• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    番茄DNA甲基轉(zhuǎn)移酶SlDNMT2基因RNAi表達(dá)載體的構(gòu)建

    2020-04-01 04:45:23張玉汪宏濤劉嘉荔
    安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) 2020年3期
    關(guān)鍵詞:DNA甲基化番茄

    張玉 汪宏濤 劉嘉荔

    摘要 DNA甲基化是發(fā)生在基因5′端5′-CpG-3′胞嘧啶上的DNA共價(jià)修飾作用,可調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄,與植物的生長(zhǎng)、發(fā)育、成熟、衰老有著密切關(guān)系。DNMT2是首先從擬南芥中發(fā)現(xiàn)的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶。該研究通過(guò)NCBI序列比對(duì)獲得番茄中DNMT2的同源基因SlDNMT2的編碼區(qū)序列;通過(guò)Primer5設(shè)計(jì)引物,PCR技術(shù)擴(kuò)增獲得SlDNMT2基因高度特異性序列(長(zhǎng)度約500 bp);利用一系列分子生物學(xué)試驗(yàn)研究方法最終成功構(gòu)建SlDNMT2 RNAi表達(dá)載體,并命名為pBI121-35S∷siRNA1-siRNA2。該RNAi表達(dá)載體的構(gòu)建為進(jìn)一步探究SlDNMT2基因在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的功能奠定了一定的理論基礎(chǔ)并提供了一條高效、迅速的載體構(gòu)建途徑。

    關(guān)鍵詞 番茄;DNA甲基化;SlDNMT2;RNAi;載體構(gòu)建

    中圖分類(lèi)號(hào) Q5-33 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611(2020)03-0097-04

    Abstract DNA methylation is a covalent modification of DNA that occurs at the 5′CpG3′ cytosine at the 5′ end of the gene,it regulates gene transcription and is closely related to plant growth, development, maturation and aging.DNMT2 is a key enzyme in DNA methylation which was found in Arabidopsis. In this study, firstly, the sequence of the coding region of SlDNMT2 was obtained by NCBI sequence alignment. And then the highly specific sequences of SlDNMT2 gene were acquired by polymerase chain reaction, and the primers were designed by Primer 5. Finally, taking advantage of a series of molecular biological experiment study methods,the SlDNMT2 RNAi expression vector was constructed successfully, and named PBI12135S∷siRNA1siRNA2. The construction of the RNAi expression vector not only laid the theoretical foundation for further exploring the SlDNMT2 genes function in plant growth and development stage but also provided an efficient and rapidly way of vector construction.

    Key words Tomato;DNA methylation;SlDNMT2;RNAi;Construction of vector

    番茄(Solanum lycopersicum)屬茄科番茄屬植物,是一種草本植物[1],其最早發(fā)源于南美洲,17世紀(jì)傳入亞洲。直至18世紀(jì),番茄開(kāi)始被作為食用植物栽培,此外番茄還具有一定藥用價(jià)值[2]。至今,番茄被廣泛種植于世界各地,具有重要研究意義。DNMT(DNA methyltransferase,DNMTs)是植株DNA甲基化過(guò)程中重要的甲基轉(zhuǎn)移酶。真核生物中有3種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶,分別命名為DNMT1、DNMT2、DNMT3(DNMT3a和DNMT3b)[3]。DNMT1是一種維持DNA甲基化穩(wěn)定性的酶;DNMT2是植物中特有的一種甲基轉(zhuǎn)移酶,其通過(guò)與DNA結(jié)構(gòu)特異位點(diǎn)結(jié)合而發(fā)揮特定作用,但具體機(jī)制研究尚少;DNMT3a和DNMT3b在DNA甲基化過(guò)程中發(fā)揮重要作用,可使去甲基化的胞嘧啶位點(diǎn)重新發(fā)生甲基化過(guò)程[4]。DNA甲基化是一種常見(jiàn)的DNA共價(jià)修飾作用,生物體在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下,以S-腺苷-L-甲硫氨酸(S-adenosyl methionine,SAM)為輔酶,將甲基轉(zhuǎn)移到特定的堿基上[5]。這種共價(jià)修飾通常發(fā)生在基因5′端5′—CpG—3′胞嘧啶上。DNA甲基化修飾可以調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄,與植物的生長(zhǎng)、發(fā)育、成熟、衰老有著密切關(guān)系[6]。

