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    大強度間歇運動對肥胖大鼠骨骼肌AMPK/PGC-1α通路的影響

    2020-04-02 02:45:02房華玉徐建方王曉靜李良孔喜良路瑛麗馮連世
    中國運動醫(yī)學雜志 2020年2期
    關(guān)鍵詞:腓腸肌附睪有氧

    房華玉 徐建方 王曉靜 李良 孔喜良 路瑛麗 馮連世

    1 國家體育總局體育科學研究所(北京100061)

    2 曲阜師范大學(山東曲阜 273165)

    由于體力活動的減少和/或不科學的飲食行為引起的肥胖及肥胖并發(fā)癥發(fā)生率急劇增加。大量研究已經(jīng)證明,長期有氧運動能夠改善健康和肥胖人群的體成分、心肺功能以及其它與健康相關(guān)的指標[1,2]。但長期單純有氧運動存在運動時間過長、運動過程單調(diào)等不足,導致運動的積極性下降,效果下降。隨著探討大強度間歇運動(high-intensity interval training,HIIT)對超重青少年[3]、老年人[4]以及慢病人員[5,6]的減脂效果及對健康影響研究的深入,越來越多的證據(jù)表明,HIIT能提高機體有氧能力[7,8]、減少腹部脂肪含量[9-11]、改善胰島素敏感性[6,12]以及久坐老年人的心血管功能和代謝能力[4]。HIIT能激活骨骼肌細胞自噬[13],抵抗增齡大鼠肌肉質(zhì)量丟失;影響骨骼肌超氧化物歧化酶2(superoxide dismutase2,SOD2)活性水平,防止骨骼肌氧化損傷[14];促進衰老小鼠腓腸肌蛋白質(zhì)合成,引起肌力增長[15]。

    5'單磷酸腺苷激活蛋白激酶(adenosine 5'-monophosphate-activated protein kinase,AMPK)是細胞內(nèi)能量變化的感受器[16],可通過啟動脂肪酸氧化和糖酵解等分解代謝途徑來增加ATP(adenosine triphosphate,三磷酸腺苷)的產(chǎn)生,同時亦可以降低脂肪酸和蛋白合成來減少ATP的消耗,其激活程度與運動強度和時間成正相關(guān),且受運動強度的影響較大[17]。骨骼肌中AMPK的活化能促進葡萄糖的攝取和脂肪酸的氧化[18]。過氧化物酶體增殖受體γ輔助激活因子α(peroxisome proliferators-activated receptor γ co-activator 1 alpha,PGC-1α)作為AMPK的調(diào)控因子可通過調(diào)節(jié)機體適應性產(chǎn)熱、糖脂代謝、血糖平衡[19],參與線粒體生物合成,提高線粒體的呼吸與氧化能力[20,21],調(diào)節(jié)脂肪酸氧化,達到減肥目的。

    本研究通過建立肥胖大鼠模型,觀察HIIT和有氧運動2種不同運動方式對肥胖大鼠體重、腎周和附睪脂肪重量、脂體比、血脂,以及腓腸肌AMPK/PGC-1α mRNA和蛋白表達的影響,探討不同方式運動時AMPK/PGC-1α通路在減脂過程中的骨骼肌適應機制。

    1 材料與方法

    1.1 實驗對象、分組與訓練安排

    出生3 周的離乳雄性SD 大鼠,每籠5只,室溫21℃~23℃,濕度40%~60%,自然光照,自由飲食,高脂飼料喂養(yǎng)10周后,驗證肥胖模型。肥胖模型驗證標準[22]:①高脂飲食組大鼠體重超過普通飲食組20%以上;②高脂飲食組大鼠的Lee's指數(shù)顯著升高,Lee's指數(shù)=體重(g)1/3×1000/體長(cm)。

