對(duì)照,37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)48 h,觀察菌體顏色變化,用生理鹽水充分洗滌,離心得菌泥,測(cè)定菌體富硒率和富硒量。

    1.3.3.2 pH值的選擇

    配制pH值分別為5.6、5.8、6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2的MRS液體培養(yǎng)基和0.17 mg/mL亞硒酸鈉溶液、6% NaCl溶液并預(yù)先滅好菌,將供試菌液按1%接種量接種于液體培養(yǎng)基中,37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)48 h,用生理鹽水充分洗滌,離心得菌泥,測(cè)定菌體富硒量和富硒率。

    1.3.3.3 培養(yǎng)溫度的選擇

    配制一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的NaCl溶液、0.17 mg/mL亞硒酸鈉溶液和pH值為最佳值MRS液體培養(yǎng)基并預(yù)先滅菌,將供試菌液以1%接種量接種于含最佳NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)富硒液體培養(yǎng)基中,分別在35、37、39、41、43 ℃條件下恒溫靜置培養(yǎng)48 h。離心得菌泥,測(cè)定菌體富硒量和富硒率。

    1.3.4 富硒量的測(cè)定

    菌液離心得菌體, 烘干后用硝酸- 高氯酸 (5∶1,V/V)混酸消化,方法詳見文獻(xiàn)[15]。樣品用電感耦合等離子發(fā)射光譜儀測(cè)定。富硒量和富硒率按 式(1)、(2)計(jì)算:

    1.3.5 透射電鏡觀察富硒菌體

    富硒后菌體離心,用2.5%戊二醛-多聚甲酸固定液4 ℃固定2 h,0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液浸洗30 min;1%四氧化鋨固定液4 ℃固定2 h,0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液10 min;依次用30%、50%、70%、90%乙醇、無水乙醇脫水;用包埋劑(Epon812-丙酮1∶1)37 ℃浸泡2 h,再用包埋劑60 ℃浸泡0.5~1 h;37 ℃聚合12 h,超薄切片50~70 nm;用醋酸鈾、檸檬酸鉛染色各10 min。用透射電鏡觀察,用能譜儀打能譜。

    1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

    2 結(jié)果與分析

    2.1 鹽脅迫富硒鼠李糖乳桿菌生長(zhǎng)曲線

    如圖1所示,兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組比空白組進(jìn)入穩(wěn)定期的時(shí)間推后3 h左右,這是由于在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(3~12 h)菌體的生長(zhǎng)一定程度上受到鹽脅迫和硒的抑制,但進(jìn)入穩(wěn)定期后各組的差異逐漸縮小,6% NaCl溶液脅迫條件下富硒培養(yǎng)24 h,活菌數(shù)接近空白組,且比未受鹽脅迫組的活菌數(shù)高。說明6% NaCl溶液脅迫雖然對(duì)菌前期生長(zhǎng)有些影響,但是進(jìn)入穩(wěn)定期后影響不大,可以開展后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

    圖 1 鼠李糖乳桿菌受6% NaCl溶液脅迫的生長(zhǎng)曲線Fig. 1 Growth curve of L. rhamnosus under 6% NaCl stress

    2.2 鹽脅迫工藝條件對(duì)鼠李糖乳桿菌富硒效果的影響

    2.2.1 培養(yǎng)時(shí)間的影響

    圖 2 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)富硒量(a)和富硒率(b)的影響Fig. 2 Effect of culture time on selenium content (a) and enrichment efficiency (b)

    由圖2可知,用6% NaCl溶液脅迫鼠李糖乳桿菌,24 h內(nèi)隨菌的生長(zhǎng),富硒量和富硒率快速增大,但受6% NaCl溶液脅迫組與未受鹽脅迫組富硒作用差異不大;培養(yǎng)24 h后,菌體處于穩(wěn)定期,富硒量和富硒率變化緩慢,趨于穩(wěn)定,但受6% NaCl溶液脅迫組與未受鹽脅迫組富硒作用差異逐漸增大??傊w的富硒作用與其生長(zhǎng)同步進(jìn)行。48 h后,富硒量和富硒率波動(dòng)變小,因此確定培養(yǎng)時(shí)間為48 h。此時(shí)6% NaCl溶液脅迫組比未脅迫組的富硒量提高了122.72 μg/g,富硒率提高了13.17%,明顯促進(jìn)了鼠李糖乳桿菌的富硒效果。