    RNA干擾(RNA interference,RNAi)是一種由于雙鏈RNA導(dǎo)致的基因沉默現(xiàn)象。RNA沉默是一種通過(guò)形成雙鏈RNA,特異性剔除或關(guān)閉目的基因表達(dá)的技術(shù)[7-9]。RNA干擾技術(shù)在進(jìn)化上具有保守性,該技術(shù)將與目的基因mRNA序列同源互補(bǔ)的雙鏈RNA(double strand RNA,dsRNA)轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞,植物細(xì)胞與dsRNA迅速發(fā)生應(yīng)答反應(yīng),在核酸內(nèi)切酶作用下,將dsRNA切割成許多特定的小干擾RNA序列(small interfering RNA,siRNA)[10]。在RNA解旋酶的作用下,siRNA發(fā)生解鏈作用,反義siRNA與核酸內(nèi)切酶、核酸外切酶、RNA解旋酶結(jié)合,進(jìn)一步形成RNA沉默復(fù)合物(RNA-induced silencing complex,RISC)[11]。RISC可與外源性mRNA同源序列發(fā)生特異性結(jié)合作用,對(duì)mRNA進(jìn)行切割,而后降解斷裂的mRNA。此外,在RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRP)作用下,siRNA還可以結(jié)合植物體內(nèi)靶RNA,形成更多新的dsRNA,新dsRNA由核酸內(nèi)切酶切割,進(jìn)一步產(chǎn)生許多次級(jí)siRNA[12-14],從而使RNA干擾的作用逐級(jí)放大,以期達(dá)到完全降解靶mRNA的效果,最終產(chǎn)生相應(yīng)的功能表型缺失。

    該研究通過(guò)NCBI網(wǎng)站Blast獲得番茄植株DNMT2基因編碼序列(coding sequence,CDS),通過(guò)序列保守性分析獲得目的基因的高度特異性序列,PCR擴(kuò)增該高度特異性序列。利用限制性內(nèi)切酶切割pSK載體和特異性序列片段,經(jīng)轉(zhuǎn)化,陽(yáng)性鑒定以及關(guān)鍵性發(fā)夾結(jié)構(gòu)驗(yàn)證,最終獲得番茄植株DNMT2基因RNAi表達(dá)載體。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 植物材料。

    番茄植株是由實(shí)驗(yàn)室繁殖保存的來(lái)自美國(guó)康奈大學(xué)植物研究所的野生型番茄(Solanum lycopersicum Mill.cv.Ailsa Craig)。

    1.1.2 菌株和質(zhì)粒。

    大腸桿菌(Escheriachia coli)DH5α、根瘤農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)EHAl05、植物表達(dá)載體pBI121、PSK均保存于實(shí)驗(yàn)室-80 ℃冰箱。

    1.1.3 試劑。

    限制性內(nèi)切酶、Taq酶、高保真Pfu DNA polymerase、T4 DNA Ligase、Trizol(購(gòu)自Invitrogen公司)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(購(gòu)自TOYOBO公司)。膠回收試劑盒及質(zhì)粒提取試劑盒(購(gòu)自O(shè)mega公司),引物由上海生工技術(shù)有限公司合成,測(cè)序由金唯智技術(shù)有限公司完成。

    1.2 方法

    1.2.1 植物總RNA提取。

    利用試劑盒和Trizol試劑法提取番茄植物總RNA。操作過(guò)程:①取樣,每100 mg組織中加入1 mL TP1溶液。②渦旋振蕩,4 ℃離心,12 000 r/min,5 min。③取上清,加入等體積TPII溶液,顛倒混勻;加入1/4體積氯仿,顛倒混勻,室溫靜置5 min。④4 ℃離心,12 000 r/min,5 min,取上清,加入等體積異丙醇,顛倒混勻,室溫靜置10 min。⑤4 ℃離心,12 000 r/min,10 min,1 mL 75%乙醇清洗2次。⑥通風(fēng)櫥干燥處理后加入30~40 μL RNA溶解沉淀,后通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所提RNA質(zhì)量,最后將樣品保存于-80 ℃冰箱備用。

    1.2.2 mRNA反轉(zhuǎn)錄。

    利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)提取的mRNA反轉(zhuǎn)錄獲得番茄植株cDNA。操作步驟:在20 μL體系中加入如下試劑:①mRNA X μL。②Accurt Reaction Mix(4X)2 μL。③Nudease-Free H2O(8-X) μL。④42 ℃靜置2 min。⑤依次加入:Accurt Reaction stopper(5X)2 μL,5XAu-In-Due-RT-Master Mix 4 μL,Nudease-Free H2O 6 μL。反轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃ 10 min;42 ℃ 50 min;85 ℃ 5 min。⑥儲(chǔ)存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.3 引物設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增。

    利用Primer 5軟件設(shè)計(jì)引物,表1為該研究中所需主要引物。利用PCR技術(shù),擴(kuò)增得到SlDNMT2基因。SlDNMT2目的基因PCR擴(kuò)增程序?yàn)?5 ℃ 3 min;95 ℃ 30 s;引物溫度(℃) 30 s;72 ℃ T(依據(jù)片段長(zhǎng)度設(shè)定時(shí)間,min);72 ℃ 10 min;12 ℃ 60 min。SlDNMT2基因特異性序列PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s;引物溫度(℃) 30 s;72 ℃ T(依據(jù)片段長(zhǎng)度設(shè)定時(shí)間,min);72 ℃ 10 min;12 ℃ 60 min。

