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    不同負(fù)荷運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)慢性心力衰竭大鼠心功能及自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

    2020-04-02 02:45:02
    關(guān)鍵詞:心肌細(xì)胞心功能心肌

    1 天津商業(yè)大學(xué)體衛(wèi)部(天津300134)

    2 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院臨床藥理中心(北京100029)

    慢性心力衰竭(chronic heart failure,CHF)是心肌病和冠心病等多種心血管疾病的終末階段?;颊哌\(yùn)動(dòng)能力顯著下降是CHF的重要臨床表現(xiàn)。隨著心血管康復(fù)運(yùn)動(dòng)的不斷發(fā)展,越來越多的臨床研究表明,運(yùn)動(dòng)康復(fù)能夠顯著改善輕、中度心功能不全患者[左心室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction,LVEF)>30%]癥狀[1],但其具體機(jī)制尚未明確。有研究認(rèn)為,自噬參與了心力衰竭的發(fā)生和發(fā)展過程[2]。也有研究發(fā)現(xiàn),適當(dāng)強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)自噬的激活有助于運(yùn)動(dòng)能力的提高[3]。自噬在心力衰竭患者運(yùn)動(dòng)康復(fù)過程中似乎起到了雙刃劍的作用。因此,研究不同運(yùn)動(dòng)負(fù)荷下,心力衰竭模型動(dòng)物心功能的改善幅度和自噬相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)變化情況,對(duì)于心力衰竭患者運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度的選擇和相關(guān)機(jī)制探討均具有重要的臨床價(jià)值。本研究以左冠狀動(dòng)脈前降支(left anteriordescending coronary artery,LAD)結(jié)扎法復(fù)制大鼠CHF模型,觀察運(yùn)動(dòng)療法對(duì)模型動(dòng)物心功能的影響,并從細(xì)胞自噬角度探討其機(jī)制,為CHF 運(yùn)動(dòng)療法的負(fù)荷選擇提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 動(dòng)物

    清潔級(jí)健康雄性SD 大鼠40只,體重220 ± 10 g,購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)技術(shù)有限公司,許可證編號(hào):SCXK(京)2012-0001。飼養(yǎng)地點(diǎn)北京中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心,飼養(yǎng)溫度23℃± 2℃,環(huán)境相對(duì)濕度40%± 5%,通風(fēng)良好,12 h 晝夜交替,常規(guī)飼料飼養(yǎng),自由飲水。實(shí)驗(yàn)符合《北京市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》要求。

    1.1.2 試劑和儀器

    戊巴比妥鈉(Sigma公司,分析純);BCA 法蛋白定量試劑盒、Western-blot 相關(guān)試劑(北京普利萊基因技術(shù)有限公司)[4];組織樣本處理所需蛋白酶抑制劑(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司);Anti-mTOR antibody(abcam,USA.Ab2732);Anti- mTOR (phospho S2481) antibody [EPR427(N)](ab137133);Anti-LC3B antibody (ab48394);Anti-GAPDH antibody(abcam,USA.ab9485)。

    小動(dòng)物呼吸機(jī)(Kent Scientific 325);十二道自動(dòng)分析心電圖機(jī)(FX-8322);電子天平(CP225D 型);小動(dòng)物高分辨率超聲成像系統(tǒng)( Vevo2100,加拿大VisualSonic公司,30MHz 探頭,固定聚焦深度12.7 mm,配備VIVO STRAIN分析軟件);圖像分析系統(tǒng)(Olympus);恒溫水浴系統(tǒng)(Multi Temp Ⅲcooling,Pharmacia Biotech);蛋白電泳及電轉(zhuǎn)系統(tǒng)(Bio-RadMiniIII);振蕩器(HY-5 型);平板式掃描儀(Umax2100L);動(dòng)物跑步機(jī)(DB030)。