    2.2.2 NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

    由圖3可知,未脅迫組的富硒量和富硒率分別為329.71 μg/g和30.16%,6% NaCl溶液脅迫組的富硒量和富硒率高于未脅迫組,能提高鼠李糖乳桿菌的富硒效果,且在NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%時(shí)富硒量和富硒率達(dá)最高值。

    圖 3 NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)富硒效果的影響Fig. 3 Effect of salt concentration on selenium content and enrichment efficiency

    2.2.3 培養(yǎng)pH值的影響

    圖 4 pH值對(duì)富硒量(a)和富硒率(b)的影響Fig. 4 Effect of pH on selenium content (a) and enrichment efficiency (b)

    由圖4 可以看出,用6% N a C l 溶液脅迫富硒,pH 5.6~6.4時(shí),富硒量和富硒率呈現(xiàn)不同程度的遞增,但是在pH 6.4~7.2時(shí),富硒量和富硒率呈現(xiàn)下降趨勢(shì),說明pH值大于6.4有明顯抑制菌體富硒的作用,可能是因?yàn)閜H值大于6.4后,對(duì)酶活力有影響,影響硒蛋白的合成,從而抑制菌體富硒作用,所以鹽脅迫富硒培養(yǎng)的最佳pH值為6.4。

    2.2.4 培養(yǎng)溫度的影響

    由圖5可知,富硒培養(yǎng)受溫度變化影響比較明顯,在6% NaCl溶液脅迫富硒培養(yǎng)條件下,37 ℃時(shí)呈現(xiàn)最大值,只富硒不進(jìn)行鹽脅迫培養(yǎng)條件下39 ℃時(shí)出現(xiàn)最大值,可能是由于37 ℃是鼠李糖乳桿菌的最佳生長(zhǎng)溫度,加鹽改變細(xì)胞通透性使富硒量增加,不加鹽時(shí)溫度升高造成細(xì)胞的損傷,所以溫度過高時(shí)富硒量反而減少。因此,鼠李糖乳桿菌在進(jìn)行鹽脅迫富硒培養(yǎng)效果較好的溫度為37 ℃。

    圖 5 培養(yǎng)溫度對(duì)富硒量(a)和富硒率(b)影響Fig. 5 Effect of culture temperature on selenium content (a) and enrichment efficiency (b)

    2.3 透射電鏡觀察

    圖 6 鼠李糖乳桿菌富硒前后形貌及能譜對(duì)比Fig. 6 Comparison of morphology and energy spectra of native and Se-enriched L. rhamnosus

    富硒后的菌體細(xì)胞內(nèi)有黑色微小球形顆粒分布 (圖6B1),鹽脅迫富硒后的菌體細(xì)胞內(nèi)外均有黑色微小球形顆粒分布,顆粒數(shù)較單純富硒的情況多,并且在細(xì)胞外的顆??梢杂坞x存在,顆粒大小20~60 nm(圖6C1)。 Wadhwani等[16]指出大概有30多種原核微生物能把無機(jī)硒轉(zhuǎn)化成硒單質(zhì),顆粒大小主要集中在20~200 nm,顆粒大小與富硒培養(yǎng)時(shí)間有關(guān)。本次觀察到的顆粒大小正好位于其間。經(jīng)能譜分析,空白組硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.03%(圖6A2),富硒未脅迫組硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.42% (圖6B2),鹽脅迫富硒組硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.72%(圖6C2)。 說明亞硒酸鈉能夠進(jìn)入到菌體內(nèi),被還原生成硒單質(zhì),有一部分留在細(xì)胞內(nèi),另外還有一部分被分泌到細(xì)胞外,并且可以游離存在,菌體受鹽脅迫后富硒量增加,進(jìn)一步證明了鼠李糖乳桿菌具有生物轉(zhuǎn)化無機(jī)硒的作用。