    1.2.4 番茄植株SlDNMT2基因RNAi表達(dá)載體的構(gòu)建。

    利用限制性內(nèi)切酶處理pSK-siRNA1-siRNA2陽(yáng)性菌重組質(zhì)粒和pBI121質(zhì)粒,經(jīng)Omega公司膠回收試劑盒回收siRNA1-siRNA2高度特異性片段,T4 DNA連接酶4 ℃過(guò)夜連接,轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌感受態(tài),陽(yáng)性菌鑒定,最終得到番茄植株SlDNMT2基因RNAi表達(dá)載體,并將該載體重新命名為pBI121-35S∷siRNA1-siRNA2。載體構(gòu)建流程見(jiàn)圖1。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 目的基因siRNA序列克隆及檢測(cè)

    2.1.1 SlDNMT2基因生物信息學(xué)分析。

    通過(guò)NCBI網(wǎng)站Blast獲得番茄DNMT2基因的編碼區(qū),其CDS全長(zhǎng)為1 146 bp,共編碼381個(gè)氨基酸。利用Trizol試劑法提取番茄植物總RNA,質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果如圖2所示。將SlDNMT2基因氨基酸序列與擬南芥AtDNMT2進(jìn)行同源性比對(duì)分析,結(jié)果顯示番茄SlDNMT2和擬南芥AtDNMT2的同源性達(dá)62.05%(圖3)。并選取SlDNMT2基因起始密碼子(ATG)至終止密碼子(TGA)的編碼區(qū),利用SGN-VIGS網(wǎng)站,在Solanum_lycopersicum_ITAG _v2.40資料庫(kù)中篩選,最終獲得大小約500 bp的SlDNMT2基因高度特異性序列,并命名為小干擾RNA序列(siRNA)。

    2.1.2 SlDNMT2基因特異性片段克隆。

    以LeDNMT2-F和LeDNMT2-R為引物PCR擴(kuò)增獲得SlDNMT2目的基因片段。而后將SlDNMT2目的基因的PCR產(chǎn)物作為模板,以LeDNMTRi-F1、LeDNMTRi-R1、LeDNMTRi-F2、LeDNMTRi-R2為引物,利用PCR技術(shù)獲得SlDNMT2的高度特異性序列(siRNA),PCR結(jié)果如圖4所示。

    2.2 陽(yáng)性菌鑒定

    2.2.1 siRNA1特異性序列陽(yáng)性鑒定。

    限制性內(nèi)切酶Xho I、Hind Ⅲ酶切pSK載體和特異性序列1(siRNA1),T4 DNA Ligase 4 ℃過(guò)夜連接,轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌感受態(tài),菌落PCR陽(yáng)性鑒定。鑒定結(jié)果如圖5所示,并獲得1號(hào)陽(yáng)性菌質(zhì)粒用Xho I、Hind Ⅲ酶切獲得siRNA1片段,在瓊脂糖凝膠電泳下檢測(cè),結(jié)果如圖6所示。泳道1內(nèi)可以觀察到一條大小約500 bp的特異性條帶,送金唯智技術(shù)有限公司測(cè)序,經(jīng)DNAMAN軟件比對(duì),測(cè)序結(jié)果正確。

    2.2.2 siRNA2特異性序列陽(yáng)性鑒定。

    限制性內(nèi)切酶Sac I、EcoR I酶切上述1號(hào)陽(yáng)性菌質(zhì)粒和特異性序列2(siRNA2),T4 DNA Ligase 4 ℃過(guò)夜連接,轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌感受態(tài),經(jīng)堿裂解法質(zhì)??焯彡?yáng)性鑒定,瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果如圖7所示,獲得16號(hào)陽(yáng)性菌質(zhì)粒。分別用Sac I、EcoR I限制性內(nèi)切酶酶切以及Xho I、EcoR I限制性內(nèi)切酶酶切獲得siRNA2片段(泳道1)及siRNA1-siRNA2片段(泳道2),瓊脂糖電泳檢測(cè)結(jié)果如圖8所示,送金唯智技術(shù)有限公司測(cè)序,經(jīng)DNAMAN軟件比對(duì),測(cè)序結(jié)果正確。

    2.3 發(fā)夾結(jié)構(gòu)的驗(yàn)證

    限制性內(nèi)切酶Xho I、EcoR I酶切上述16號(hào)陽(yáng)性菌質(zhì)粒,膠回收試劑盒回收siRNA1、siRNA2特異性片段,利用純化試劑盒純化后,進(jìn)行發(fā)夾結(jié)構(gòu)驗(yàn)證。經(jīng)95 ℃熱處理5 min后,分別自然退火(22 ℃)和冰上退火(4 ℃)30 min,在0.8%瓊脂糖凝膠電泳下檢測(cè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)的正確性,檢測(cè)結(jié)果如圖9所示。不同處理?xiàng)l件下,2個(gè)泳道內(nèi)均能檢測(cè)到特異性條帶,且條帶大小正確。

