一株綠藻Chlamydomonassp.PD-4產(chǎn)油性能的初步評(píng)價(jià)

摘要 [目的]評(píng)價(jià)綠藻Chlamydomonas sp.PD-4能否作為油藻的備選藻株。[方法]研究該藻基本的生化組成以及不同培養(yǎng)條件下該藻的生長(zhǎng)、油脂含量以及脂肪酸組成，并且觀察該藻的氣浮現(xiàn)象。[結(jié)果]該藻在100 μmol/（m2·s）培養(yǎng)9 d可產(chǎn)25.81%蛋白、18.82%油脂以及23.50%糖。該藻在200 μmol/（m2·s）的光以及氮濃度限制條件下培養(yǎng)，其油脂含量和多不飽和脂肪酸含量都會(huì)進(jìn)一步提高。在較高的光強(qiáng)下靜置培養(yǎng)，該藻可以自身氣浮。[結(jié)論]該藻具有產(chǎn)油微藻的潛力。

關(guān)鍵詞 Chlamydomonas sp.PD-4;生化組成;油脂含量;脂肪酸組成

中圖分類號(hào) Q949.93 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2020）03-0058-03

Abstract [Objective]The research aimed to evaluate the possibility as a candidate for biodiesel production of a green algae Chlamydomonas sp.PD4. [Method]The basic biochemical composition， the capability in the growth， the lipid accumulation and the carbon chain composition of main fatty acid of Chlamydomonas sp.PD4 were studied，the flotation of Chlamydomonas sp.PD4 was also studied.[Result]The algae accumulated 25.81% protein，18.82% total lipid and 23.50% carbonhydrate after 9 d cultured in 100 μmol/（m2·s） radiation. The algae were cultured under the conditions of light of 200 μmol/（m2·s） and nitrogen concentration， and the oil content and polyunsaturated fatty acid content were further improved.The algae was cultured in a resting place at higher light intensity， and the algae could float on its own.[Conclusion]The algae is a valuable and useful oleaginous algae.

Key words Chlamydomonas sp.PD4;Biochemical composition;Lipid content;Fatty acid composition

微藻能源是最具有發(fā)展?jié)摿Φ纳锬茉粗籟1]。目前大規(guī)模培養(yǎng)微藻生產(chǎn)油脂仍存在2個(gè)重要的限制因素：一個(gè)是微藻油脂的產(chǎn)率相對(duì)較低，另一個(gè)是微藻生產(chǎn)和采收成本較高[2]。提高藻種生物量和油脂產(chǎn)量，或用產(chǎn)高附加值產(chǎn)物的藻株生產(chǎn)生物柴油，選擇便于采收的藻株，是降低微藻油成本較為理想的途徑。該研究探討了一株篩選自青島平度澤河中的衣藻。該藻在采樣水體中處于優(yōu)勢(shì)地位且易于氣浮分布于水體表面。通過對(duì)該藻生長(zhǎng)、產(chǎn)油性狀以及自氣浮特性的觀察初步判斷該藻是否具有產(chǎn)油藻的潛力，為后續(xù)研究類似藻株（自身氣?。┳鳛楫a(chǎn)油藻株提供一定的借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料的獲取

在平度澤河與秀水河交匯處取樣。將部分水樣離心、用滅菌蒸餾水洗滌、稀釋后通過平板分離獲得純種藻株P(guān)D-4。

1.2 藻株的分子生物學(xué)鑒定

取20 mL培養(yǎng)的藻細(xì)胞5 000 r/min離心5 min，收集藻細(xì)胞。將藻細(xì)胞于液氮中研磨后轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管。使用TIANGEN植物總DNA試劑盒（TIANGEN）提取基因組DNA，操作方法按照試劑盒說明書進(jìn)行。

DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增，回收試劑盒（OMEGA）純化，連接至pMD18-T質(zhì)粒載體（TaKaR）上，轉(zhuǎn)化后篩選陽(yáng)性菌落到上海桑尼生物技術(shù)有限公司測(cè)序。向NCBI提交測(cè)序結(jié)果，搜索同源序列。

1.3 該藻基本生化組成的測(cè)定

將處于對(duì)數(shù)期的藻接種在柱狀光生物反應(yīng)器中（3 cm×30 cm，玻璃材質(zhì)），通氣、全光照培養(yǎng)，通氣量為0.2 V/V·min，CO2含量為1%。光照強(qiáng)度為100 μmol/（m2·s），培養(yǎng)溫度為（25±1）℃。

