線粒體調(diào)控NLRP3炎性復(fù)合體活化的機(jī)制及中藥有效成分干預(yù)作用

南鳳尾 景光嬋 張孟仁

固有免疫應(yīng)答是宿主抵抗病原微生物入侵的第一道防線，能夠啟動和參與適應(yīng)性免疫應(yīng)答。固有免疫細(xì)胞表面存在模式識別受體(pattern recognition receptors, PRRs)，PRRs感受到病原體入侵或內(nèi)源性損傷時(shí)，可與病原微生物表面的病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)或內(nèi)源性損傷來源的損傷相關(guān)分子模式(damage associated molecular patterns, DAMPs)發(fā)生相對特異性的結(jié)合，啟動即時(shí)免疫效應(yīng)。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體家族[nucleotide-binding oligomerization domain (NOD)-like receptors, NLR]是存在胞質(zhì)中的一類重要的PRR，NLR家族中最大的亞家族是含有NACHT-LRR-PYD[NACHT,LRR-and pyrin-domain (PYD)-containing protein, NALP]或稱含NLR家族熱蛋白結(jié)構(gòu)域蛋白(NLR family pyrin domain containing protein, NLRP)的受體家族。大部分NLRP在識別胞質(zhì)中不同的PAMP或DAMP后，能夠形成炎性復(fù)合體。炎性復(fù)合體也稱炎性小體，是由胞質(zhì)中的多種PRR參與組裝的一類多蛋白復(fù)合物，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的主要有4種，即NLRP1炎性復(fù)合體、NLRP3炎性復(fù)合體、IPAF(或稱NLRC3)炎性復(fù)合體和AIM2炎性復(fù)合體。其中，NLRP3炎性復(fù)合體由于可被多種結(jié)構(gòu)不同的配體激活，進(jìn)而參與到痛風(fēng)、腸炎、糖尿病、阿爾茲海默病、動脈粥樣硬化、感染和腫瘤等多種疾病的發(fā)生過程，故而成為目前關(guān)注最多、研究最為深入的一類炎性復(fù)合體[1]。

一、NLRP3炎性復(fù)合體的組成和活化

NLRP3炎性復(fù)合體由3部分構(gòu)成(圖1)：(1)NLRP3蛋白：由3個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成：①C端富含亮氨酸的重復(fù)序列(leucine-rich repeats, LRRs)，負(fù)責(zé)探測和識別PAMPs/DAMPs；②中央是核酸寡聚化結(jié)構(gòu)域(nucleotide-binding and oligomerization domain, NOD)，也稱為NACHT結(jié)構(gòu)域，負(fù)責(zé)參與NLR的寡聚體化和活化；③熱蛋白結(jié)構(gòu)域(pyrin domain，PYD)，位于N端，負(fù)責(zé)結(jié)合接頭分子和效應(yīng)蛋白。(2)凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(apoptosis-associated speck-lilke protein containing a caspase recruitment domain, ASC)，為接頭蛋白。ASC又分為：①caspase募集結(jié)構(gòu)域(caspase-recruitment domain，CARD)，可連接caspase-1前體蛋白；②PYD結(jié)構(gòu)域，以連接NLRP3的同源結(jié)構(gòu)域PYD。(3)caspase-1前體蛋白，為效應(yīng)蛋白。當(dāng)NLRP3識別到PAMPs/DAMPs時(shí)，發(fā)生寡聚化，并與ASC結(jié)合，招募caspase-1前體蛋白，形成NLRP3炎性復(fù)合體，進(jìn)而激活caspase-1，caspase-1屬于促炎蛋白酶，活化的caspase-1通過剪切的方式活化白細(xì)胞介素1β前體(pro-interleukin 1β, pro-IL-1β)和白細(xì)胞介素IL-18前體(pro-interleukin 18, pro-IL-18)，從而釋放大量成熟的IL-1β和IL-18。近年來的研究表明，caspase-1還可介導(dǎo)細(xì)胞焦亡。細(xì)胞焦亡是一種致炎性的程序性的細(xì)胞死亡，可釋放出大量的炎性物質(zhì)，誘發(fā)嚴(yán)重的炎性反應(yīng)[1]。目前研究者認(rèn)為NLRP3炎性復(fù)合體的活化需要兩條信號通路依次激活：(1)啟動步驟：Toll樣受體(Toll-like receptors, TLRs)和其配體相互作用，造成NLRP3 和IL-1β前體被核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)轉(zhuǎn)錄，以完成NLRP3炎性復(fù)合體活化的準(zhǔn)備過程。(2)活化步驟：在持續(xù)的PAMPs或DAMPs刺激下，NLRP3通過NACHT結(jié)構(gòu)域發(fā)生寡聚化，進(jìn)而激活NLRP3炎性復(fù)合體組裝，最終活化效應(yīng)蛋白caspase-1。此外，另一假說認(rèn)為，持續(xù)的鈣離子內(nèi)流可刺激胞內(nèi)鈣離子升高，環(huán)腺甘酸AMP(cyclic AMP，cAMP)降低，介導(dǎo)NLRP3炎性復(fù)合體活化[2]。