    2.4 DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶SlDNMT2基因RNAi表達(dá)載體正確性檢測(cè)

    限制性內(nèi)切酶Xho I、EcoR I酶切pBI121-siRNA1-siRNA2陽(yáng)性菌質(zhì)粒,經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),根據(jù)電泳條帶的顯色位置,以確定SlDNMT2基因RNAi表達(dá)載體構(gòu)建的正確性,酶切后電泳結(jié)果如圖10所示,4個(gè)陽(yáng)性重組質(zhì)粒經(jīng)酶切后均能獲得大小約1 200 bp的特異性條帶。

    3 結(jié)論與討論

    3.1 RNA干擾技術(shù)中特異性序列的選擇

    在構(gòu)建SlDNMT2RNAi表達(dá)載體的過(guò)程中關(guān)鍵是特異性序列的選擇,該研究通過(guò)NCBI網(wǎng)站序列比對(duì)作用,選擇番茄植株編碼區(qū)內(nèi)高度特異性序列(約500 bp)設(shè)計(jì)引物,進(jìn)而添加酶切位點(diǎn),最終通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增獲得了SlDNMT2基因高度特異性序列。

    3.2 RNAi表達(dá)載體構(gòu)建中陽(yáng)性鑒定

    利用RNA沉默技術(shù)構(gòu)建RNAi表達(dá)載體。在此過(guò)程中,發(fā)夾結(jié)構(gòu)的鑒定是構(gòu)建 pBI12135S∷siRNA1-siRNA2表達(dá)載體是否成功的關(guān)鍵。

    根據(jù)重組質(zhì)粒pBI12135S∷siRNA1-siRNA2與空載pBI121載體質(zhì)粒分子量大小不同,其在1%瓊脂糖凝膠中的遷移速率不同,通過(guò)質(zhì)??焯嵩囼?yàn)鑒定陽(yáng)性菌;利用限制性內(nèi)切酶酶切,膠回收,不同退火溫度處理后,在瓊脂糖凝膠電泳下檢測(cè)發(fā)夾結(jié)構(gòu),根據(jù)DNA條帶的位置驗(yàn)證發(fā)夾結(jié)構(gòu)正確性,最終,成功構(gòu)建植物SlDNMT2基因RNAi表達(dá)載體。

    3.3 RNA干擾技術(shù)的意義與前景

    RNA沉默技術(shù)是分析基因功能的有效途徑之一。通過(guò)RNA干擾能特異性阻斷目的基因的表達(dá),獲得缺失特定功能的RNAi突變體,進(jìn)而對(duì)目的基因的功能進(jìn)行分析[15]。RNAi技術(shù)為分析目的基因的功能提供了一種快速、高效的途徑。

    參考文獻(xiàn)

    [1] DE PABLO VALENCIANO J P,URIBE TORIL J.Control system of management for intensive cultivation activity in tomato production:Spanish case[J].Journal of agricultural science & technology,2018,17(1):11-21.

    [2] ZHANG Y T,ZHANG Y Q,YANG Q C,et al.Overhead supplemental farred light stimulates tomato growth under intracanopy lighting with LEDs[J].Journal of integrative agriculture,2019,18(1):62-69.

    [3] QIU J,ZHANG Y N,ZHENG X W,et al.Notch promotes DNMTmediated hypermethylation of Klotho leads to COPDrelated inflammation[J].Experimental lung research,2018,44(7):368-377.

    [4] RHEE I,BACHMAN K E,PARK B H,et al.DNMT1 and DNMT3b cooperate to silence genes in human cancer cells[J].Nature,2002,416(6880):552-556.

    [5] KUNERT N,MARHOLD J,STANKE J,et al.A Dnmt2like protein mediates DNA methylation in Drosophila[J].Development,2003,130(21):5083-5090.

    [6] OKANO M,BELL D W,HABER D F A,et al.DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b are essential for de novo methylation and mammalian development[J].Cell,1999,99(3):247-257.

    [7] TASSETTO M,KUNITOMI M,ANDINO R.Circulating immune cells mediate a systemic RNAibased adaptive antiviral response in Drosophila[J].Cell,2017,169(2):314-325.

    [8] ZAMORE P D,TUSCHL T,SHARP P A,et al.RNAi:Doublestranded RNA directs the ATPdependent cleavage of mRNA at 21 to 23 nucleotide intervals[J].Cell,2000,101(1):25-33.

    [9] 伍國(guó)強(qiáng),劉海龍,李勝勝,等.甜菜內(nèi)向整流K+通道BvAKT1基因RNAi載體的構(gòu)建[J].分子植物育種,2019,17(1):112-118.

    [10] 潘琦,岳建蘇,王翠倫,等.桔小實(shí)蠅鈉離子通道基因和P450基因RNAi載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化[J].分子植物育種,2019,17(2):471-477.

    [11] PAN Y,DONG Y,WANG R X,et al.Generation of a promising universal RNAi vector system to control plant pests[J].Acta physiologiae plantarum,2019,41(1):18.