    3 討 論

    具有富硒能力的乳酸菌有鼠李糖乳桿菌[17]、副干酪乳桿菌[17]、保加利亞乳桿菌[18]、干酪乳桿菌[19]、羅伊氏乳桿菌[20-21]、耐久腸球菌[22]等。靳志強(qiáng)等[23]研究了動(dòng)物雙歧桿菌01的耐硒特性和最佳富硒條件,其菌體硒含量達(dá)898.0 μg/g,富硒率為28.1%。曾議霆等[24]對(duì)5 種15 株乳酸菌進(jìn)行富硒培養(yǎng)并篩選,最終篩選出1 株植物乳桿菌BC-25為富硒優(yōu)勢(shì)菌株,富硒量425.8 μg/g,富硒率達(dá)27.0%。文獻(xiàn)[23]中動(dòng)物雙歧桿菌01的富硒量雖然高于本研究的鼠李糖乳桿菌,但其富硒率較低。文獻(xiàn)[24]篩選出的植物乳桿菌的富硒量和富硒率均低于于本研究的鼠李糖乳桿菌。

    硒酸鹽或亞硒酸鹽在微生物中被還原成硒單質(zhì),可以看成是脫毒的過程,同時(shí)作為電子的受體,維持氧化還原穩(wěn)定狀態(tài)[25]。谷胱甘肽在亞硒酸還原中起電子供體的作用,其還原產(chǎn)物是硒代谷胱甘肽(GS-Se-SG),它是谷胱甘肽還原酶和細(xì)菌硫氧還蛋白還原酶的底物。谷胱甘肽還原酶或細(xì)菌硫氧還蛋白還原酶還原GS-Se-SG產(chǎn)生谷胱甘肽硒硫化物(GS-Se—),其進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為還原型谷胱甘肽和Se0。谷胱甘肽再生的電子源是NADPH。Butler等[26]報(bào)道硒納米球分泌到細(xì)胞外過程中起作用的是SefA(硒因 子A),它的分子質(zhì)量約為95 kDa,沒有可切割的信號(hào)肽。

    楊鶴[27]發(fā)現(xiàn)NaCl能提高乳酸菌的富硒能力,和本課題組的研究結(jié)果一致。乳酸菌能將培養(yǎng)液中的無機(jī)硒轉(zhuǎn)化成其所需要的硒代半胱氨酸[28],進(jìn)一步合成各種含硒酶類,維持機(jī)體正常代謝,當(dāng)乳酸菌受到鹽脅迫時(shí),為應(yīng)對(duì)外界滲透壓的變化,通過誘導(dǎo)相關(guān)酶(包括硒蛋白酶)表達(dá)上調(diào),增加谷氨酸、甘氨酸、脯氨酸和甜菜堿等可混溶性溶質(zhì)的生成量,這些可混溶性溶質(zhì)能防止由于外部高滲透壓而引起的細(xì)胞內(nèi)水分損失,確保細(xì)胞內(nèi)外的溶脹平衡,維持蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性[29]。而這些可混溶性溶質(zhì)生物合成的關(guān)鍵酶如甘氨酸還原酶、脯氨酸還原酶、甜菜堿還原酶都是硒蛋白酶,因此鹽脅迫促進(jìn)了乳酸菌對(duì)硒的轉(zhuǎn)化作用。