    肥胖模型驗證成功后,繼續(xù)高脂飼料分籠飼養(yǎng),選取30只肥胖大鼠隨機分3 組:安靜對照組(OC 組)、有氧運動組(OA 組)、大強度間歇運動組(HIIT 組),每組10只,1周跑臺適應性訓練。運動前測試VO2max,根據(jù)VO2max 確定相應跑速,第4 周結(jié)束后調(diào)整一次跑速。VO2max 測試采用動物氣體代謝分析儀(Oxymax Deluxe System,哥倫布斯,美國)進行;運動方案根據(jù)Leandro 等[23]的研究進行改良。高脂飼料喂養(yǎng),自由飲食。OC 組大鼠不運動;OA 組和HIIT 組均進行0 坡度跑臺訓練,干預總時間為8 周,5次/周。OA 組每天以60%~70%VO2max 速度運動60 min。HIIT 組先以70% VO2max 速度熱身后,再以90% VO2max、50%VO2max 速度交替訓練[24],最后以70% VO2max 速度進行恢復;跑速根據(jù)VO2max的測試結(jié)果確定,運動時間以與OA 組運動距離一致計算。訓練期間每周固定時間測量體重。

    1.2 取材

    最后一次運動后恢復24 h,按0.4 ml/100 g 體重腹腔注射10%水合三氯乙醛溶液麻醉,腹主動脈取血,離心取血清用于檢測血脂指標;取腎周和附睪脂肪稱重,計算脂體比=(腎周脂肪重量+附睪脂肪重量)/體重*100%;取右側(cè)腓腸肌迅速放入液氮中驟冷后-80℃超低溫冰箱保存,待測。

    1.3 試劑與儀器

    主要試劑:引物(BPI),DEPC(Sigma),氯仿、異丙醇、無水乙醇(上?;瘜W試劑公司),RT 試劑(TAKARA),熒光定量PCR 試劑(TAKARA),SYBR Green I(TAKARA),蛋白裂解液(北京普利萊),BCA蛋白定量試劑盒(Thermo),5XSDS 上樣緩沖液(上海生工),PVDF膜(Millipore公司),濾紙(Whatman公司),預染蛋白marker(Fermentas),HRP 二抗(Jackson),內(nèi)參一抗(GenScript),ECL 化學發(fā)光試劑(Perce),TC、TG、HDLC和LDL-C試劑盒。

    主要儀器:MULTISKAN MK3 全自動多功能酶標儀(Thermo,USA),F(xiàn)TC2000熒光定量PCR儀(Canada),高速離心機(上海安亭),玻璃勻漿器(寧波新芝DY89-1),分光光度儀(上海欣茂UV-7504),垂直板電泳轉(zhuǎn)移裝置(上海天能),電泳儀(北京君意JY300C),多用脫色搖床(蘇州捷美SYC-2101)。

    1.4 血脂指標測試方法

    血清總膽固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high density liptein cholesterol,HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)指標采用全自動生化分析儀進行測試,具體操作過程依說明書進行。

    1.4.1 RT-PCR檢測腓腸肌AMPK和PGC-1α mRNA表達量

    引物序列β-actin F:CCCATCTATGAGGGTTACGC,R:TTTAATGTCACGCACGATTTC,產(chǎn)物長度150 bp;AMPK F:CAACCGTTCTATTGCCACTCTG,R:TTAGCATCATAGGAGGGGTCTTC,產(chǎn)物長度147 bp;PGC-1α F:CAAGTATCTGACCACAAACGATG,R:ACTGCGGTTGTGTATGGGAC,產(chǎn)物長度110 bp。

    采用SYBR Green I 熒光染料RT-PCR 對腓腸肌AMPK和PGC-1α mRNA 表達量進行檢測,主要步驟如下:參照說明書提取RNA,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果。反轉(zhuǎn)錄過程按試劑盒說明書進行。反轉(zhuǎn)錄總反應體系為20 μl,10 μl 2×RT buffer,1 μl 反轉(zhuǎn)錄引物(100 pmol/μl),1 μl RT-mix,5 μl 模板(RNA),3 μl DEPC水;混勻后25℃10 min,加入反轉(zhuǎn)錄酶2 μl,42℃50 min,85℃15 min。反應條件:94℃4 min、94℃20 s、60℃20 s、72℃20 s,循環(huán)35次、72℃檢測。每個樣本重復三次取均值,相對表達量=2-△△Ct。