培養(yǎng)9 d后，將藻樣離心（Beckman離心機(jī)，美國(guó)Beckman公司）、蒸餾水清洗3次，凍干（低溫冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康）。

蛋白質(zhì)含量的測(cè)定通過Vario EL元素分析儀（德國(guó)Elemtnar公司）測(cè)定N的含量（%），蛋白含量為 N×6.25[3]。

總糖按照蒽酮比色法測(cè)定[4]。

總脂測(cè)定見文獻(xiàn)[5]。

1.4 該藻在不同培養(yǎng)條件下的產(chǎn)油性狀

將處于對(duì)數(shù)期的藻種接種在柱狀光生物反應(yīng)器，通氣、全光照培養(yǎng)，初始接種量為0.15 g/L，通氣量為0.2 V/V·min，CO2含量為1%，培養(yǎng)基為BG11，其中一組NaNO3濃度有所改變。詳見表1。

1.5 該藻氣浮現(xiàn)象的觀察

取一定量的藻細(xì)胞，接種于含150 mL BG11培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，于200 μmol/（m2·s）光強(qiáng)處?kù)o置培養(yǎng)，觀察該藻能否懸浮分層。

另外，將三角瓶中自氣浮的藻（上層）和沉淀到容器底部的藻（下層）分別收集，用透射電鏡對(duì)上下層藻細(xì)胞進(jìn)行結(jié)構(gòu)觀察。電鏡樣品制作方法見文獻(xiàn)[6]。

2 結(jié)果與分析

2.1 藻株鑒定

經(jīng)Blast檢索，結(jié)合細(xì)胞形態(tài)，判斷試驗(yàn)藻株P(guān)D-4為Chlamydomonas sp.。向NCBI提交18sDNA堿基序列后，該藻株序列獲得的登錄號(hào)為JQ247307。

2.2 該藻基本生化組成

該藻經(jīng)全光照培養(yǎng)9 d，其體內(nèi)的蛋白質(zhì)含量最高，為25.81%±0.69%，其次是總糖，為2350%±1.15%，油脂最低，為18.82%±0.73%。僅從蛋白、油脂、多糖含量來講，這株藻稍顯平庸。

2.3 該藻產(chǎn)油性狀分析

從綠藻Chlamydomonas sp.PD-4在不同條件下的產(chǎn)油性狀（表2）可以看出，經(jīng)過9 d的培養(yǎng)，Chlamydomonas sp.PD-4油脂含量為18.63%～26.19%，油脂產(chǎn)率為68～116 mg/（L·d）。與一些公認(rèn)的含油量和油脂產(chǎn)率較高的藻株（表3）相比，其油脂含量和產(chǎn)率并不低，表明該藻株具有作為產(chǎn)油微藻的潛力。

2931%、11.08%、5.14%，另有6.14%的未定性脂肪酸。脂肪酸主要是由C16和C18組成，這與柴油分子15個(gè)左右的碳鏈極其相似[8]。該藻油脂含有較高含量的油酸（C18∶1）。較高含量的油酸增強(qiáng)了生物柴油長(zhǎng)期儲(chǔ)存的氧化穩(wěn)定性[9]，降低了其在寒冷地區(qū)使用時(shí)的冷濾點(diǎn)（CFPP）[10]。因此，Chlamydomonas sp.PD-4抽提的油脂適用于高品質(zhì)的生物柴油的生產(chǎn)。

2.4 該藻自氣浮現(xiàn)象

該藻在較高的光強(qiáng)（200 μmol/（m2·s））下靜止培養(yǎng)3 d就可以觀察到該藻在液面處漂浮了一層，到了第12天，藻體基本都懸浮到水體的上層。透射電鏡的結(jié)果顯示（圖1），上層細(xì)胞和下層細(xì)胞的結(jié)構(gòu)有明顯的區(qū)別。下層細(xì)胞具有莢膜，細(xì)胞內(nèi)有較多的淀粉粒;上層細(xì)胞基本沒有莢膜結(jié)構(gòu)，含有較多的油滴。細(xì)胞構(gòu)成的變化可能是這些藻懸浮的重要原因，而該藻在特定階段易于懸浮的特性便于采收。