    4 結(jié) 論

    以1 株富硒能力較強(qiáng)的鼠李糖乳桿菌(ATCC 53103)為研究對(duì)象,利用電感耦合等離子發(fā)射光譜方法測(cè)定鼠李糖乳桿菌的富硒量和富硒率,研究鹽脅迫富硒過程中培養(yǎng)時(shí)間、NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)、pH值、培養(yǎng)溫度對(duì)菌體細(xì)胞富硒效果的影響,結(jié)果表明,15 mL培養(yǎng)基中加入1 mL 6% NaCl溶液、pH 6.4、溫度37 ℃時(shí),鼠李糖乳桿菌富硒培養(yǎng)48 h效果較好,富硒量最高可達(dá)452.43 μg/g,富硒率最高達(dá)43.33%,利用透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)鼠李糖乳桿菌富硒后形成微小硒納米顆粒,且鹽脅迫能促進(jìn)其富硒效果。

    猜你喜歡
    鼠李糖還原酶谷胱甘肽
    四氫葉酸還原酶基因多態(tài)性與冠心病嚴(yán)重程度的相關(guān)性
    鼠李糖脂發(fā)酵液驅(qū)油性能研究
    生物表面活性劑鼠李糖脂研究概況
    蚯蚓谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶分離純化的初步研究
    分光光度法結(jié)合抗干擾補(bǔ)償檢測(cè)谷胱甘肽
    銅綠假單胞菌半固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)鼠李糖脂
    以甘油為底物鼠李糖脂高產(chǎn)菌株的誘變選育
    TBBPA對(duì)美洲鰻鱺谷胱甘肽代謝相關(guān)指標(biāo)的影響
    發(fā)酵液中酮基還原酶活性測(cè)定方法的構(gòu)建
    羰基還原酶不對(duì)稱還原?-6-氰基-5-羥基-3-羰基己酸叔丁酯
    久久久a久久爽久久v久久| 日韩在线高清观看一区二区三区| 欧美丝袜亚洲另类| 日本爱情动作片www.在线观看| 好男人视频免费观看在线| 日韩亚洲欧美综合| 69人妻影院| 日韩av在线大香蕉| av电影中文网址| 丰满迷人的少妇在线观看| 日本vs欧美在线观看视频| 亚洲av欧美aⅴ国产| 五月开心婷婷网| av在线app专区| a级毛片黄视频| 精品第一国产精品| 有码 亚洲区| 久久精品国产自在天天线| 一级,二级,三级黄色视频| 母亲3免费完整高清在线观看 | 婷婷色综合www| 久久久久精品性色| 秋霞在线观看毛片| 中文欧美无线码| 久久久久久久久久人人人人人人| 大香蕉久久网| 国产熟女欧美一区二区| 大陆偷拍与自拍| 久热这里只有精品99| 亚洲图色成人| 中文字幕免费在线视频6| 51国产日韩欧美| 久久午夜福利片| 高清不卡的av网站| 中文字幕最新亚洲高清| xxx大片免费视频| 搡女人真爽免费视频火全软件| 在线观看免费日韩欧美大片| 永久免费av网站大全| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 亚洲,欧美精品.| 赤兔流量卡办理| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 亚洲国产成人一精品久久久| 国产成人aa在线观看| 国产在视频线精品| 在线观看免费高清a一片| 精品少妇内射三级| 亚洲av免费高清在线观看| 国产在视频线精品| 国产av国产精品国产| 丰满迷人的少妇在线观看| 一级a做视频免费观看| 日韩三级伦理在线观看| 日韩大片免费观看网站| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 国产成人精品一,二区| a级毛色黄片| 欧美xxxx性猛交bbbb| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 久久精品国产综合久久久 | 欧美 日韩 精品 国产| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 免费观看无遮挡的男女| 日本av手机在线免费观看| 欧美另类一区| 男女边吃奶边做爰视频| 男女高潮啪啪啪动态图| 精品卡一卡二卡四卡免费| 亚洲色图综合在线观看| 青春草亚洲视频在线观看| 国产激情久久老熟女| 爱豆传媒免费全集在线观看| 精品久久蜜臀av无| 亚洲内射少妇av| 中文字幕最新亚洲高清| 丰满乱子伦码专区| √禁漫天堂资源中文www| 