    1.4.2 Western Blot 檢測腓腸肌AMPK和PGC-1α 蛋白表達

    取50 mg 腓腸肌組織液氮研磨,勻漿裂解,4°C 12000 r/min 離心5 min,取上清,用考馬斯亮藍法測定總蛋白含量。采用BCA法測定蛋白濃度。SDS-PAGE電泳,抗體稀釋比例見表1。ECL 發(fā)光液(Millipore,美國)顯影后用Image J軟件進行圖像灰度值分析。

    1.5 統(tǒng)計學分析

    所有數(shù)據(jù)通過SPSS19.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理。所有數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布,結(jié)果用平均值±標準差表示,采用單因素方差分析比較各組均值的差異是否具有統(tǒng)計學意義,以P<0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

    表1 抗體稀釋比例及來源

    2 結(jié)果

    2.1 體重及腎周、附睪脂肪重量

    2.1.1 訓練期間大鼠體重變化情況

    由表2可以看出,在8周的訓練期間,第1周時,OA組的體重低于OC 組(P<0.05);從第2 周到訓練結(jié)束,OA組和HIIT組的體重均低于OC組(P<0.01),但OA組與HIIT組之間無顯著性差異。

    表2 訓練期間大鼠體重變化

    2.1.2 干預后大鼠腎周、附睪脂肪重量

    從圖1 可以看出,與OC 組相比,HIIT 組腎周和附睪脂肪重量均下降(P<0.01);OA組腎周和附睪脂肪重量均下降(P<0.05,P<0.01)。HIIT 組腎周和附睪脂肪重量較OA組分別低21.3%和22.4%,但無顯著性差異。

    圖1 各組大鼠腎周脂肪重量及附睪脂肪重量

    從圖2 可以看出,OA和HIIT 組的脂體比低于OC組,但只有HIIT組有顯著性差異(P<0.05)。OA組脂體比較OC 組低了24.1%,HIIT 組脂體比較OA 組低了22.2%,但均無顯著性差異。

    圖2 各組大鼠脂體比圖

    2.2 血脂結(jié)果

    圖3 顯示,與OC 組相比,HIIT 組TC、TG和LDL-C均降低,有顯著性差異(P<0.01,P<0.05,P<0.05);與OC組相比,OA組TC降低,有顯著性差異(P<0.01),而TG、LDL-C也有不同程度的下降,但不具顯著性差異。HIIT 組TC、TG和LDL-C 雖然較OA 組均下降,但不具顯著性差異。三組間HDL-C無顯著性差異。

    圖3 各組大鼠血脂水平

    2.3 腓腸肌AMPK和PGC-1α mRNA及蛋白表達情況

    2.3.1 腓腸肌AMPK mRNA及蛋白表達情況

    圖4 顯示,與OC 組相比,HIIT 組AMPK mRNA 表達量上調(diào)9.6%,有顯著性差異(P<0.05);與OA組相比,高出104%,有顯著性差異(P<0.01)。而OA 組AMPK mRNA 表達量與OC 組相比出現(xiàn)下調(diào),有顯著性差異(P<0.01)。

    圖5顯示,與OC組相比,HIIT組和OA組AMPK 蛋白相對表達量分別上調(diào)11%和10%(P<0.05)。HIIT組AMPK 蛋白相對表達量與OA組無顯著性差異。

    圖4 各組AMPK mRNA表達

    2.3.2 腓腸肌PGC-1α mRNA及蛋白表達情況

    由圖6 可以看出,與OC 組相比,HIIT 組和OA 組PGC-1α mRNA 表達量分別上調(diào)520%和860%,有顯著性差異(P<0.01)。與OA 組相比,HIIT 組PGC-1α mRNA下調(diào)35.4%,有顯著性差異(P<0.01)。

    圖5 各組AMPK蛋白表達

    圖6 各組PGC-1α mRNA表達

    由圖7 可以看出,與OC 組相比,HIIT 組和OA 組PGC-1α蛋白表達量分別上調(diào)9%和18%,但無顯著性差異;OA組雖然高于HIIT組7%,但無顯著性差異。