    [12] SMITH J A,WHITE E A,SOWA M E,et al.Genomewide siRNA screen identifies SMCX,EP400,and Brd4 as E2dependent regulators of human papillomavirus oncogene expression[J].Proceedings of the national academy of sciences of the United States of America,2010,107(8):3752-3757.

    [13] CHAUDHARY S,DUTTA T K,SHIVAKUMARA T N,et al.RNAi of esophageal glandspecific gene Mimsp1 alters early stage infection behaviour of rootknot nematode,Meloidogyne incognita[J].Journal of general plant pathology,2019,85(3):232-242.

    [14] ZOU L N,WU D,ZANG X,et al.Construction of a germlinespecific RNAi tool in C.elegans[J].Scientific reports,2019,9(1):1-10.

    [15] DAVIS E,CAIMENT F,TORDOIR X,et al.RNAimediated allelic transinteraction at the imprinted Rtl1/Peg11 locus[J].Current biology,2005,15(8):743-749.

    猜你喜歡
    DNA甲基化番茄
    番茄炒蛋
    秋茬番茄“疑難雜癥”如何挽救
    番茄果實(shí)“起棱”怎么辦
    冬天的番茄為啥不太好吃
    啟蒙(3-7歲)(2018年2期)2018-03-15 08:03:44
    白虎加桂枝湯對(duì)熱痹模型大鼠特征性甲基化基因表達(dá)的影響
    桃甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性MSAP技術(shù)體系的建立
    胃癌中DNA甲基化對(duì)microRNA調(diào)控作用的研究進(jìn)展
    阿爾茨海默病小鼠模型海馬組織AtP5a1基因甲基化改變
    番茄炒蛋做成功啦
    DNA甲基化對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控研究
    色尼玛亚洲综合影院| 国产亚洲精品av在线| 亚洲av中文av极速乱 | 欧美区成人在线视频| 午夜精品久久久久久毛片777| 成人无遮挡网站| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 精品午夜福利在线看| 内射极品少妇av片p| 可以在线观看毛片的网站| 亚洲国产色片| 久久国内精品自在自线图片| 亚洲av美国av| 国产午夜福利久久久久久| 欧美最新免费一区二区三区| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 在线国产一区二区在线| 日本 欧美在线| 两个人视频免费观看高清| 听说在线观看完整版免费高清| 欧美精品国产亚洲| 99热只有精品国产| 两个人的视频大全免费| 日本黄色视频三级网站网址| 精品午夜福利视频在线观看一区| 99热这里只有是精品在线观看| 亚洲欧美激情综合另类| 欧美成人性av电影在线观看| 他把我摸到了高潮在线观看| 精品人妻1区二区| 婷婷精品国产亚洲av在线| 欧美一区二区精品小视频在线| 国产黄片美女视频| 国产伦一二天堂av在线观看| 久久久久久久久久成人| 日韩国内少妇激情av| 国产精品亚洲美女久久久| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 乱码一卡2卡4卡精品| 亚洲国产精品久久男人天堂| 国产单亲对白刺激| 啦啦啦啦在线视频资源| 欧美xxxx性猛交bbbb| 国产淫片久久久久久久久| 99国产精品一区二区蜜桃av| 观看美女的网站| 极品教师在线免费播放| 欧美性感艳星| 一级毛片久久久久久久久女| 欧美性感艳星| 免费大片18禁| 91在线精品国自产拍蜜月| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 国产精品女同一区二区软件 | 淫妇啪啪啪对白视频| 观看免费一级毛片| 别揉我奶头 嗯啊视频| 欧美高清性xxxxhd video| 欧美极品一区二区三区四区| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 两人在一起打扑克的视频| 99精品久久久久人妻精品| 日韩 亚洲 欧美在线| 午夜精品久久久久久毛片777| 精品人妻熟女av久视频| 好男人在线观看高清免费视频| 桃红色精品国产亚洲av| 亚洲欧美清纯卡通| 国产亚洲精品久久久com| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| www.www免费av| 国产精品嫩草影院av在线观看 | 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 国产单亲对白刺激| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 在线免费十八禁| 能在线免费观看的黄片| 国产淫片久久久久久久久| 美女 人体艺术 gogo| 99精品久久久久人妻精品| 熟女人妻精品中文字幕| 成人av在线播放网站| 能在线免费观看的黄片| 成人性生交大片免费视频hd| 在线免费十八禁| 两人在一起打扑克的视频| 老司机午夜福利在线观看视频| 99热这里只有精品一区| 日韩欧美在线二视频| av黄色大香蕉| 免费观看精品视频网站| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 给我免费播放毛片高清在线观看| 