亚洲成国产人片在线观看| 日韩精品有码人妻一区| 日韩伦理黄色片| 91国产中文字幕| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| av网站免费在线观看视频| 男女下面插进去视频免费观看 | 久久久精品94久久精品| 国产片内射在线| 伦理电影免费视频| 黑人欧美特级aaaaaa片| 丝袜美足系列| 亚洲成人手机| 国产1区2区3区精品| 成人漫画全彩无遮挡| 9色porny在线观看| 免费观看性生交大片5| 黄色毛片三级朝国网站| 久久精品久久精品一区二区三区| 视频中文字幕在线观看| 久久影院123| 黑人欧美特级aaaaaa片| av一本久久久久| 一级a做视频免费观看| 欧美激情极品国产一区二区三区 | 亚洲熟女精品中文字幕| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 国产精品成人在线| 一区二区三区精品91| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 一区二区三区精品91| 美女主播在线视频| 国产精品无大码| 国产精品一国产av| 国产熟女午夜一区二区三区| 成人亚洲精品一区在线观看| 国产不卡av网站在线观看| 少妇的逼水好多| 蜜桃国产av成人99| 九色亚洲精品在线播放| 国产激情久久老熟女| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 亚洲国产欧美在线一区| 少妇的逼好多水| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 久久av网站| 亚洲性久久影院| 亚洲欧美成人精品一区二区| 日韩电影二区| 亚洲欧美成人精品一区二区| 欧美+日韩+精品| 亚洲在久久综合| 91精品三级在线观看| 18禁国产床啪视频网站| 亚洲在久久综合| 成人免费观看视频高清| 亚洲经典国产精华液单| 熟女电影av网| 久久久亚洲精品成人影院| 黄片无遮挡物在线观看| 99热国产这里只有精品6| 国产成人免费观看mmmm| 亚洲精品乱久久久久久| 男女高潮啪啪啪动态图| 搡老乐熟女国产| 欧美性感艳星| 久久青草综合色| 免费观看无遮挡的男女| 大香蕉97超碰在线| 韩国高清视频一区二区三区| 国产精品久久久久久精品古装| 飞空精品影院首页| 在线观看人妻少妇| 成年动漫av网址| 国产精品国产av在线观看| 亚洲精品一二三| 91精品三级在线观看| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 国产在线视频一区二区| 女人久久www免费人成看片| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 熟女电影av网| 日韩av在线免费看完整版不卡| 国产精品偷伦视频观看了| 男人操女人黄网站| 日本wwww免费看| 一级a做视频免费观看| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 丰满迷人的少妇在线观看| 综合色丁香网| 成人无遮挡网站| 欧美国产精品va在线观看不卡| 国产黄色视频一区二区在线观看| 韩国av在线不卡| 国产爽快片一区二区三区| 日韩电影二区| 深夜精品福利| 国产在线免费精品| 亚洲成人av在线免费| 全区人妻精品视频| freevideosex欧美| 国产一区二区在线观看日韩| 亚洲国产av新网站| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 欧美另类一区| 国产高清国产精品国产三级| 久久 成人 亚洲| 日韩欧美精品免费久久| 老司机亚洲免费影院| 国产精品一区www在线观看| 国产精品久久久久久精品古装| 高清毛片免费看| 秋霞伦理黄片| 国产在线视频一区二区| 国产熟女欧美一区二区| 久久99一区二区三区| 中文欧美无线码| 黑人高潮一二区| 高清av免费在线| 国产精品三级大全| 校园人妻丝袜中文字幕| 日韩免费高清中文字幕av| 国产黄色视频一区二区在线观看| 九九爱精品视频在线观看| 成人午夜精彩视频在线观看| 久久久精品免费免费高清| av有码第一页| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 久久99一区二区三区| 国产 一区精品| 一区二区av电影网| 男女国产视频网站| 亚洲综合色惰| 黑人高潮一二区| 在线观看美女被高潮喷水网站| av不卡在线播放| 欧美xxxx性猛交bbbb| 国产爽快片一区二区三区| 