    3 討論

    3.1 HIIT對體重、腎周及附睪脂肪重量的影響

    研究表明,單純有氧運動干預可以減輕體重[25,26],且男性下降幅度大于女性[27]。本研究中,8周有氧運動干預期間,OA組大鼠體重基本穩(wěn)定,而OC組體重以每周大約20 g 左右的速度增長,且干預后腎周脂肪和附睪脂肪重量分別低于OC 組38.0%和53.3%,說明有氧運動對抑制體重增長有明顯作用。

    長期有氧運動具有不錯的減肥效果,但是在日常實施過程中難在堅持。已有研究證明,在受試者身體條件允許的前提下,大強度間歇運動能達到更好的減肥效果[9,28]。對于減脂肪來說,運動中和運動后總能量消耗比單純運動中的能量消耗更重要。本研究中,8周運動干預后,HIIT組體重與干預前相比變化很小,腎周和附睪脂肪均顯著低于OC 組,且脂體比相對OC 組有顯著性差異,這表明HIIT 具有良好的降低體重的效果。一般認為HIIT 以肌糖原供能為主,但有研究證明HIIT干預過程中主要以有氧氧化供能為主[6,9]。在HIIT干預后觀察到生長激素、甲狀腺素分泌增加[29],導致機體靜息代謝率提高,引起脂肪消耗增加。另外,HIIT使瘦體重增加[30,31],而肌肉質(zhì)量增加能提高基礎代謝水平,進而使得脂肪消耗增多。

    比較HIIT和OA 組體重、腎周和附睪脂肪重量變化可以發(fā)現(xiàn),雖然HIIT組體重略高于OA組,但HIIT組腎周和附睪脂肪重量以及脂體比均低于OA組,這說明HIIT組在降低體脂的同時能有效提高瘦體重,提示HIIT在減少腎周和附睪脂肪方面較有氧運動效果好。究其原因可能是,HIIT由于強度較高,對機體產(chǎn)生的刺激程度要大于有氧運動,增加了運動中的能量消耗;而且有研究顯示,HIIT 干預后,脂肪氧化率顯著提高[32],使得HIIT運動過程中和運動后恢復期的總消耗量大于單純有氧運動,因此導致HIIT 組腎周和附睪脂肪重量低于OA組。運動在引起脂肪下降的同時促進肌肉生長,使瘦體重增加[30,31,33]。因此,本研究認為,HIIT和有氧運動均可顯著降低肥胖大鼠的體重、腎周和附睪脂肪重量,且HIIT 降低腎周和附睪脂肪重量以及改善瘦體重的效果優(yōu)于有氧運動。

    3.2 HIIT對血脂的影響

    研究已經(jīng)證實,運動對改善肥胖機體的脂代謝紊亂有較好的效果[2,19]。運動對TC、HDL-C、LDL-C的影響與運動方式、運動時間以及運動者自身的健康狀態(tài)有關(guān),長時間中、小強度有氧運動會引起TC和LDL-C的降低[34],而對HDL-C的影響結(jié)論不一致。有研究發(fā)現(xiàn),有氧運動2個小時以上或能量消耗超過900 kcal時,HDL-C才會出現(xiàn)顯著下降,認為運動時間和運動強度是影響HDL-C 水平的主要因素[35];大部分的研究認為有氧運動可以提高HDL-C[2,19]。本研究中,OA 組的TC低于OC組;與OC組相比,OA組HDL-C無顯著性差異,可能與運動時間有關(guān);與OC 組相比,OA 組LDL-C雖然無顯著性差異,但降低了15%。HIIT 組的TC和LDL-C均顯著低于OC組,HDL-C與OC組相比無顯著性差異。HIIT組的TC、LDL-C均低于OA組,但兩組之間無顯著性差異。

    本研究中,OA 組TG 與OC 組之間無顯著性差異;HIIT 組TG 顯著低于OC 組(P<0.05)。已有研究證明,耐力訓練可以顯著提高長跑運動員的血漿脂蛋白脂肪酶活性,提高TG 清除率;中低強度的耐力運動有利于血漿TG的降低和肝臟TG的轉(zhuǎn)運。而HIIT 對TG的影響尚未有統(tǒng)一結(jié)論,有研究認為HIIT 可以顯著降低TG[2,34],也有研究證明HIIT 對TG 不會產(chǎn)生明顯影響[19]。本研究認為HIIT和有氧運動均能通過降低肥胖大鼠血清TC、TG和LDL-C 水平,改善血脂狀況,且HIIT對TG和LDL-C的改善效果優(yōu)于有氧運動。