    1.2 造模方法

    LAD致CHF大鼠模型的建立方法同課題組前期發(fā)表文章[4]。腹腔注射1%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉大鼠,備皮。呼吸機(jī)參數(shù)為:呼吸頻率80次/min,潮氣量3 ml/kg,吸呼比1∶2。沿第3、4 肋間開口,暴露心臟后,于左心耳邊緣下1 mm 進(jìn)針,行LAD 術(shù)。結(jié)扎后,利多卡因注射液心肌表面給藥1~2 滴,呋塞米注射液腹腔給藥0.1~0.2 ml后逐層關(guān)胸。術(shù)后青霉素注射液腹腔給藥,800萬(wàn)單位,每日3次,連續(xù)3天。根據(jù)《中國(guó)心力衰竭診斷和治療指南2018》,射血分?jǐn)?shù)<50%是診斷心力衰竭的重要指標(biāo)之一[6]。本研究在LAD 術(shù)后4周末,行心電圖和超聲心動(dòng)檢查,標(biāo)準(zhǔn)12 導(dǎo)聯(lián)心電圖中出現(xiàn)6~8個(gè)導(dǎo)聯(lián)Q波、且LVEF 30%~50%的32只模型大鼠入選后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

    1.3 分組及運(yùn)動(dòng)方案

    分組及跑臺(tái)訓(xùn)練方案參照Bedford[5]的運(yùn)動(dòng)負(fù)荷標(biāo)準(zhǔn)制定,與本研究前期發(fā)表文章相同[4]。隨機(jī)分為4組,每組8只,具體如下:(1)C+LAD 組為模型對(duì)照組,不疊加運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練;(2)模型+低強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練(LE+LAD)組:70%VO2max:跑臺(tái)坡度3°,30 m/min×12 min/次×3次;(3)模型+中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練(ME+LAD)組:80%VO2max:跑臺(tái)坡度6°,32 m/min ×12 min/次×3次;(4)模型+高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練(HE +LAD)組:90%VO2max:跑臺(tái)坡度6°,36 m/min×12 min/次×3次。所有運(yùn)動(dòng)組動(dòng)物于術(shù)后第5 周開始運(yùn)動(dòng),12 min/次,每次間歇30 min,3次/日,每周運(yùn)動(dòng)5 天。所有動(dòng)物于運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練開始后第8周末取材。

    1.4 超聲心動(dòng)評(píng)價(jià)各組大鼠心功能

    為評(píng)價(jià)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)大鼠心功能的影響,各組大鼠在接受不同強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練8 周后進(jìn)行心臟超聲檢查。大鼠超聲檢查采用Vevo 2100 小動(dòng)物高分辨率超聲成像系統(tǒng)(Visualsonics公司,加拿大),大鼠探頭MS-250,頻率30 MHz,固定聚焦深度12.7 mm,數(shù)據(jù)分析采用配套VIVO STRAIN軟件。所有動(dòng)物均空腹?fàn)顟B(tài)檢查,麻醉后左側(cè)臥位,動(dòng)態(tài)圖像觀測(cè)與瞬時(shí)停禎結(jié)合,采集二維、M 型及多普勒超聲心動(dòng)圖。檢測(cè)左室射血分?jǐn)?shù)(ejection fraction,EF)和短軸收縮率(fraction shortening,F(xiàn)S),評(píng)價(jià)心肌收縮、舒張功能。

    1.5 Western-blot 實(shí)驗(yàn)

    方法與課題組前期發(fā)表文章相同[4]。簡(jiǎn)述如下,取左心室梗死邊緣區(qū)0.5mm以內(nèi)心肌組織50 mg,提取總蛋白,BCA 法進(jìn)行蛋白含量測(cè)定后,每孔上樣50 μg,采用濃縮膠5%~7%,分離膠10%或12.5%。電泳條件:100 V,1.5 h。轉(zhuǎn)膜條件:300 mA,1~1.5 h,5%脫脂奶粉4℃封閉1 h。一抗條件:兔抗大鼠雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)多克隆抗體1∶1000;兔抗大鼠磷酸化雷帕霉素靶蛋白(phosphorylated mammalian target of rapamycin,p-mTOR)單克隆抗體1∶1000;兔抗自噬相關(guān)蛋白LC3B(microtubuleassociated protein light chain 3B,LC3B)多克隆抗體1∶1000;兔抗大鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)多克隆抗體1∶1000。孵育過夜后0.1%TBST 漂洗NC 膜3×15 min。二抗條件:辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶5000),37℃孵育1.5 h,TBST 漂洗3×15 min。滴加ECL發(fā)光液,曝光。掃描膠片后,使用Image J 軟件分析目標(biāo)條帶的光密度值,與內(nèi)參(GAPDH)條帶光密度值進(jìn)行比較后,得到目的蛋白表達(dá)的相對(duì)光密度。