成年女人在线观看亚洲视频| 午夜免费观看性视频| 黄色一级大片看看| 制服丝袜香蕉在线| 日本午夜av视频| 亚洲内射少妇av| 在线观看美女被高潮喷水网站| 最后的刺客免费高清国语| 国产乱来视频区| 在线观看一区二区三区激情| 久久久久精品人妻al黑| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 久久精品国产亚洲av天美| av在线老鸭窝| 女性生殖器流出的白浆| 午夜日本视频在线| 日韩制服骚丝袜av| 少妇的逼好多水| 9191精品国产免费久久| 99热全是精品| 免费黄频网站在线观看国产| 国产一区二区三区综合在线观看 | 久久青草综合色| 精品一区二区三区视频在线| 久久人人97超碰香蕉20202| 另类亚洲欧美激情| 国产av码专区亚洲av| av播播在线观看一区| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 一级毛片电影观看| 久久 成人 亚洲| 一级黄片播放器| 一级爰片在线观看| 免费av不卡在线播放| 一区二区三区精品91| 久久久久久伊人网av| 黄片播放在线免费| 男人爽女人下面视频在线观看| 欧美成人精品欧美一级黄| 亚洲丝袜综合中文字幕| 国产成人精品福利久久| 日本与韩国留学比较| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 成人无遮挡网站| 三上悠亚av全集在线观看| 尾随美女入室| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 免费高清在线观看视频在线观看| 亚洲精品乱久久久久久| av国产精品久久久久影院| 日本欧美国产在线视频| 欧美日韩亚洲高清精品| 一区二区日韩欧美中文字幕 | 免费人妻精品一区二区三区视频| 国产精品人妻久久久影院| 久久久久久久精品精品| 亚洲成人手机| 韩国av在线不卡| 成人综合一区亚洲| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 黄片无遮挡物在线观看| 激情五月婷婷亚洲| 99久久精品国产国产毛片| 自线自在国产av| 九草在线视频观看| 国产黄频视频在线观看| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 久久 成人 亚洲| 婷婷成人精品国产| 国产精品人妻久久久久久| 亚洲av欧美aⅴ国产| 国产一区二区在线观看av| 综合色丁香网| 香蕉精品网在线| 蜜桃在线观看..| 日本黄大片高清| 久久人人爽人人爽人人片va| 国产黄色视频一区二区在线观看| 久久精品国产亚洲av天美| 亚洲在久久综合| freevideosex欧美| 一本色道久久久久久精品综合| 久久97久久精品| 久久99热6这里只有精品| 欧美97在线视频| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 久久久久人妻精品一区果冻| 国产 精品1| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 日本黄色日本黄色录像| 午夜日本视频在线| 有码 亚洲区| 国产精品嫩草影院av在线观看| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 最新的欧美精品一区二区| 哪个播放器可以免费观看大片| 欧美精品av麻豆av| a级毛片黄视频| 国产高清三级在线| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 国产精品偷伦视频观看了| 国产男女内射视频| 最近手机中文字幕大全| 熟妇人妻不卡中文字幕| 国产在线免费精品| 国产国语露脸激情在线看| av在线播放精品| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 九草在线视频观看| 国产熟女午夜一区二区三区| 国产亚洲最大av| 国产精品嫩草影院av在线观看| 丁香六月天网| 国产有黄有色有爽视频| 日本wwww免费看| 久久韩国三级中文字幕| 丝袜在线中文字幕| 黄色一级大片看看| 日韩伦理黄色片| 黄色毛片三级朝国网站| 国产精品蜜桃在线观看| 免费看光身美女| 中文字幕人妻熟女乱码| 一二三四中文在线观看免费高清| 另类精品久久| 亚洲成av片中文字幕在线观看 | 免费少妇av软件| 熟女电影av网| 最近最新中文字幕免费大全7| 一本久久精品| 免费黄频网站在线观看国产| 精品国产露脸久久av麻豆| 精品久久蜜臀av无| 