圖1 NLRP3炎性復(fù)合體結(jié)構(gòu)示意圖PAMPs. 病原體相關(guān)分子模式；DAMPs. 損傷相關(guān)分子模式； LRRs. 模式識別受體; NOD.NOD樣受體蛋白 3； PYD. 熱蛋白結(jié)構(gòu)域； CARD.caspase募集結(jié)構(gòu)域

二、線粒體在NLRP3炎性復(fù)合體活化中的作用

長期以來，線粒體一直被視為能量工廠，可提供細(xì)胞生命活動所需的能量。研究發(fā)現(xiàn)線粒體還是固有免疫反應(yīng)最基本的信號平臺之一，在NLRP3炎性復(fù)合體的活化過程中發(fā)揮著重要的作用[3](圖1)。

1.NLRP3炎性復(fù)合體活化時(shí)NLRP3的線粒體定位：靜息狀態(tài)下NLRP3位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，受到NLRP3炎性復(fù)合體激活劑作用后，NLRP3和其配體ASC聚集到細(xì)胞核周圍，分布于線粒體外膜與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜形成的偶聯(lián)部位。而且已有研究證明，線粒體相關(guān)適配蛋白(mitochondria-associated adaptor protein, MAVS)不僅可介導(dǎo)NLRP3募集到線粒體，而且在NLRP3促進(jìn)IL-1β產(chǎn)生的過程中也發(fā)揮功能，是NLRP3 炎性復(fù)合體發(fā)揮其最佳活性的關(guān)鍵因素[4]。此外，線粒體特有的心磷脂也是NLRP3炎性復(fù)合體活化必須的因子，受到利奈唑胺刺激后，NLRP3直接與心磷脂結(jié)合，而后NLRP3炎性復(fù)合體活化；反之，心磷脂合成受阻則會造成NLRP3炎性復(fù)合體活化受到干擾[5]。

2.ROS在NLRP3炎性復(fù)合體活化中的作用：機(jī)體受到感染時(shí)，天然免疫細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞)就會發(fā)起防御，并產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen, ROS)，ROS的主要來源是線粒體。損傷的線粒體釋放線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)和線粒體ROS(mitochondrial ROS，mtROS)，這被認(rèn)為是內(nèi)源性損傷信號。在尼日利亞菌素、尿酸和ATP刺激引起mtROS水平升高的細(xì)胞中，mtROS清除劑可明顯減輕NLRP3炎性復(fù)合體的活化。同樣地，在臭氧誘導(dǎo)的小鼠慢性阻塞性肺氣腫模型中，mtROS清除劑也可有效抑制肺組織中NLRP3炎性復(fù)合體的表達(dá)，說明mtROS是NLRP3炎性復(fù)合體的上游信號[6]。在尼日利亞菌素感染的細(xì)胞內(nèi)，氧化的mtDNA可特異性結(jié)合NLRP3，介導(dǎo)NLRP3炎性復(fù)合體活化，從而導(dǎo)致IL-1β釋放增多[7]。而且， mtROS釋放后，線粒體電子傳遞鏈破壞，進(jìn)一步引起NLRP3炎性復(fù)合體活化[8]。大部分研究支持ROS介導(dǎo)了NLRP3炎性復(fù)合體組裝和活化，其作用機(jī)制有待于進(jìn)一步明確。然而，Bauernfeind等的研究卻表明，ROS僅僅參與了其組件NLRP3的引發(fā)階段，與NLRP3炎性復(fù)合體的活化無關(guān)。此外，以利奈唑胺、流感病毒、腦心肌炎病毒(encephalomyocarditis virus, EMCV)處理巨噬細(xì)胞，均能激活NLRP3炎性復(fù)合體，且不需要ROS的參與[7]。