国产精品久久视频播放| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 久久九九热精品免费| 1024手机看黄色片| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 99热这里只有是精品在线观看| 国产精品久久久久久久久免| 九九爱精品视频在线观看| 久久久久久久亚洲中文字幕| 成人综合一区亚洲| 99久久精品一区二区三区| 精品国内亚洲2022精品成人| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 亚洲成av人片在线播放无| 亚洲精华国产精华液的使用体验 | 国产黄色小视频在线观看| 最近中文字幕高清免费大全6 | 极品教师在线视频| 中出人妻视频一区二区| 如何舔出高潮| 女的被弄到高潮叫床怎么办 | 亚洲欧美日韩无卡精品| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 天堂动漫精品| 我要看日韩黄色一级片| 69av精品久久久久久| 精品久久久久久久末码| 在现免费观看毛片| 麻豆av噜噜一区二区三区| 性欧美人与动物交配| 日本三级黄在线观看| 午夜精品一区二区三区免费看| 99热这里只有是精品50| 可以在线观看毛片的网站| 伦精品一区二区三区| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 国产精品福利在线免费观看| eeuss影院久久| 深夜精品福利| 天美传媒精品一区二区| 在线观看午夜福利视频| 午夜精品久久久久久毛片777| 久久久国产成人精品二区| 日韩欧美在线二视频| 成人欧美大片| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 亚洲国产高清在线一区二区三| 人妻夜夜爽99麻豆av| 国产男靠女视频免费网站| 国内揄拍国产精品人妻在线| 深夜精品福利| 我要看日韩黄色一级片| 99国产精品一区二区蜜桃av| 在现免费观看毛片| 免费看日本二区| 亚洲在线观看片| 伊人久久精品亚洲午夜| 熟女电影av网| 久久欧美精品欧美久久欧美| 国产主播在线观看一区二区| 九九热线精品视视频播放| 天天躁日日操中文字幕| 午夜老司机福利剧场| 三级毛片av免费| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 精品国内亚洲2022精品成人| 欧美激情久久久久久爽电影| 国产一区二区三区视频了| 村上凉子中文字幕在线| 色吧在线观看| 日本免费a在线| videossex国产| 亚洲人与动物交配视频| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 久久香蕉精品热| 国产av在哪里看| 高清日韩中文字幕在线| 国产一区二区激情短视频| 亚洲黑人精品在线| 麻豆成人午夜福利视频| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 91麻豆精品激情在线观看国产| 久久久久久久午夜电影| 免费观看人在逋| 1024手机看黄色片| 亚洲美女搞黄在线观看 | 久久久精品大字幕| 久久久久久久久久成人| 人妻夜夜爽99麻豆av| 婷婷六月久久综合丁香| 亚洲无线在线观看| 亚洲五月天丁香| 久久精品国产亚洲网站| 观看免费一级毛片| 国产午夜精品论理片| 国内精品美女久久久久久| 亚洲国产精品sss在线观看| 国产精品免费一区二区三区在线| 国产精品爽爽va在线观看网站| 午夜老司机福利剧场| 成人鲁丝片一二三区免费| 两人在一起打扑克的视频| 国产单亲对白刺激| 日韩一区二区视频免费看| 黄色日韩在线| 成人三级黄色视频| 久久精品影院6| 国产精品久久视频播放| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 亚洲第一区二区三区不卡| 3wmmmm亚洲av在线观看| or卡值多少钱| 美女cb高潮喷水在线观看| 人妻久久中文字幕网| av在线亚洲专区| 国产午夜福利久久久久久| 精品久久久久久久久亚洲 | 男女那种视频在线观看| 少妇熟女aⅴ在线视频| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 最新中文字幕久久久久| 国产av不卡久久| 午夜福利在线观看吧| 性欧美人与动物交配| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 国产精品亚洲一级av第二区| 国产一区二区在线观看日韩| a级毛片a级免费在线| 一本一本综合久久| 日本在线视频免费播放| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 全区人妻精品视频| 欧美bdsm另类| 听说在线观看完整版免费高清| 国内精品宾馆在线| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 一级a爱片免费观看的视频| 极品教师在线免费播放| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 国产久久久一区二区三区| 亚洲性久久影院| 我的老师免费观看完整版| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 欧美日韩乱码在线| 国产淫片久久久久久久久| 色尼玛亚洲综合影院| 欧美激情久久久久久爽电影| 国产爱豆传媒在线观看| 丰满人妻一区二区三区视频av| 国产精品久久久久久av不卡| 国产亚洲欧美98| 国产伦精品一区二区三区四那| 婷婷精品国产亚洲av| 亚洲精品亚洲一区二区| 亚洲精品色激情综合| 中亚洲国语对白在线视频| 欧美极品一区二区三区四区| 91狼人影院| 日本免费一区二区三区高清不卡| 亚洲精品一区av在线观看| 亚洲精品在线观看二区| 少妇高潮的动态图| 一本精品99久久精品77| 男插女下体视频免费在线播放| 亚州av有码| 麻豆久久精品国产亚洲av| 婷婷精品国产亚洲av| 身体一侧抽搐| 国产精品久久久久久精品电影| 搡老妇女老女人老熟妇| 一级av片app| 特级一级黄色大片| 