    1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    所有數(shù)據(jù)采用Spss22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。分析結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),P<0.05 為差異顯著,P<0.01 為差異非常顯著。

    2 結(jié)果

    2.1 超聲心動(dòng)評(píng)價(jià)結(jié)果

    與C+LAD 組比較,ME+LAD 組大鼠FS和EF 均顯著升高(P<0.01),LE+LAD 組FS 顯著改善(P<0.05);ME+LAD 組大鼠FS 值顯著高于HE+LAD 組(P<0.01),EF值顯著高于HE+LAD組(P<0.01)。

    表1 各組大鼠運(yùn)動(dòng)后8周心功能比較(n=8,%)

    2.2 心肌細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)情況

    與C+LAD 組比較,LE+LAD 組和ME+LAD 組大鼠心肌組織mTOR 表達(dá)降低(P<0.05,P<0.01),ME+LAD 組和HE+LAD 組大鼠心肌組織p-mTOR 表達(dá)降低(P<0.01),LC3B-Ⅱ表達(dá)升高(P<0.01)。與LE+LAD 組相比,ME+LAD組和HE+LAD 組大鼠心肌組織p-mTOR表達(dá)降低、LC3B-Ⅱ表達(dá)升高(P<0.01)。

    圖1 各組大鼠心肌組織自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平

    表2 各組大鼠心肌組織自噬相關(guān)蛋白條帶分析結(jié)果

    3 討論

    心衰是各種心臟疾病的嚴(yán)重表現(xiàn)或晚期階段,死亡率和再住院率居高不下[6]。冠心病導(dǎo)致的心肌缺血是CHF 最主要的誘因。在CHF的臨床治療和康復(fù)過程中,心功能改善程度是判斷治療效果的重要指標(biāo)。國(guó)內(nèi)相關(guān)臨床研究表明,運(yùn)動(dòng)療法能通過減輕患者心臟負(fù)荷、降低外周血管阻力,減少心肌耗氧量,增強(qiáng)心肌收縮力,提高心排出量,有效促進(jìn)CHF 患者心功能和生活質(zhì)量的改善[7-9]。國(guó)外學(xué)者也發(fā)現(xiàn),運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練能夠激活骨骼肌自噬水平,改善心梗大鼠心功能[10]。本研究結(jié)果顯示,與C+LAD 組大鼠心功能相比,不同負(fù)荷訓(xùn)練對(duì)模型動(dòng)物的心功能表現(xiàn)為EF和FS 值的不同程度改善。其中,以ME+LAD 組大鼠EF和FS 值升高最為顯著。上述動(dòng)物在體實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了運(yùn)動(dòng)療法對(duì)心力衰竭動(dòng)物心功能的改善作用。與此同時(shí),心力衰竭模型的成功復(fù)制為運(yùn)動(dòng)療法的機(jī)制研究提供了可能。為探討運(yùn)動(dòng)療法實(shí)現(xiàn)心功能改善的可能機(jī)制,本研究以心肌細(xì)胞自噬相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)為靶點(diǎn),進(jìn)行了較為深入的研究。