3.鈣信號調(diào)節(jié)NLRP3炎性復(fù)合體的活化：線粒體內(nèi)的鈣離子濃度對于ATP合成、線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的開放及細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鈣信號的調(diào)節(jié)具有重要影響。線粒體內(nèi)鈣離子水平過高會導(dǎo)致線粒體功能障礙，進(jìn)而促進(jìn)NLRP3炎性復(fù)合體的活化。胞外鈣離子濃度升高可刺激G蛋白偶聯(lián)鈣敏感受體，然后活化NLRP3炎性復(fù)合體和caspase-1。六型分泌系統(tǒng)(T6SS)的效應(yīng)分子EvpP能夠通過降低細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平，抑制MAPK-JNK通路進(jìn)而抑制NLRP3炎性復(fù)合體的激活[9]。線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔持續(xù)開放是線粒體損傷的另一特征。有研究者提出持續(xù)的鈣離子內(nèi)流和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的貯存鈣釋放，可刺激線粒體鈣離子負(fù)荷增多和線粒體穩(wěn)態(tài)破壞，引起mtROS水平升高和線粒體通透性增加。這種模型也被用來解釋鈣離子信號在NLRP3炎性復(fù)合體活化中的作用[10]。

4.線粒體分裂蛋白和融合蛋白調(diào)節(jié)NLRP3炎性小體活化：正常情況下，哺乳動物的線粒體通過不斷地分裂、融合維持其形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，保障正常功能。線粒體動員相關(guān)蛋白1(dynamin-related protein 1，DRP1)和線粒體分裂蛋白1(mitochondrial fission protein 1,Fisl)通過相互作用來促進(jìn)線粒體的分裂。線粒體融合蛋白1(Mitofusin 1，Mfn1)和線粒體融合蛋白2(Mitofusin 2，Mfn2)是線粒體外膜相關(guān)蛋白，是線粒體融合的關(guān)鍵蛋白。在DRP1基因敲除小鼠的巨噬細(xì)胞，線粒體異常分裂導(dǎo)致NLRP3依賴的caspase-1激活和IL-1β分泌增加。其機(jī)制可能是增強(qiáng)細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)信號，介導(dǎo)NLRP3分布于線粒體，從而促進(jìn)NLRP3炎性子體的組裝[11]。

水皰性口腔炎病毒引起絲氨酸-蘇氨酸激酶RIP1和RIP3激活時(shí)，RIP1和RIP3可刺激DRP1，引起線粒體異常分裂，造成胞質(zhì)內(nèi)ROS水平升高，導(dǎo)致NLRP3炎性復(fù)合體活化[12]?？屏_索酸可通過促使內(nèi)皮細(xì)胞DRP1 Ser637位點(diǎn)發(fā)生磷酸化，阻止氧化應(yīng)激造成的線粒體分裂，進(jìn)而阻斷NADPH氧化酶2(NADPH oxidase 2, NOX2)信號，抑制NLRP3炎性復(fù)合體的活化[13]。在RNA病毒感染的細(xì)胞中，Mfn2可以和NLRP3 相互作用，誘導(dǎo)NLRP3炎性復(fù)合體活化。更直接的證據(jù)顯示，以流感病毒或EMCV處理Mfn2基因敲除的細(xì)胞后，細(xì)胞中caspase-1以及IL-1β表達(dá)水平顯著降低[14]。以上表明， DRP1功能穩(wěn)定可維持線粒體分裂正常，抑制NLRP3炎性復(fù)合體的活化；而Mfn2則可促進(jìn)NLRP3炎性復(fù)合體的活化，導(dǎo)致炎性反應(yīng)。