国产老妇伦熟女老妇高清| 亚洲欧美色中文字幕在线| 日本-黄色视频高清免费观看| 日韩大片免费观看网站| 一区二区三区乱码不卡18| 十八禁高潮呻吟视频| 国产男女超爽视频在线观看| av片东京热男人的天堂| 午夜福利影视在线免费观看| 久久久a久久爽久久v久久| 亚洲第一区二区三区不卡| av又黄又爽大尺度在线免费看| 老司机影院成人| 成年女人在线观看亚洲视频| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 黄色 视频免费看| 精品人妻熟女毛片av久久网站| av免费观看日本| 观看美女的网站| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 亚洲第一区二区三区不卡| 777米奇影视久久| 九色亚洲精品在线播放| 91精品三级在线观看| 亚洲av男天堂| 久久久久国产精品人妻一区二区| 97超碰精品成人国产| 街头女战士在线观看网站| 日日摸夜夜添夜夜爱| 新久久久久国产一级毛片| 交换朋友夫妻互换小说| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 中文字幕亚洲精品专区| 亚洲成人av在线免费| 欧美精品国产亚洲| 欧美成人午夜精品| 久久久久精品人妻al黑| 人人妻人人澡人人看| 国产亚洲精品久久久com| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 免费在线观看黄色视频的| 最近手机中文字幕大全| 精品一区二区三卡| 中文天堂在线官网| 两个人看的免费小视频| 久久久久久人妻| 香蕉丝袜av| 9色porny在线观看| 国产深夜福利视频在线观看| 亚洲第一区二区三区不卡| 久久久精品94久久精品| 美女视频免费永久观看网站| 国产av精品麻豆| 男女边吃奶边做爰视频| 亚洲av综合色区一区| 99精国产麻豆久久婷婷| 大片电影免费在线观看免费| 在线观看www视频免费| 成人免费观看视频高清| 国产男人的电影天堂91| 久久久久久久大尺度免费视频| 免费观看在线日韩| 亚洲av福利一区| 激情视频va一区二区三区| 少妇高潮的动态图| 一级片'在线观看视频| 亚洲精品456在线播放app| 最近中文字幕2019免费版| 亚洲欧洲日产国产| 香蕉精品网在线| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| √禁漫天堂资源中文www| 亚洲国产成人一精品久久久| 亚洲欧美精品自产自拍| 国产精品女同一区二区软件| 精品人妻一区二区三区麻豆| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 美女福利国产在线| 亚洲国产看品久久| 日韩伦理黄色片| 人妻少妇偷人精品九色| av有码第一页| 男女边吃奶边做爰视频| 日韩制服丝袜自拍偷拍| av网站免费在线观看视频| 最近中文字幕高清免费大全6| 国产一区有黄有色的免费视频| 免费高清在线观看视频在线观看| 国产成人a∨麻豆精品| 国产色婷婷99| 26uuu在线亚洲综合色| av国产久精品久网站免费入址| 日韩在线高清观看一区二区三区| 美女国产视频在线观看| 三级国产精品片| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 精品国产乱码久久久久久小说| 国产精品久久久久久精品电影小说| 在线观看免费视频网站a站| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 亚洲精品456在线播放app| 免费高清在线观看日韩| 男女啪啪激烈高潮av片| 在线观看国产h片| 亚洲伊人色综图| 免费高清在线观看视频在线观看| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 久久久久精品性色| 久久婷婷青草| 男人操女人黄网站| 免费日韩欧美在线观看| 欧美97在线视频| 哪个播放器可以免费观看大片| 性色avwww在线观看| 国产又色又爽无遮挡免| 亚洲国产精品999| 日韩精品有码人妻一区| a 毛片基地| 深夜精品福利| 各种免费的搞黄视频| 亚洲人与动物交配视频| 性高湖久久久久久久久免费观看| 日本午夜av视频| 久久久久精品性色| 一区二区日韩欧美中文字幕 | 亚洲av日韩在线播放| 久久99热这里只频精品6学生| 久久久久久久国产电影| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 人人澡人人妻人| 熟女人妻精品中文字幕| 