    3.3 HIIT對AMPK、PGC-1α的影響

    3.3.1 HIIT對AMPK的影響

    AMPK 是異源三聚體蛋白,包括催化亞基α1、α 2,支架亞基β1、β2,以及核苷酸結(jié)合亞基γ1、γ2、γ3[36]。AMPK是細胞的能量變化感受器[16,36],可通過啟動脂肪酸氧化和糖酵解等分解代謝途徑來增加ATP的產(chǎn)生,同時又可以關(guān)閉脂肪酸和蛋白合成等合成代謝途徑來減少ATP的消耗。運動時AMP/ATP 發(fā)生變化,進而激活AMPK。梁春瑜等[7]在觀察HIIT 運動對AMPK 影響時發(fā)現(xiàn),第2 周時HIIT 組的AMPK 蛋白表達量顯著高于安靜對照組和中等強度運動組;而第4周、6周、10周時其表達水平無顯著性差異。本研究中8 周干預后,HIIT 組AMPK mRNA的表達量顯著高于OC 組和OA組,而OA組表達量顯著低于OC組和HIIT組。有研究顯示,以雄性SD 大鼠為研究對象,與安靜組相比,AMPK 活性在小強度運動時不變,中到大強度運動時分別增加50%和180%,表明AMPK的激活程度與運動強度成正相關(guān)[17]。OA 組的表達量為什么會低于OC組?可能是長時間的低強度運動干預,機體的適應性改變導致其表達量降低[7,37]。

    圖7 各組PGC-1α蛋白表達

    從AMPK蛋白表達量的結(jié)果來看,HIIT組和OA組分別高于OC 組11%和10%。這與AMPK mRNA的表達并不一致,OA 組AMPK mRNA 表達量顯著低于OC組,而OA 組蛋白表達則顯著高于OC 組,但HIIT的AMPK mRNA和蛋白表達基本一致。從結(jié)果可以看出,8周的HIIT能顯著提高大鼠骨骼肌AMPK的mRNA和蛋白表達量。有氧運動后大鼠腓腸肌AMPK mRNA表達水平顯著性下降,但AMPK 蛋白表達量有顯著升高,結(jié)合本研究運動干預方案分析,可能是有氧運動適應后隨著AMPK 蛋白表達量的升高,引起AMPK mRNA表達水平適應性下調(diào)。

    3.3.2 HIIT對PGC-1α的影響

    脂肪是安靜狀態(tài)和運動過程中重要的供能物質(zhì),長鏈脂肪酸需在線粒體內(nèi)經(jīng)β氧化才能被分解,而長鏈脂肪酸不能直接進入線粒體,需在肌細胞漿內(nèi)活化為脂酰CoA 后才能通過載體運輸,跨過線粒體膜進而被分解。肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1(CPT-1)和中鏈?;o酶A脫氫酶(MCAD)是脂酰CoA進入線粒體的重要酶,在脂肪酸氧化中起著重要作用。解偶聯(lián)蛋白3(UCP3)可通過氧化磷酸化促進ATP 合成,促進脂肪酸β氧化,其表達增加表明骨骼肌脂肪酸氧化增強[21],而PGC-1α可以上調(diào)UCP3 在骨骼肌的表達來提高骨骼肌中脂肪酸的氧化速率[38]。已有研究證明,PGC-1α能夠調(diào)節(jié)機體適應性產(chǎn)熱、糖脂代謝和血糖平衡[19],參與線粒體生物合成,提高線粒體的呼吸與氧化能力[20,21],通過調(diào)節(jié)CPT-1、UCP3和MCAD[39]功能進而影響脂肪的氧化。因此,PGC- 1α被認為是影響肥胖的一個重要因素。