在敞開的玻璃容器中培養(yǎng)該藻同樣觀察到自氣浮現(xiàn)象，并且沒有觀察到雜藻污染;在河道采集地某些靜水區(qū)域該藻長(zhǎng)期占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)并在水體上層形成厚厚的一層。在規(guī)模培養(yǎng)中，藻易受捕食者和病原體的侵?jǐn)_，形成雜藻、原生動(dòng)物等污染，導(dǎo)致群落更替或被原生動(dòng)物取代等[11]。該藻在野外能夠長(zhǎng)期占據(jù)優(yōu)勢(shì)，表明該藻對(duì)環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)，對(duì)病蟲害的抵抗力強(qiáng)，這個(gè)特點(diǎn)也使其比較適合大規(guī)模培養(yǎng)。

3 結(jié)論與討論

該試驗(yàn)研究了綠藻Chlamydomonas sp. PD-4基本的生化組成以及不同培養(yǎng)條件下該藻的生長(zhǎng)、油脂含量以及脂肪酸組成，并且觀察了該藻的氣浮現(xiàn)象。結(jié)果表明，該藻在100 μmol/（m2·s）培養(yǎng)9 d可產(chǎn)25.81%蛋白、18.82%油脂以及23.50%糖;該藻在200 μmol/（m2·s）的光以及氮濃度限制條件下培養(yǎng)，其油脂含量和多不飽和脂肪酸含量都會(huì)進(jìn)一步提高;在較高的光強(qiáng)下靜置培養(yǎng)，該藻可以自身氣浮。這表明該藻具有產(chǎn)油微藻的潛力。

Chlamydomonas sp. PD-4因其它生長(zhǎng)快、油脂含量較高、采收方便、對(duì)污染抵抗力強(qiáng)等特點(diǎn)具有一定的培養(yǎng)價(jià)值，也具有一定的潛力來做進(jìn)一步的研究。現(xiàn)有篩選產(chǎn)油藻株時(shí)，通常只關(guān)注了生長(zhǎng)速度、含油量這2個(gè)最核心的相關(guān)參數(shù)，對(duì)于藻的其余性狀則關(guān)注不多。通過該研究可知?dú)飧∮谝后w表層的藻不僅含有較高的油脂含量（油滴較多），而且該性狀便于藻類收集，在一定程度上可能用于產(chǎn)油藻的篩選。

參考文獻(xiàn)

[1] 劉天中，王俊峰，陳林.能源微藻及其生物煉制的現(xiàn)狀與趨勢(shì)[J].生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)，2015（4）：31-39.

[2] 左正三，孫小曼，任路靜，等.微藻生產(chǎn)油脂培養(yǎng)新技術(shù)[J].中國(guó)生物工程雜志，2018，38（7）：102-109.

[3] 夏建榮，高坤山.球形念珠藻的生化組成分析[J].武漢植物學(xué)研究，2002，20（3）：223-224.

[4] 李合生，孫群，趙世杰，等.植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù)[M].北京：高等教育出版社，2000.

[5] 邱昱晶，彭小偉，張維，等.三種不同來源的三角褐指藻的生長(zhǎng)與油脂積累差異[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（24）：14761-14763.

[6] 陳閩，陳曉琳，劉天中，等.不同亞臨界溶劑從微擬球藻濕藻中提取油脂[J].過程工程學(xué)報(bào)，2011，11（3）：380-385.

[7] GONG Y M，JIANG M L.Biodiesel production with microalgae as feedstock：From strains to biodiesel[J].Biotechnology letters，2011，33（7）： 1269-1284.

[8] 劉永定，范曉，胡征宇.中國(guó)藻類學(xué)研究[M].武漢：武漢出版社，2001：254-261.

[9] KNOTHE G.Dependence of biodiesel fuel properties on the structure of fatty acid alkyl esters[J].Fuel Process Technol，2005，86（10）：1059-1070.

[10] STOURNAS S，LOIS E，SERDARI A.Effects of fatty acid derivatives on the ignition quality and cold flow of diesel fuel[J].J Am Oil Chem Soc，1995，72（4）：433-437.

[11] WANG H，ZHANG W，CHEN L，et al.The contamination and control of biological pollutants in mass cultivation of microalgae[J].Bioresour Technol，2013，128：745-750.