亚洲精品在线观看二区| 九色成人免费人妻av| 久久午夜亚洲精品久久| 日本三级黄在线观看| 婷婷亚洲欧美| 午夜a级毛片| 久久6这里有精品| 成年免费大片在线观看| 99久久精品一区二区三区| 大型黄色视频在线免费观看| 国国产精品蜜臀av免费| 嫁个100分男人电影在线观看| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 欧美精品啪啪一区二区三区| 22中文网久久字幕| 亚洲精品国产成人久久av| 51国产日韩欧美| 中文字幕久久专区| 国产精品亚洲一级av第二区| 久久久成人免费电影| 夜夜爽天天搞| 欧美成人免费av一区二区三区| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 久久人人精品亚洲av| 乱人视频在线观看| 桃色一区二区三区在线观看| 伦精品一区二区三区| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 最近视频中文字幕2019在线8| 国产麻豆成人av免费视频| 国产av麻豆久久久久久久| 久久精品人妻少妇| 久久久精品欧美日韩精品| 在线看三级毛片| 尾随美女入室| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 亚洲av免费高清在线观看| 国产成人a区在线观看| 国产老妇女一区| 黄色女人牲交| 99riav亚洲国产免费| 精品久久久噜噜| 在线观看av片永久免费下载| 我要看日韩黄色一级片| 啦啦啦啦在线视频资源| 日韩精品中文字幕看吧| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 69人妻影院| 亚洲图色成人| 麻豆成人av在线观看| 久久久久久久久久黄片| 日韩高清综合在线| 老女人水多毛片| 永久网站在线| 色哟哟·www| 免费在线观看成人毛片| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片 | 99久久无色码亚洲精品果冻| 日本在线视频免费播放| 日本成人三级电影网站| 色综合亚洲欧美另类图片| 国产精品免费一区二区三区在线| 亚洲国产精品成人综合色| 99久久精品国产国产毛片| 精品午夜福利视频在线观看一区| 国内精品一区二区在线观看| 91av网一区二区| 嫩草影院入口| 老女人水多毛片| ponron亚洲| 久久人人爽人人爽人人片va| 韩国av在线不卡| 国产伦在线观看视频一区| 无遮挡黄片免费观看| 欧美黑人巨大hd| 久久人妻av系列| 亚洲欧美日韩东京热| 欧美不卡视频在线免费观看| 国产免费av片在线观看野外av| 日本一二三区视频观看| 联通29元200g的流量卡| 久久欧美精品欧美久久欧美| 嫩草影院精品99| 欧美中文日本在线观看视频| 国产免费男女视频| 国内揄拍国产精品人妻在线| 久久午夜亚洲精品久久| 欧美日韩国产亚洲二区| 男女下面进入的视频免费午夜| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 久久国产精品人妻蜜桃| 午夜福利高清视频| 乱人视频在线观看| 国产v大片淫在线免费观看| 少妇高潮的动态图| 色吧在线观看| 一进一出抽搐动态| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 一a级毛片在线观看| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 真实男女啪啪啪动态图| 嫩草影视91久久| 99九九线精品视频在线观看视频| 色av中文字幕| 欧美三级亚洲精品| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 麻豆精品久久久久久蜜桃| .国产精品久久| 国产成人福利小说| 中文字幕免费在线视频6| 在线a可以看的网站| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 99热6这里只有精品| 亚洲国产精品合色在线| 他把我摸到了高潮在线观看| 久久午夜亚洲精品久久| 色综合婷婷激情| 美女免费视频网站| 久久午夜福利片| 九九爱精品视频在线观看| 免费在线观看影片大全网站| 听说在线观看完整版免费高清| 真实男女啪啪啪动态图| av在线观看视频网站免费| 性色avwww在线观看| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 精品久久久久久,| 国模一区二区三区四区视频| 人人妻人人看人人澡| 日本 av在线| 热99re8久久精品国产| 伦精品一区二区三区| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 久久久久性生活片| 久久香蕉精品热| 免费看美女性在线毛片视频| 成熟少妇高潮喷水视频| 亚洲中文字幕日韩| 深爱激情五月婷婷| 别揉我奶头 嗯啊视频| 大型黄色视频在线免费观看| 成人午夜高清在线视频| 久久久久久久亚洲中文字幕| 日日啪夜夜撸| 亚洲欧美清纯卡通| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 久久精品国产自在天天线| 国产淫片久久久久久久久| 国产毛片a区久久久久| 国产av不卡久久| 色视频www国产| 中文亚洲av片在线观看爽| 一夜夜www| 亚洲在线自拍视频| 欧美日韩精品成人综合77777| 在现免费观看毛片| 少妇高潮的动态图| 99在线人妻在线中文字幕| 亚洲美女搞黄在线观看 | 日韩人妻高清精品专区| 男女视频在线观看网站免费| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 精品一区二区免费观看| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 全区人妻精品视频| av在线天堂中文字幕| 国产大屁股一区二区在线视频| 日日啪夜夜撸| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 搡老熟女国产l中国老女人| 久久中文看片网| 老司机福利观看| 老熟妇仑乱视频hdxx| 99国产精品一区二区蜜桃av| 黄色一级大片看看| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 神马国产精品三级电影在线观看| 啪啪无遮挡十八禁网站| 午夜视频国产福利| 99久久中文字幕三级久久日本| 啦啦啦啦在线视频资源| 国产精品一区二区性色av| 69av精品久久久久久| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| www.