5.線粒體自噬抑制NLRP3炎性復(fù)合體的活化：細(xì)胞自噬是細(xì)胞通過溶酶體降解變性的蛋白質(zhì)和功能失調(diào)的細(xì)胞器的過程，在細(xì)胞保持動態(tài)平衡過程中起關(guān)鍵作用。目前，將通過細(xì)胞自噬降解線粒體的途徑稱為線粒體自噬，主要是指在ROS增多、營養(yǎng)缺乏和細(xì)胞衰老等刺激下，線粒體發(fā)生去極化損傷，損傷的線粒體被特異性包裹入自噬體，并與溶酶體融合，從而降解損傷的線粒體。線粒體自噬可防止NLRP3炎性復(fù)合體過度活化造成的炎性反應(yīng)。在沒有炎性復(fù)合體激活物的情況下，1-磷脂酰肌醇3-激酶(1-phosphoinosmde-3-kinase/protein kinase B/the mammalian target of rapamycin，PI3K)抑制劑6-氨基-3-甲基嘌呤(3-methyladenine，3-MA)能夠抑制自噬，并引起mtROS增加，造成NLRP3依賴的IL-1β分泌的增多[15]。在結(jié)核桿菌感染的細(xì)胞中，3-MA同樣可以可抑制自噬體形成，從而促進(jìn)IL-1β分泌。與此一致，自噬蛋白微管相關(guān)蛋白1輕鏈-3(autophagy protein microtubule-associated protein 1 light chain-3，LC3)基因敲除小鼠骨髓來源的巨噬細(xì)胞中，線粒體損傷增加以及mtROS水平升高，caspase-1活性增強(qiáng)。這一現(xiàn)象也出現(xiàn)在膜突蛋白樣Bcl-2作用蛋白1(moesin-like BCL2-interacting protein，Beclin1)基因敲除的小鼠。而且，自噬相關(guān)基因16L1(autophagy gene 16L1，Atg16L1)敲除后，小鼠NLRP3炎性復(fù)合體活化增多，對葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的結(jié)腸炎更為敏感[15]。此外，sestrin(SESN2)是一種應(yīng)激誘導(dǎo)蛋白，可通過誘導(dǎo)自噬清除損傷的線粒體，進(jìn)而抑制NLRP3炎性復(fù)合體的活化[16]。作為炎癥的主要激活因子，NF-κB也能夠促進(jìn)自噬受體蛋白p62/SQSTM1積累，介導(dǎo)線粒體自噬，促進(jìn)線粒體清除，抑制NLRP3炎性復(fù)合體活化[17]。這些研究表明線粒體自噬可以抑制NLRP3炎性復(fù)合體的活化。

6.其他：腺嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)體1(adenine nucleotide translocator 1，ANT1)是線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運(yùn)的中心分子。在NLRP3炎性復(fù)合體刺激物的作用下，Src同源-2結(jié)構(gòu)域蛋白酪氨酸磷酸酶(Src homology 2 domain-containing protein tyrosine phosphatase 2, SHP2)轉(zhuǎn)位到線粒體，與ANT1結(jié)合并使得ANT1去磷酸化。這一機(jī)制能夠阻止線粒體膜電位的降低，并抑制mtDNA和mtROS的釋放，因此可以阻止NLRP3炎性復(fù)合體的過度活化[18]。雙磷脂酰甘油是線粒體內(nèi)膜上的一種特異性磷脂，在線粒體功能發(fā)生障礙時(shí)，雙磷脂酰甘油可作為一種PAMP被NLRP3識別，進(jìn)而激活NLRP3炎性復(fù)合體。而且，通過siRNA抑制雙磷脂酰甘油合酶后，caspase-1的激活受到明顯抑制，這表明雙磷脂酰甘油可促進(jìn)NLRP3炎性復(fù)合體活化，但具體機(jī)制尚未完全闡明[7]。