    自噬是真核細(xì)胞通過溶酶體機(jī)制降解自身成分的一種代謝途徑。細(xì)胞通過自噬降解損壞的細(xì)胞器和大分子延長(zhǎng)細(xì)胞壽命。依賴于激活的時(shí)間、幅度和細(xì)胞類型,自噬過程在多種心血管疾病中表現(xiàn)出雙重作用[11]。有研究發(fā)現(xiàn),適宜強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)可能會(huì)上調(diào)心肌細(xì)胞自噬水平,促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)代謝廢物降解,引起心肌組織細(xì)胞良好的適應(yīng)性重塑,幫助維持心肌細(xì)胞自身穩(wěn)態(tài)[12]。但大強(qiáng)度長(zhǎng)時(shí)間的耐力訓(xùn)練可能會(huì)引起心肌細(xì)胞形態(tài)異常,它可能導(dǎo)致線粒體巨變和自噬體增多、細(xì)胞內(nèi)成分過度降解,進(jìn)而導(dǎo)致心肌細(xì)胞死亡,從而形成心肌損傷的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[13]。本研究根據(jù)不同運(yùn)動(dòng)負(fù)荷對(duì)心衰模型動(dòng)物進(jìn)行分組訓(xùn)練,希望能夠發(fā)現(xiàn)不同負(fù)荷運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠心肌細(xì)胞自噬水平的影響。

    mTOR 已被明確為自噬的負(fù)性調(diào)控因子。有研究認(rèn)為,在病理性心肌肥厚形成及心力衰竭進(jìn)展過程中,通過抑制mTOR 信號(hào)通路,阻斷其調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)合成,提高自噬水平,可以減弱心肌肥厚,延緩心力衰竭進(jìn)展[14]。LC3B 也是自噬的關(guān)鍵蛋白,在自噬泡形成過程中參與兩種泛素樣蛋白系統(tǒng)的加工過程,被認(rèn)為是自噬活動(dòng)的特異性標(biāo)志物,缺血區(qū)域周圍的心肌細(xì)胞LC3B-Ⅱ水平的顯著升高也表明了該區(qū)域心肌細(xì)胞自噬的激活[15,16]。Moradi等研究發(fā)現(xiàn),規(guī)律運(yùn)動(dòng)聯(lián)合飲食控制能夠上調(diào)LC3B-Ⅱ水平,抑制心衰大鼠的左心室重構(gòu)[17]。但目前針對(duì)心衰模型動(dòng)物心肌細(xì)胞自噬水平與不同負(fù)荷運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練之間關(guān)系的研究,尚未見報(bào)道。因此,本研究將上述指標(biāo)相結(jié)合,對(duì)不同負(fù)荷運(yùn)動(dòng)后大鼠心肌細(xì)胞的自噬水平進(jìn)行判斷。結(jié)果表明,LE+LAD 組的運(yùn)動(dòng)負(fù)荷程度不足以激活心肌細(xì)胞自噬,ME+LAD 組和HE+LAD 組訓(xùn)練均能夠顯著抑制mTOR 及其磷酸化水平,同時(shí),LC3B-Ⅱ/GAPDH 水平也發(fā)生了不同程度的提高??梢姡?、高負(fù)荷的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練能夠激活心衰大鼠心肌細(xì)胞自噬水平,而且運(yùn)動(dòng)負(fù)荷越大,心肌細(xì)胞自噬水平越高。

    然而,本研究發(fā)現(xiàn),自噬激活水平最高的HE+LAD 組大鼠心功能并未得到顯著改善。結(jié)合前期文獻(xiàn)報(bào)道和本課題前期研究結(jié)果[4]分析原因認(rèn)為,高負(fù)荷運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可能導(dǎo)致了心肌細(xì)胞自噬的過度激活,同時(shí)導(dǎo)致了心肌細(xì)胞凋亡水平的升高,而中等負(fù)荷的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練則在心肌細(xì)胞的自噬與凋亡之間形成了良好的平衡,從而對(duì)心功能的恢復(fù)起到了積極作用,進(jìn)一步證實(shí)了心衰的運(yùn)動(dòng)康復(fù)過程中運(yùn)動(dòng)負(fù)荷選擇的重要性。

    4 結(jié)論

    適度運(yùn)動(dòng)能夠改善心力衰竭大鼠心功能,這種心功能的改善可能與抑制mTOR和其磷酸化水平,提高LC3B-Ⅱ水平,適度激活心肌細(xì)胞自噬有關(guān)。

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