色视频.com| 免费看av在线观看网站| 日本黄大片高清| 欧美激情在线99| 18+在线观看网站| 欧美黑人欧美精品刺激| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 久久精品人妻少妇| 午夜福利视频1000在线观看| 国产精品乱码一区二三区的特点| 亚洲国产欧美人成| 内地一区二区视频在线| 国产三级中文精品| videossex国产| 亚洲性久久影院| 男女边吃奶边做爰视频| 亚洲天堂国产精品一区在线| 日本与韩国留学比较| 在线免费十八禁| 一区二区三区激情视频| 欧美成人性av电影在线观看| 午夜视频国产福利| 精品乱码久久久久久99久播| 亚洲avbb在线观看| 久久欧美精品欧美久久欧美| 久久国内精品自在自线图片| 看十八女毛片水多多多| 亚洲无线在线观看| 亚洲在线自拍视频| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 99热这里只有是精品在线观看| 12—13女人毛片做爰片一| 嫁个100分男人电影在线观看| 国产乱人伦免费视频| 免费高清视频大片| 国产在视频线在精品| 久久精品国产自在天天线| bbb黄色大片| av福利片在线观看| 69av精品久久久久久| 伦精品一区二区三区| 亚洲精品国产成人久久av| 天堂网av新在线| 丰满的人妻完整版| 特大巨黑吊av在线直播| 此物有八面人人有两片| 国内精品宾馆在线| av天堂中文字幕网| 天天躁日日操中文字幕| 日韩国内少妇激情av| 日韩强制内射视频| 国产精品电影一区二区三区| 精品一区二区免费观看| 婷婷丁香在线五月| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 午夜激情欧美在线| 小说图片视频综合网站| 欧美在线一区亚洲| 欧美人与善性xxx| 精品久久国产蜜桃| 日本一本二区三区精品| 搡女人真爽免费视频火全软件 | 听说在线观看完整版免费高清| 亚洲中文日韩欧美视频| 亚洲内射少妇av| 国产色婷婷99| 五月玫瑰六月丁香| av在线老鸭窝| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 成年女人毛片免费观看观看9| 亚洲欧美日韩无卡精品| aaaaa片日本免费| 亚洲真实伦在线观看| 亚洲成人久久爱视频| 麻豆久久精品国产亚洲av| 男人和女人高潮做爰伦理| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 久久久久久久精品吃奶| 日本熟妇午夜| а√天堂www在线а√下载| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 韩国av一区二区三区四区| or卡值多少钱| a级一级毛片免费在线观看| 日本精品一区二区三区蜜桃| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 婷婷六月久久综合丁香| 色尼玛亚洲综合影院| 成人国产麻豆网| 欧美另类亚洲清纯唯美| 婷婷色综合大香蕉| 又爽又黄无遮挡网站| 美女大奶头视频| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 久99久视频精品免费| 老熟妇仑乱视频hdxx| 久99久视频精品免费| 亚洲av中文av极速乱 | 亚洲一区二区三区色噜噜| 日本欧美国产在线视频| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 春色校园在线视频观看| 永久网站在线| 欧美色视频一区免费| 悠悠久久av| 能在线免费观看的黄片| 日韩欧美 国产精品| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 欧美一区二区精品小视频在线| 亚洲成人久久爱视频| 久久热精品热| 一进一出抽搐动态| 午夜福利在线在线| 成人二区视频| 婷婷色综合大香蕉| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 国产真实伦视频高清在线观看 | 久久久午夜欧美精品| 精品无人区乱码1区二区| 午夜免费成人在线视频| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 村上凉子中文字幕在线| 麻豆av噜噜一区二区三区| 色在线成人网| 国产精品久久久久久久久免| 色噜噜av男人的天堂激情| 99热这里只有精品一区| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 在线播放国产精品三级| 亚洲av美国av| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 亚洲精品国产成人久久av| av在线亚洲专区| 久久久久久久精品吃奶| av福利片在线观看| 一本一本综合久久| 国产乱人视频| aaaaa片日本免费| 一级a爱片免费观看的视频| 99热这里只有精品一区| 香蕉av资源在线| 免费在线观看日本一区| 露出奶头的视频| 亚洲最大成人中文| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 国产黄片美女视频| 国产亚洲av嫩草精品影院| 我的老师免费观看完整版| 国产成人av教育| 美女大奶头视频| 久久精品国产鲁丝片午夜精品 | 久久国产精品人妻蜜桃| 欧美精品国产亚洲| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 毛片一级片免费看久久久久 | 男女下面进入的视频免费午夜| 亚洲美女黄片视频| 亚洲成a人片在线一区二区|