三、中藥活性成分的干預(yù)作用

圖2 線粒體調(diào)控NLRP3炎性復(fù)合體活化示意圖MAVs. 線粒體相關(guān)適配蛋白；Drp1. 線粒體動員相關(guān)蛋白1； Mfn2. 線粒體融合蛋白2；ANT1. 腺嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)體1；mtDNA. 線粒體DNA；mtROS.線粒體ROS；pro-IL-1β.白細(xì)胞介素1β前體；pro-IL-18.白細(xì)胞介素IL-18前體；IL-1β. 白細(xì)胞介素1β； IL-18. 白細(xì)胞介素IL-18

許多中藥活性成分能夠通過調(diào)節(jié)線粒體功能抑制多種細(xì)胞模型中NLRP3炎性復(fù)合體的活化。這些中藥活性成分能夠抑制ROS過度產(chǎn)生，減輕線粒體損傷，激活自噬，進(jìn)而抑制NLRP3炎性復(fù)合體，減少IL-1β和caspase-1的釋放，減輕病理?xiàng)l件下的炎性反應(yīng)，發(fā)揮對細(xì)胞的保護(hù)作用[17-33]。目前的研究大多限于對藥效的評價(jià)，而對具體的調(diào)控機(jī)制研究不夠深入。能夠通過線粒體調(diào)控NLRP3炎性復(fù)合體的活化的中藥活性成分詳見表1，其中以黃酮類最多。黃酮類化合物具有良好的抗氧化活性，這可能是其發(fā)揮作用的基礎(chǔ)之一。從這些成分所屬的中藥分析，清熱藥最多，其次是補(bǔ)虛藥?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，清熱藥具有抗感染、抗炎和影響機(jī)體免疫功能的作用，補(bǔ)虛藥也具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能、增強(qiáng)內(nèi)分泌功能和抗衰老等活性作用。這兩類藥可能存在更多抑制NLRP3炎性復(fù)合體活化的成分，值得深入挖掘。

四、展 望

作為天然免疫的重要成員之一，NLRP3炎性復(fù)合體活化對于保護(hù)細(xì)胞免受病原體損傷十分重要，但其過度活化可能會引發(fā)炎性反應(yīng)，造成組織損傷和器官衰竭。通過影響NLRP3及其配體的線粒體定位，以及線粒體自噬、分裂和融合及通透性等多個(gè)環(huán)節(jié)，線粒體在NLRP3炎性復(fù)合體的組裝和活化中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在不同的病理?xiàng)l件及活化刺激條件下，線粒體對NLRP3炎性復(fù)合體活化的調(diào)節(jié)作用也有差異。線粒體損傷并釋放損傷信號以及線粒體調(diào)節(jié)自身穩(wěn)態(tài)的過程，貫穿于線粒體對NLRP3炎性復(fù)合體的調(diào)控之中。線粒體的膜蛋白能夠與NLRP3結(jié)合，在NLRP3炎性復(fù)合體組裝階段起重要作用；同時(shí)這些蛋白也可以影響線粒體分裂和融合，從而調(diào)節(jié)NLRP3炎性復(fù)合體的活化。線粒體自噬可抑制NLRP3過度活化造成的損傷，對機(jī)體起到保護(hù)作用。

表1 能夠通過調(diào)節(jié)線粒體功能抑制NLRP3炎性復(fù)合體活化的中藥活性成分及作用機(jī)制

綜上所述，線粒體結(jié)構(gòu)及功能的正常對于抑制NLRP3炎性復(fù)合體過度活化十分關(guān)鍵，維持線粒體穩(wěn)態(tài)可能是調(diào)節(jié)NLRP3炎性復(fù)合體上游信號的重要策略。深入研究NLRP3炎性復(fù)合體的線粒體調(diào)控機(jī)制，有助于更好地認(rèn)識天然免疫和炎性疾病的生理病理過程，能夠?yàn)榕R床治療提供新靶點(diǎn)。中藥有效成分在抑制NLRP3炎性復(fù)合體活化方面的研究取得了一定進(jìn)展，今后尋找更多能調(diào)節(jié)NLRP3炎性復(fù)合體的中藥有效成分并進(jìn)一步研究其作用機(jī)制，有望發(fā)現(xiàn)理想的NLRP3炎性復(fù)合體抑制劑。