    研究證實,急性和長期運動均能增加骨骼肌PGC-1α的表達[40-42],本研究中,HIIT 組和OA 組PGC-1α mRNA 表達量都顯著高于OC 組,這與之前的研究一致。還有研究發(fā)現(xiàn),不同強度的一次性跑臺運動后,大鼠骨骼肌PGC-1α mRNA表達量與運動強度成正相關(guān)[43],但本研究中OA 組卻顯著高于HIIT 組(P<0.01),這可能與運動強度、運動干預時間以及實驗對象為肥胖大鼠有關(guān)。HIIT 組和OA 組PGC-1α蛋白表達量分別高于OC組9%和18%,但無顯著性差異,且兩者之間亦無顯著性差異。這與之前的研究結(jié)果基本一致,但本研究中HIIT組PGC-1α蛋白表達低于OA組,其原因可能是在HIIT干預后,PGC-1α的蛋白表達會有一個先上升后下降再小幅上升的趨勢,8周的訓練時間可能正處于其表達的下降期,有研究證明10 周HIIT 對PGC-1α的蛋白表達有顯著促進作用[7]。

    3.3.3 HIIT對AMPK-PGC-1α通路的影響

    環(huán)境、能量、Ca2+濃度以及激素的變化均可以引起PGC-1α蛋白表達量的變化,但運動引起的PGC-1α蛋白表達量的變化主要與AMPK參與的能量變化過程有關(guān)[41,44]。有研究表明,有氧耐力運動[40]和HIIT[7,45]均可引起PGC-1α表達量的增加,AMPK的激活能誘導PGC-1α 表達的增 加,以 上 研 究 顯 示PGC-1α 是AMPK的下游靶點之一。PGC-1α一方面可以直接對骨骼肌脂代謝進行調(diào)控,另一方面也可以通過促進線粒體生物合成加快脂肪酸的氧化來達到減肥的目的。

    本研究結(jié)果顯示,有氧運動后肥胖大鼠腓腸肌AMPK mRNA 表達水平顯著性下降,但AMPK 蛋白表達量有顯著升高;而PGC-1α mRNA和蛋白表達均有所升高。結(jié)合本研究運動干預方案分析,有氧運動適應后隨著AMPK 蛋白表達量的升高,AMPK mRNA 表達水平適應性下調(diào),而PGC-1α mRNA 則隨著AMPK蛋白的調(diào)節(jié)呈現(xiàn)表達上調(diào)趨勢,這提示有氧運動可能通過調(diào)節(jié)AMPK-PGC-1α通路,改善脂代謝。

    HIIT可以顯著提高肥胖大鼠腓腸肌AMPK mRNA和蛋白以及PGC-1α mRNA和蛋白表達量。比較有氧運動發(fā)現(xiàn),HIIT隨著運動強度的增加,作用于機體的負荷強度增強,使得肥胖大鼠腓腸肌AMPK mRNA 表達上升,持續(xù)高強度運動干預使得AMPK和PGC-1α蛋白表達水平升高,這表明HIIT 作用方式和影響程度有別于有氧運動,提示HIIT 可以通過激活AMPK/PGC-1α通路,加快脂肪酸氧化達到減肥目的。另外,HIIT組和有氧運動組AMPK和PGC-1α蛋白表達量均高于安靜對照組,說明運動可以激活AMPK/PGC-1α通路,并且HIIT激活作用大于有氧運動。HIIT組AMPK蛋白表達稍微高于OA 組,而PGC-1α蛋白表達低于OA 組,AMPK和PGC-1α蛋白表達變化趨勢不一致,提示AMPK 可能不是誘導PGC-1α表達增加的唯一因素。有研究顯示,P38MAPK-ATF-PGC-1α 信號通路在PGC-1α的表達中有重要作用,Ca2+和CaMKⅡ也是影響PGC-1α表達的重要因子[46]。

    4 結(jié)論

    (1)8 周HIIT和有氧運動均能顯著減少肥胖大鼠的體重、腎周和附睪脂肪重量、脂體比,降低血清TC、TG和LDLC水平,改善血脂情況,且HIIT效果優(yōu)于有氧運動。

    (2)HIIT和有氧運動兩種運動方式均能通過影響AMPK/PGC- 1α通路調(diào)節(jié)機體脂代謝,但兩種作用產(chǎn)生的機制可能存在差異,且HIIT效果更明顯。

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