欧美日韩综合久久久久久| 精品久久久久久电影网| 欧美3d第一页| 男女边摸边吃奶| 丝袜美足系列| 97超碰精品成人国产| 国产国语露脸激情在线看| 秋霞在线观看毛片| 精品酒店卫生间| 黑人猛操日本美女一级片| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| a级毛片在线看网站| 青青草视频在线视频观看| 久久这里有精品视频免费| 91aial.com中文字幕在线观看| 男人爽女人下面视频在线观看| a级片在线免费高清观看视频| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 看非洲黑人一级黄片| 我要看黄色一级片免费的| 色94色欧美一区二区| 久久午夜综合久久蜜桃| 午夜精品国产一区二区电影| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 最近中文字幕高清免费大全6| 精品人妻在线不人妻| 亚洲熟女精品中文字幕| 9热在线视频观看99| 亚洲,欧美,日韩| 久久久精品94久久精品| 九九爱精品视频在线观看| av在线观看视频网站免费| 亚洲 欧美一区二区三区| h视频一区二区三区| 日本午夜av视频| 狂野欧美激情性bbbbbb| 亚洲精品美女久久av网站| 亚洲精品国产色婷婷电影| 免费黄网站久久成人精品| av在线观看视频网站免费| 精品少妇内射三级| 欧美人与善性xxx| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 成人二区视频| 女性生殖器流出的白浆| 中国国产av一级| 亚洲图色成人| 又大又黄又爽视频免费| 亚洲国产色片| 久久99一区二区三区| 午夜激情av网站| 国产av精品麻豆| 日本欧美国产在线视频| 国产免费一级a男人的天堂| 久久综合国产亚洲精品| 国产av一区二区精品久久| 精品国产乱码久久久久久小说| 欧美3d第一页| 国产成人精品无人区| 亚洲av中文av极速乱| 黄色毛片三级朝国网站| 色5月婷婷丁香| 中国三级夫妇交换| 久久精品国产a三级三级三级| 国产成人精品久久久久久| 午夜福利影视在线免费观看| 国产高清不卡午夜福利| 久久ye,这里只有精品| 久久毛片免费看一区二区三区| 亚洲欧洲国产日韩| 热re99久久精品国产66热6| 大香蕉久久网| av国产精品久久久久影院| 国产色婷婷99| 亚洲综合色网址| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 国产精品偷伦视频观看了| 最后的刺客免费高清国语| 亚洲国产精品999| 美女国产视频在线观看| 高清不卡的av网站| 久热这里只有精品99| 午夜久久久在线观看| 婷婷成人精品国产| 国产 一区精品| 激情视频va一区二区三区| 日本免费在线观看一区| 美女内射精品一级片tv| 欧美老熟妇乱子伦牲交| www.熟女人妻精品国产 | av.在线天堂| 亚洲,一卡二卡三卡| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 国产综合精华液| 国产色婷婷99| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 韩国精品一区二区三区 | 国产综合精华液| 人妻一区二区av| 色吧在线观看| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | videossex国产| 久久精品人人爽人人爽视色| 高清av免费在线| 亚洲精品456在线播放app| 热re99久久精品国产66热6| 69精品国产乱码久久久| 九九爱精品视频在线观看| 婷婷色综合大香蕉| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃 | 美女福利国产在线| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 久久精品人人爽人人爽视色| 青青草视频在线视频观看| 国产午夜精品一二区理论片| 久久综合国产亚洲精品| 国产精品人妻久久久久久| 国产成人a∨麻豆精品| 亚洲欧美精品自产自拍| 一区二区三区乱码不卡18| 亚洲一区二区三区欧美精品| 蜜桃国产av成人99| 国产精品无大码| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 国产精品 国内视频| 久久久久久久国产电影| 日韩中文字幕视频在线看片| 高清在线视频一区二区三区| 日韩大片免费观看网站| 亚洲av免费高清在线观看|